专利名称：金银花菌深层发酵生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物工程技术领域，涉及一种金银花菌(学名茶薦子叶状层菌 Phylloporia ribis (Schumach. :Fr.) Ryvarden)的深层发酵生产工艺，属传统中药和现代生物技术有机结合的产物。
背景技术：
金银花菌(茶薦子叶状层菌Phylloporia ribis (Schumach. Fr) Ryvarden)是山东著名道地药材金银花植株上的一种药用真菌，在当地民间具有悠久的药用历史，2002年载入《山东省中药材标准》。该菌子实体用于治疗咽炎、喉炎、扁桃体炎等口腔炎症，临床疗效显著。药理实验研究证明，该菌具有抗炎、抗病毒、抗癌、促进肌体免疫等生物活性，是一种珍贵的、可以代替金银花消炎作用的真菌药物资源。为深入开发利用这一资源，我们对其进行了菌种分离纯化，得到了该菌的纯菌种，并通过液体深层发酵的生物技术，达到大规模人工生产金银花菌的目的。目前，我国金银花年产量仅800万公斤，而国内外市场需求量为2000万公斤以上， 每年供需缺口达1200万公斤。本发明生产的金银花菌丝，在一定程度上可以代替金银花作为清热解毒药使用，以缓解金银花菌供需矛盾紧张的局面。此外本发明生产的金银花菌丝营养成分丰富，经检测氨基酸含量达40%以上，也可以作为一种氨基酸营养补充剂。
发明内容
本发明所用金银花菌的原菌种经鉴定，属于真菌界、担子菌门、无隔担子菌纲、非褶菌目、锈革孔菌科真菌。子实体形状不规则，呈扁平状、拳形、半圆形或云片状。菌盖表面粗糙，硬而韧，覆瓦状排列，赤酱色至浅栗色，无光泽，有同心环状棱纹及细微绒毛， 1. 5-4X3-7cm，边缘薄或稍钝，深肉桂色。无菌柄，子实体背面黄褐色，肉眼可见布满细小的管口，管口浅肝褐色至暗褐色，有时可见成簇的新生子实体。断面可见菌肉呈纤维质，棕黄色，菌管长l_2mm。孢子呈淡黄色，球形或阔卵形，直径3 μ m。我们选用PDA培养基，对该菌进行了菌种分离纯化，得到了该菌的纯菌种，并通过液体培养实验，初步确定了菌丝体的发酵培养基配方为麦芽汁(IOBx) 10%，蛋白胨0.3%， 葡萄糖1 %，蔗糖1 %，玉米浆0. 5 %，PH5. 5-6. 0。采用以上培养基，27°C培养96小时摇瓶培养菌丝体收率达到最高，可以达到1.5%。确立了中试发酵生产工艺流程试管斜面菌种——500ml三角瓶液体种子(装量200ml)——5L血清瓶种子(装量3L)——1吨发酵罐 (装量500L)——菌丝过滤一一气流沸腾干燥——成品。中试发酵培养基和大生产培养基为麦芽汁(IOBx) 15%，蔗糖1%，葡萄糖1%，蛋白胨0.3%，玉米浆0.5%，PH5. 0-6.0，培养条件为装量50 %，接种量6-10 % ’温度27 士 1 °C，搅拌转速160rpm，通气量6立方米/小时，36 72小时菌丝体得率就达到最高，可以达到1. 6%。为了对发酵菌丝进行质量评价，我们通过高效液相法测定了金银花菌发酵菌丝的脂溶性成分麦角留醇含量做了测定并与原子实体中麦角留醇含量做了对比，结果证明以Agilent 1100LC 高效液相色谱仪，hrbax eclipse XDB C8, (150mmX4. 6mm)色谱柱，甲醇为流动相，检测波长为^2nm，流速1. Oml/min。标准曲线在0. 1 0. 5mg/ml线性良好，最低限量为0. lmg/ml, RSD = 2. 88%，金银花菌发酵菌丝中的麦角甾醇含量是原子实体麦角甾醇含量的10倍。该菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存(北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所；邮编100080)；分类命名茶薦子叶状层菌(新分类学名)环棱褐孔菌为曾用名Xanthochrous nilgheriensis (Phylloporia ribis (Schumach. :Fr)Ryvarden)
保藏编号CGMCCNo. 1195，保藏日期2004年7月22日。
附图为金银花菌发酵生产主要工艺流程。
具体实施例方式金银花菌的液体深层发酵工艺流程1、在PDA培养基上的培养情况将分离到的纯菌种调取少许，转移到PDA培养基上，30°C培养3天，菌落圆形，边缘整齐，平铺，中间部分隆起，白色，絮状，致密，背面黄色， 具放射状沟纹，直径2. 7-3. 2cm。显微镜下观察菌丝无色，细长，具横隔，纵横交错，多分枝， 直径2-2. 5 μ m ；菌丝细胞的细胞壁薄而透明，菌丝生长初期可见锁状联合，生长后期分枝较多时，锁状联合不明显。2、液体培养将马铃薯去除芽眼与外皮，切成Icm见方的小块，称取600克，加水 3000ml，用铝锅在电炉上加热，待其沸腾后，保持30分钟，然后用四层纱布过滤，滤液备用。 另外称取葡萄糖60克、磷酸二氢钾6克、硫酸镁1. 5克、尿素1. 2克，加适量水溶解后，与上述马铃薯水煎液混合，最后定容至3000ml。取300ml三角瓶，洗净烘干放冷后，每瓶加入上述培养液150ml，注意不要使液体粘附到瓶壁上，上盖棉塞，最后用牛皮纸、橡皮筋封口。在接种菌种之前，将包装好的三角瓶整体置于紫外灯下消毒40分钟。3、菌丝的接种与培养取小三角瓶中固体培养生长情况较好的金银花菌菌丝进行接种，注意剔除底部含有琼脂的固体培养基，菌丝团的直径大约为1 2mm，尽量使所取菌丝团的大小保持一致，每瓶取5个菌丝团。如前重新封品后，置于恒温振荡器上进行培养， 保持温度27°C，振幅为2cm，振荡速率为lOOrpm。4、菌丝体培养条件优化摇瓶培养的温度和培养时间的确定，采用500ml三角瓶， 装量200ml，摇瓶转速150rpm，在30°C温度条件下，发酵后测定菌丝体干重的收率。结果表明菌丝体的适宜培养温度为27°C，在27°C条件下摇瓶培养的时间为96小时。5、发酵生产菌丝体的发酵培养基配方为麦芽汁(10BX)10%，蛋白胨0.3%，葡萄糖1 %，蔗糖1 %，玉米浆0. 5%，PH5. 5-6. O。采用以上培养基，27°C培养96小时摇瓶培养菌丝体收率达到最高，可以达到1. 5%。确立了中试发酵生产和工艺流程试管斜面菌种—— 500ml三角瓶液体种子(装量200ml)——5L血清瓶种子(每个装量3L)——500L发酵罐 (装量300L)——5吨发酵罐。培养基为麦芽汁(IOBx) 15 %，蔗糖1 %，葡萄糖1 %，蛋白胨0.3%，玉米浆0.5%，PH5. 0-6.0，培养条件为装量60%，接种量10% ；温度27°C，搅拌转速160rpm，通气量6立方米/小时，36小时菌丝体得率就达到最高，可以达到1. 6%。6、将发酵罐的发酵液与菌丝转入板框压滤机压滤，压滤后冷冻干燥，粉碎，装袋， Co辐照灭杂菌，外包装。参考文献[1]. Lee IK, Lee JH, Yun BS.Polychlorinated compounds with PPAR-gamma agonistic effect from the medicinal fungus Phellinus ribis[J]. Bioorg Med Chem Lett.2008Aug 15 ；18(16) :4566[2]. Moon DC,Hwang KH,Choi KR,et al. Constituents of ceramide of a naive mushroom,Phellinus ribis in Korea[J]. Analytical Science and Technology,1994,7 547 554[3]. Moon DC. Some preoxysterols and ceramides from "Phellinus ribis", a Korean wild mushroom[J]. Analysis Science Technol. , 1995 ；8(4) :901-906[4],刘玉红，徐凌川，王建平.茶薦子叶孔菌强酸性化学成分的研究《时珍国医国药》2006，17(9)[5],刘玉红，徐凌川，王建平.褐孔菌属药用真菌化学成分与药理作用研究纂要 《中医药学刊》2003，21 (12)[6],刘玉红，徐凌川，王建平.茶薦子叶孔菌化学成分的研究《中药材》2005， 28(11)
权利要求
1.一种用发酵法生产金银花菌丝的工艺技术。其特征在于发酵培养基配方为麦芽汁 (IOBx) 10%，蛋白胨 0. 3%，葡萄糖 1%，蔗糖 1%，玉米浆 0.5%，PH5. 5-6. 0。27°C 培养 96 小时摇瓶培养菌丝体收率达到最高，可以达到1. 5%。生产工艺流程试管斜面菌种——三角瓶液体种子——血清瓶种子——种子罐——生产罐——菌丝过滤——气流沸腾干燥(或冷冻干燥)——成品。
2.—种权利要求1所述的金银花菌经鉴定为茶薦子叶状层菌Wiylloporia ribis(Schumach. :Fr.)Ryvarden，其特征在于该菌是从金银花植株分离纯化得到的菌种，固体培养基上生长的菌丝颜色洁白而浓密，液体发酵所得菌丝干燥粉碎后为乳白色或灰白色粉末。
3.—种权利要求1所述的发酵菌丝粉作为氨基酸营养补充剂或作为消炎、抗病毒、抗肿瘤的单方或复配方及提取物，用以治疗咽炎、咽喉炎、上呼吸道感染、多种肿瘤而制成的片剂、口含片、胶囊剂、颗粒剂、口服液、注射剂等各种剂型。
全文摘要
本发明名称“金银花菌深层发酵生产工艺”，属微生物工程技术领域。本发明公开了一种金银花菌的大规模人工发酵生产技术。其特征是用金银花菌的纯菌种，经过PDA培养基培养，转为液体培养基培养，再经过种子罐培养放大，按照10％接种量转入生产罐，经过36～72小时达到发酵生产最大量。该发酵菌丝含有40％以上的氨基酸，可以作为营养补充剂使用。另外，它具有类似金银花的消炎作用，能治疗咽炎及上呼吸道感染等症，可以单用或与其他中药复配使用。
文档编号A61K36/06GK102191183SQ201010579919
公开日2011年9月21日 申请日期2010年12月9日 优先权日2010年12月9日
发明者廉士文, 张永清, 张良宏, 徐凌川, 殷法杰, 田景振, 秦国培 申请人:廉士文, 张良宏, 徐凌川