金银花菌深层发酵营养液生产工艺的制作方法
【专利摘要】金银花菌深层发酵营养液生产工艺属微生物工程【技术领域】。本发明公开了一种金银花菌的大规模人工发酵营养液生产技术。其特征是用金银花菌的纯菌种，经过PDA培养基培养，转为液体培养基培养，在经过种子罐培养放大，按照10％接种量转入生产罐，经过36～72小时达到发酵营养液生产成分最大量。该发酵营养液富含真菌多糖、氨基酸和多种微量元素，可以作为营养补充剂使用。另外，它具有类似金银花的消炎作用，能治疗咽炎及上呼吸道感染等症，能清肺养肺及调节胃肠道功能，可以单用或与其他中药复配使用，以此造福人类。
【专利说明】金银花菌深层发酵营养液生产工艺
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物工程【技术领域】，涉及一种金银花菌(学名:茶薦子叶状层菌Phylloporia ribis (Schumach.:Fr.) Ryvarden)的深层发酵营养液生产工艺，属于传统中药和现代生物技术有机结合的产物。
【背景技术】
[0002]金银花菌(茶薦子叶状层菌Phylloporiaribis (Schumach.:Fr.) Ryvarden)是山东著名道地药材金银花植株上的一种药用真菌，在当地民间具有悠久的药用历史，2002年载入《山东省中药材标准》。该菌实体用于治疗咽炎、喉炎、扁桃体炎等口腔炎症，临床疗效显著。药理实验研究证明，该菌具有抗炎、抗病毒、抗癌、促进肌体免疫等生物活性，是一种珍贵的、可以替代金银花消炎作用的真菌药物资源。为深入开发利用这一资源，我们对其进行了菌种分离纯化，得到了该菌的纯菌种，并通过液体深层发酵的生物技术，达到大规模人工生产金银花菌发酵营养液的目的。
[0003]目前，我国金银花年产量仅800万公斤，而国内外市场需求量为2000万公斤以上，每年供需缺口达1200万公斤。本发明生产的金银花菌发酵营养液，在一定程度上可以替代金银花作为快速清热解毒药使用，以缓解金银花供需矛盾紧张的局面。此外本发明生产的金银花菌发酵营养液成分丰富，经检测富含真菌多糖、氨基酸和多种微量元素，可以作为一种营养补充剂。
【发明内容】
[0004]本发明所用金银花菌的原菌种经鉴定，属真菌界、担子菌门、无隔担子菌纲、非褶菌目、绣革孔菌科真菌。子实体形状不规则，呈扁平状、拳形、半圆形或云片状。菌盖表面粗糙，硬而韧，覆瓦状排列，赤酱色至浅栗色，无光泽，有同心环状棱纹及细微绒毛，
1.5-4X3-7CH1，边缘薄或稍钝，深肉桂色。无菌柄，子实体背面黄褐色，肉眼可见布满细小的管口，管口浅肝褐色至暗褐色，有时可见成簇的新生子实体。断面可见菌肉呈纤维质，棕黄色，菌管长l_2mm。孢子呈淡黄色，球形或阔卵形，直径3 μ m。
[0005]我们选择用PDA培养基，对该菌进行了菌种分离纯化，得到了该菌的纯菌种，并通过液体培养实验，初步确定了菌丝体的发酵培养基配方为麦芽汁(1Bx) 10%，蛋白胨
0.3%，葡萄糖1%，蔗糖1%，玉米浆0.5%，PH5.5-6.0。采用以上培养基，27°C培养96小时摇瓶培养菌丝体收率达到较高，可以达到1.5%，而此时发酵营养液收得率> 85%。确立了中试发酵生产工艺流程；试管斜面菌种——500ml三角瓶液体种子(装量200ml)——5L血清瓶种子(装量3L) — I吨发酵罐(装500L)—板框压滤一液体收集一灌装灭菌一包装入库。中试发酵培养基和大生产培养基为；麦芽汁(1Bx) 15%，蔗糖1%，葡萄糖1%，蛋白胨0.3%，玉米浆0.5%,PH5.5-6.0，培养条件为:装量50%，接种量6-10%;温度27土1°C，搅拌转速160rpm，通气量6立方米/小时，36~72小时菌丝体得率就达到最高，可达到1.6%，而此时发酵营养液收得率≥95%。
[0006]为了对发酵营养液进行测评，首先对发酵菌丝进行质量评价，我们通过高效液相法测定了金银花菌发酵菌丝的脂溶性成分麦角留醇含量做了测定并与原子实体中麦角甾醇含量做对比，结果证明以AgilentllOOLC高效液相色谱仪，Zorbax eclipse XDB C8，(150mmX4.6mm)色谱柱，甲醇为流动相，检测波长为282nm,流速1.0ml/min。标准曲线在
0.1~0.5mg/ml线性良好，最低限量为0.lmg/ml,RSD = 2.88%，故金银花菌发酵营养液中富含麦角甾醇。
[0007]该菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存(北京市海淀区中国科学院微生物研究所；邮编100080);分类命名:茶薦子叶状层菌(新分类学名)环棱褐孔菌为曾用名 Xanthochrous nilgheriensis (Phylloporia ribis (Schumach.:Fr.)Ryvarden)
[0008]保藏编号为；CGMCC N0.1195，保藏日期2004年7月22日。
[0009]【专利附图】
【附图说明】:
[0010]附图为金银花菌发酵营养液生产主要工艺流程。
[0011]【具体实施方式】:
[0012]金银花菌的液体深层发酵营养液工艺流程
[0013]1、在PDA培养基上的培养情况:将分离到的纯菌种调取少许，转移到PDA培养基上，30°C培养三天，菌落圆形，边缘整齐，平铺，中间部分隆起，白色，絮状，致密，背面黄色，具放射状沟纹，直径2.7-3.2cm。显微镜下观察菌丝无色，细长，具横隔，纵横交错，多分枝，直径2-2.5 μ m ;菌丝细胞的细胞壁薄而透明，菌丝生长初期可见锁状联合，生长后期分枝较多时，锁状联合不明显。
[0014]2、液体培养:将马铃薯去除芽眼与外皮，切成Icm见方的小块，称取600克，加水3000ml，用铝锅在电炉上加热，待其沸腾后，保持30分钟，然后用四层纱布过滤，滤液备用。另外称取葡萄糖60克、磷酸二氢钾6克、硫酸镁1.5克、尿素1.2克,加适量水溶解后,与上述马铃薯水煎液混合，最后定容至3000ml。
[0015]取3000ml三角瓶，洗净烘干放冷后，每瓶加入上述培养液150ml，注意不要使液体粘附到瓶壁上，上盖绵塞，最后用牛皮纸、橡皮筋封口。在接种菌种之前，将包装好的三角瓶整体置于紫外灯下消毒40分钟。
[0016]3、菌丝的接种与培养:取小三角瓶中固体培养生长情况较好的金银花菌菌丝进行接种，注意剔除底部含有琼脂的固体培养基，菌丝团的直径大约为I~2mm，尽量使所取菌丝团的大小保持一致，每瓶取5个菌丝团。如前重新封品后，置于恒温振荡器上进行培养，保持温度27°C，振幅为2cm，震荡速率为lOOrpm。
[0017]4、菌丝体培养条件优化；摇瓶培养的温度和培养时间的确定，采用500ml三角瓶，装量200ml，摇瓶转速150rpm，在30°C温度条件下，发酵后测定菌丝体干重的收率。由此表明菌丝体的适宜培养温度为27°C，在27°C条件下摇瓶培养的时间为96小时。
[0018]5、发酵生产: 菌丝体的发酵培养基配方为麦芽汁(1Bx) 10%，蛋白胨0.3%，葡萄H 1%,鹿糖 I %，玉米衆 0.5%, PH5.5-6.0。
采用以上培养基，27°C培养96小时摇瓶培养菌丝体收率达到较高，可以达到1.5%，而此时发酵营养液收得率> 85%。确立了中试发酵生产和工艺流程:试管斜面菌种一500ml三角瓶液体种子(装量200ml)——5L血清瓶种子(每个装量3L)——500L发酵罐(装量300L)——5吨发酵罐。培养基为:麦芽汁(1Bx) 15%，蔗糖1%，葡萄糖1%，蛋白胨
0.3%，玉米浆0.5%, PH5.0-6.0。培养条件为:装量60%，接种量10% ;温度27°C，搅拌转速160rpm，通气量6立方米/小时，36小时菌丝体得率就达到最高，可达到1.6%，而此时发酵营养液收得率> 95%。
[0019]6、将发酵罐的发酵液与菌丝转入板框压滤机压滤，并对压滤后粉冷冻干燥、装袋，Co辐照灭杂菌备用。与此同时集中收取压滤后的液体，并通过无菌管道处理方式进行灌装，然后再次灭菌，包装入库。
[0020]参考文献
[0021][I].Lee IK, Lee JH, Yun BS.Polychlorinated compounds with PPAR-gammaagonistic effect from the medicinalfungus Phellinus ribis[J].B10rg Med ChemLett.2008Augl5；18(16):4566
[0022][2].Moon DC,Hwang KH,Choi KR,et al.Constituents of ceramide of a nativemushroom, Phellinus ribis inKorea[J].Analytical Science and Technology,1994,7:547 ~554.
[0023][3].Moon DC.Some preoxysterols and ceramides from “Phellinus ribis，，，aKorean wild mushroom[J].AnalysisScience Technol., 1995 ；8 (4):901-906
[0024][4].MizunoT2002 ；Kang & Chen 2005
[0025][5],徐凌川，张良宏，廉士文.《金银花菌深层发酵深层工艺》发明专利，专利号:ZL 2010 10579919.2
[0026][6],刘玉红，徐凌川，王建平.茶薦子叶孔菌强酸性化学成分的研究《时珍国医国药》2006，17(9)
[0027][7],刘玉红，徐凌川，王建平.褐孔菌属药用真菌化学成分与药理作用研究纂要《中医药学刊》2003，21 (12)
[0028][8],刘玉红，徐凌川，王建平.茶薦子叶孔菌化学成分的研究《中药材》2005，28(11)
【权利要求】
1.一种用发酵法生产金银花菌发酵营养液的工艺技术，其特征在于:发酵培养基配方为麦芽汁(1Bx) 10%，蛋白胨0.3%，葡萄糖1%，蔗糖1%，玉米浆0.5%,PH5.5-6.0 ；27°C培养96小时摇瓶培养营养液收得率达到最高，可以达到95% ;生产工艺流程:试管斜面菌种——三角瓶液体种子——血清瓶种子——种子罐——生产罐发酵——板框压滤——灌装灭菌一包装入库； 所述金银花菌为茶薦子叶状层菌Phylloporia ribis (Schumach.:Fr.) Ryvarden,其保藏号为:CGMCC No 1195。
2.—种权利要求1所述的金银花菌经鉴定为茶薦子叶状层菌Phylloporiaribis (Schumach.:Fr.) Ryvarden,其特征在于:该菌是从金银花植株分离纯化得到的菌种，其保藏号为；CGMCC No 1195，固体培养基上生长的菌丝颜色洁白而浓密，生产发酵所得营养液为淡黄色，所得菌丝干燥粉碎后为灰白色粉末。
3.—种权利要求1所述的发酵营养液，富含真菌多糖、留醇、三萜、绿原酸等有机类化学成分，包括活性细胞和活性因子，通过免疫调节实现消炎、抗病毒、降血糖、降血脂治疗作用；通过调动或活化肌体“内源性抗癌物质”抑制肿瘤；作为氨基酸营养补充剂或作为消炎、抗病毒、抗肿瘤的单方或复配方及提取物，用以治疗咽炎、上呼吸道感染、多种肿瘤而制作成的健康饮品、口服液、注射剂等各种剂型。
【文档编号】C12N1/14GK104164368SQ201410378461
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年7月28日 优先权日:2014年7月28日
【发明者】廉士文, 徐凌川 申请人:廉士文