本发明涉及阿维菌素发酵生产技术领域，尤其涉及一种阿维菌素的生产工艺。
背景技术：
阿维菌素avermectins是具有杀虫、杀螨、杀线虫活性的一簇结构相似的十六元大环内酯类抗生素，由链霉菌中灰色链霉菌streptomycesavermitilis发酵产生。天然阿维菌素含有结构相近的8个同系物组分，主要4种有a1a、a2a、b1a和b2a，其总含量≥80％；对应的4个比例较小的同系物是a1b、a2b、b1b和b2b，其总含量≤20％。阿维菌素广泛应用于农业，是一种常见的农药制剂，作为杀虫剂，用于防治十字花科小菜蛾、棉铃虫、螨类、菜青虫等。
目前发酵生产阿维菌素使用的基础培养基是以高浓度淀粉为碳源，发酵后期会补充低浓度淀粉、或淀粉与葡萄糖的混合物。在发酵过程中，淀粉在微生物分泌的淀粉酶、糖化酶等生物酶的作用下逐步缓慢转化为葡萄糖，这样培养基中的葡萄糖会一直维持在较低的浓度范围，因而不易产生反馈抑制作用。但由于淀粉料液粘稠，会造成培养基溶氧效果较差，一般在生产放罐单位平均水平6g/l的要求下，放罐系数普遍低于75％；而且淀粉只有先转化为葡萄糖才能够被微生物利用，而发酵过程中会产生其它糖类，这样不仅使淀粉利用率低，发酵结束后的提取过程中还需要加入甲苯来除去因淀粉代谢产生的各种糖类物质，使发酵产生的废水cod很高，给环保造成压力。
技术实现要素：
为解决现有技术存在的不足，本发明提供了一种阿维菌素的生产工艺，该工艺以葡萄糖作为种子培养基的碳源，以葡萄糖和山梨醇的混合物作为发酵培养基的碳源，取代了传统碳源淀粉的使用，不仅解决了以淀粉为碳源对发酵生产造成的弊端，提高了阿维菌素的发酵单位，还能够降低生产过程的动力成本，并省去发酵后提取阶段用甲苯去除残留多糖类物质的步骤，降低发酵废水对环保的压力。
为实现上述目的，本发明提供的阿维菌素的生产工艺，包括摇瓶种子培养、种子罐培养、和发酵罐培养步骤，所述摇瓶种子培养与种子罐培养步骤中均使用种子培养基，所述种子培养基的碳源为葡萄糖；所述发酵罐培养步骤中使用发酵培养基，所述发酵培养基的碳源为葡萄糖和山梨醇；所述发酵罐培养步骤中以流加的方式补充碳源，所述碳源为葡萄糖和山梨醇。
本发明的阿维菌素生产工艺，在摇瓶种子培养与种子罐培养阶段均以葡萄糖替代淀粉作为种子培养基的碳源，在发酵培养阶段以葡萄糖和山梨醇的混合物替代淀粉作为发酵培养基的碳源，可以有效改善发酵过程中的溶氧，降低生产的动力成本。因淀粉料液粘稠，发酵过程溶氧较差，为保证溶氧，必须加大通风量和提高搅拌速度，从而显著增加动力成本；而以葡萄糖和山梨醇作为培养基的碳源，料液较稀，不需要很大的风量和搅拌速度即可保证溶氧，节约了动力成本。发酵培养基的碳源选取葡萄糖和山梨醇的混合物，并在发酵过程以流加的方式不断补充该碳源，不仅避免了因加入过多葡萄糖对微生物代谢产生的反馈抑制，还可在整个发酵过程为阿维菌素的代谢提供足够的碳源，以保证放罐时发酵单位的提高。另外，本工艺发酵结束时滤液中不会残留过多糖类物质，还减少了发酵后提取阶段使用甲苯去除残留多糖类物质的除糖步骤，并且使发酵产生的废水cod明显下降。因此，本发明的阿维菌素生产工艺，简单易行，较传统以淀粉为碳源的阿维菌素生产，综合生产成本可以降低20％左右，发酵放罐废水的cod可以降低50％左右，具有显著的生产优势。
作为对上述技术方案的限定，所述种子培养基包括以下重量百分比组分：葡萄糖1.5～2％，玉米浆0.3～0.8％，酵母膏0.3～0.5％，碳酸钙0.1～0.2％，余为自来水，调ph7.0～7.2。
作为对上述技术方案的限定，所述发酵培养基包括以下重量百分比组分：葡萄糖0.8-1.2％，山梨醇0.5～1.0％，豆饼粉2.0～2.5％，酵母粉0.8～1.2％，硫酸铵0.025％，碳酸钙0.12％，植物油0.05％，消泡剂0.05％，余为自来水，调ph7.0～7.2。
作为对上述技术方案的限定，所述阿维菌素的生产工艺包括以下步骤：
a、摇瓶种子培养：种子培养基灭菌冷却后，接种阿维菌素的孢子液，28±1℃条件下摇瓶生长24～28小时，得到摇瓶种子液；
b、种子罐培养：将步骤a的摇瓶种子液以种子罐中种子培养基体积0.1％的量接种到种子罐，28±1℃条件下培养生长时间24～28小时，得到种子液；
c、发酵罐培养：将步骤b的种子液以发酵罐中发酵培养基体积5～10％的量转移到发酵罐，28±1℃条件下培养，过程中根据发酵培养基中还原糖的残留量控制碳源的流加，培养280～320小时完成发酵。
作为对上述技术方案的限定，步骤c中所述发酵培养基中还原糖残留量控制在：于发酵40小时之前还原糖质量浓度在0.5～0.8％，于发酵40小时之后还原糖质量浓度在0.2～0.5％。
作为对上述技术方案的限定，流加的碳源以流加液的形式补充，所述流加液中葡萄糖浓度为40～60％，山梨醇浓度为5％～10％，使用自来水配制。
进一步限定种子培养基、发酵培养基的组成，以及生产工艺的具体操作步骤及操作条件，使阿维菌素的生产更顺利，更利于放罐时发酵单位的提高，促进生产。
综上所述，采用本发明的技术方案，获得的阿维菌素生产工艺，在摇瓶种子培养与种子罐培养阶段均以葡萄糖替代淀粉作为种子培养基的碳源，在发酵培养阶段以葡萄糖和山梨醇的混合物替代淀粉作为发酵培养基的碳源，并在发酵过程以流加的方式不断补充该碳源，可以有效改善发酵过程中的溶氧，降低生产的动力成本，而且避免因加入过多葡萄糖对微生物代谢产生的反馈抑制，同时提供微生物生长代谢时所需要的能量，保证放罐时发酵单位的提高。另外，本工艺发酵结束时滤液中不会残留过多糖类物质，还减少了发酵后提取阶段的除糖步骤，并使发酵产生的废水cod明显下降。较传统以淀粉为碳源的阿维菌素生产，本发明的生产工艺，综合生产成本可以降低20％左右，发酵放罐废水的cod可以降低50％左右，且工艺步骤简单易行，具有显著的生产优势。
具体实施方式
下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
本实施例涉及一种阿维菌素的生产工艺。
实施例1.1
阿维菌素的生产，包括以下步骤：
a、摇瓶种子培养：按重量百分比计以葡萄糖1.5％，玉米浆0.3％，酵母膏0.5％，碳酸钙0.1％，余为自来水，并调ph7.0配置种子培养基，经灭菌冷却后，在无菌条件下将长好的阿维链霉菌孢子接种在种子培养基中，28±1℃条件下摇瓶培养生长24小时，得到摇瓶种子液；
b、种子罐培养：将步骤a的摇瓶种子液接种到种子罐，按重量百分比计以葡萄糖2％，玉米浆0.8％，酵母膏0.3％，碳酸钙0.2％，余为自来水，并调ph7.2配置种子罐内的种子培养基，接种量为种子培养基体积的0.1％，在28±1℃条件下培养生长24～28小时，得到种子液；
c、发酵罐培养：将步骤b的种子液转移到发酵罐，按重量百分比计以葡萄糖1％，山梨醇0.6％，豆饼粉2.5％，酵母粉0.8％，硫酸铵0.025％，碳酸钙0.12％，植物油0.05％，消泡剂0.05％，余为自来水，并调ph7.0配置发酵罐内的发酵培养基，转移量为发酵培养基体积的5％，28±1℃条件下培养；
过程中根据发酵培养基中还原糖的残留量控制碳源的流加，当发酵24h时，取样检测发酵液中残糖量为0.7％，此时开始流加质量浓度为40％葡萄糖和10％山梨醇的混合溶液即流加液；每隔8h取样检测一次，当发酵到40h之后，根据测得的残糖量，调整流加速度，使得发酵液中还原糖量控制在0.2～0.5％；
发酵300小时放罐，放罐体积为计料体积(即发酵培养基体积)的1.2倍，发酵单位为6815ug/ml。
实施例1.2
阿维菌素的生产，包括以下步骤：
a、摇瓶种子培养：按重量百分比计以葡萄糖2％，玉米浆0.5％，酵母膏0.5％，碳酸钙0.1％，余为自来水，并调ph7.0配置种子培养基，经灭菌冷却后，在无菌条件下将长好的阿维链霉菌孢子接种在种子培养基中，28±1℃条件下摇瓶培养生长28小时，得到摇瓶种子液；
b、种子罐培养：将步骤a的摇瓶种子液接种到种子罐，按重量百分比计以葡萄糖2％，玉米浆0.5％，酵母膏0.5％，碳酸钙0.2％，余为自来水，并调ph7.2配置种子罐内的种子培养基，接种量为种子培养基体积的0.1％，在28±1℃条件下培养生长24～28小时，得到种子液；
c、发酵罐培养：将步骤b的种子液转移到发酵罐，按重量百分比计以葡萄糖1.2％，山梨醇0.8％，豆饼粉2.0％，酵母粉1.0％，硫酸铵0.025％，碳酸钙0.12％，植物油0.05％，消泡剂0.05％，余为自来水，并调ph7.1配置发酵罐内的发酵培养基，转移量为发酵培养基体积的10％，28±1℃条件下培养；
过程中根据发酵培养基中还原糖的残留量控制碳源的流加，当发酵24h时，取样检测发酵液中残糖量为0.5％，此时开始流加质量浓度为50％葡萄糖和5％山梨醇的混合溶液即流加液；每隔8h取样检测一次，当发酵到40h之后，根据测得的残糖量，调整流加速度，使得发酵液中还原糖量控制在0.2～0.5％；
发酵290小时放罐，放罐体积为计料体积(即发酵培养基体积)的1.2倍，发酵单位为6528ug/ml。
对比例
对比例1
本对比例涉及传统使用淀粉为碳源的发酵生产工艺，种子培养基中碳源为淀粉，氮源为棉籽饼粉、酵母粉或酵母膏，再加上硫酸镁等无机盐；发酵培养基中的碳源为高浓度淀粉，氮源为豆饼粉，棉籽饼粉，酵母粉等，再加上几种无机盐。种子液长好后移种到消毒好的发酵培养基中，中间过程中通过调高通气量和提高搅拌速度来控制溶氧。发酵放罐时培养基中残余的总糖约在2.0％左右。放罐体积约为计料体积的80％，放罐效价6500ug/ml左右。
对比例2
本对比例涉及传统使用淀粉为基础碳源，以淀粉与葡萄糖混合液为补充碳源的发酵生产工艺，种子培养基中碳源为淀粉，氮源为棉籽饼粉、酵母粉或酵母膏，再加上硫酸镁等无机盐；发酵培养基中的碳源为高浓度淀粉，氮源为豆饼粉，棉籽饼粉，酵母粉等，再加上几种无机盐。种子液长好后移种到消毒好的发酵培养基中，中间过程中通过调高通气量和提高搅拌速度来控制溶氧。发酵后期会通过补稀淀粉和稀葡萄糖溶液来弥补蒸发的水分。这样在放罐时培养基中残余的总糖依然较高，一般在3.0％左右。发酵放罐时的料液体积约为计料体积的90％，放罐效价6000ug/ml左右。
实施例二
本实施例涉及实施例一与对比例的阿维菌素发酵生产结果比较。
由上表结果可见，本发明阿维菌素的生产工艺，具有单罐产量高、放罐废水cod低、动力成本高等优势。
综上所述，本发明阿维菌素的生产工艺，可以有效改善发酵过程中的溶氧，降低生产的动力成本；并避免因加入过多葡萄糖对微生物代谢产生的反馈抑制，同时提供微生物生长代谢时所需要的能量，保证放罐时发酵单位的提高；还可使发酵结束时滤液中不会残留过多糖类物质，减少了发酵后提取阶段的除糖步骤，并使发酵产生的废水cod明显下降。较传统以淀粉为碳源的阿维菌素生产，本发明的生产工艺，综合生产成本可以降低20％左右，发酵放罐废水的cod可以降低50％左右，且工艺步骤简单易行，具有显著的生产优势。