本发明属于基因分子检测领域，具体涉及一种鉴定小麦ms1b隐性不育基因的pcr引物对和引物对组合及其检测方法。
背景技术：
小麦雄性不育基因多数是由自然突变或人工诱导产生的，小麦上发现和诱导的雄性核不育材料较多，这些基因被命名为ms1、ms2、ms3、ms4和ms5，分别定位在4bs、4ds、5as、4ds和3al染色体臂上。其中，ms1和ms5为隐性基因，而ms2、ms3、ms4为显性基因。与本发明相关的ms1基因位点有很多突变体，包括pugsley's突变体(含等位基因ms1a)、probus突变体(含等位基因ms1b)、cornerstone突变体(含等位基因ms1c)、fs3突变体(含等位基因ms1e)、fs24突变体(含等位基因ms1f)、lz突变体(含等位基因ms1g)等等。2006年李中安利用ms1b不育基因建立了《一种以蓝粒为标记性状的两系法杂交小麦的选育方法》(专利号：zl200610042629.8)，现已培育出一大批两用系(不育系)和杂交种在进行试验和示范。为进一步提高两用系(不育系)选育效率，在保持不育基因存在的情况下将其它抗病抗逆、优质、矮杆等优良性状转入两用系(不育系)中，因此迫切需要建立简便可行的鉴定ms1b基因的检测方法，尤其是早期从不带胚的半粒种子上进行检测。
pcr(polymerasechainreaction，聚合酶链式反应)已广泛应用于基因分离、克隆、核酸序列分析、病害分子检测、品种性状的分子标记等研究。目前尚无鉴定ms1b基因的pcr分子检测技术，对该不育基因的识别只有在田间开花时观察植株的育性，根据植株群体的育性个分离情况才能知道是ms1b基因是纯合的还是杂合的或根本没有，需要较大的群体才行，而且极大地受到季节性限制。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种鉴定小麦ms1b隐性不育基因的pcr引物对和引物对组合及其检测方法。
本发明一方面提供了一种鉴定小麦ms1b隐性不育基因的pcr引物对和引物对组合，所述的pcr引物对为p1或者p2；所述的引物对组合为p1与p3组合使用，或者p2与p3组合使用；所述引物对p1、p2、p3的序列为：
p1-f：5'-accctctctagatatatccgt-3'，
p1-r：5'-catattcaagtgtcccgtca-3'，
p2-f：5'-gctatcgtttctgtccgctcgta-3'，
p2-r：5'-ccgcttgacgtgagttccat-3'，
p3-f：5'-tgagcgaacaacctaagacga-3'，
p3-r：5'-ccgtgtcagctcaattaccat-3'。
本发明另一方面提供了一种鉴定小麦ms1b隐性不育基因的pcr检测方法，包括如下步骤：
1)提取待检测的小麦种子或植株的根茎叶总基因组dna作为pcr扩增模板；
2)采用权利要求1所述的引物对或者引物对组合对得到的dna模板进行扩增，根据条带的有无和强弱判断待测对象是否含有ms1b隐性不育基因：当采用引物对p1进行检测时，如果扩增出720bp的条带，条带强时则说明检测对象不含ms1b隐性不育基因，条带弱时说明检测对象含有1个ms1b隐性不育基因；没有条带时则说明检测对象含有1对ms1b隐性不育基因；
当采用引物对p2进行检测时，如果扩增出531bp的条带，条带强时则说明检测对象不含ms1b隐性不育基因，条带弱时说明检测对象含有1个ms1b隐性不育基因，没有条带时则说明检测对象含有1对ms1b隐性不育基因；
当采用p1与p3组合双重pcr时，如果扩增出976bp的条带，说明检测对象中含有4b染色体；如果同时扩增出720bp的条带，条带强时说明检测对象不含ms1b隐性不育基因，条带弱时说明检测对象含有1个ms1b隐性不育基因，没有条带时则说明检测对象含有1对ms1b隐性不育基因；如果未扩增出976bp的条带，则说明该样品检测结果不准确需要重新实验；
当采用p2与p3组合双重pcr时，如果扩增出976bp的条带，说明检测对象中含有4b染色体；如果同时扩增出531bp的条带，条带强时说明检测对象不含ms1b隐性不育基因，条带弱时说明检测对象含有1个ms1b隐性不育基因；没有条带时则说明检测对象含有1对ms1b隐性不育基因；如果未扩增出976bp的条带，则检测结果不准确需要重新实验。
当采用引物对p1进行检测时，20μl的pcr反应体系包含：10μl2×greenmixbuffer；样品基因组dna抽提物1μl；浓度为10μmol/l的p1引物对的上下游引物各0.3μl，蒸馏水补足至20μl；pcr反应程序为：预变性95℃，3min，再经95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环，最后72℃延伸5min。
当采用引物对p2进行检测时，20μl的pcr反应体系包含：10μl2×greenmixbuffer；样品基因组dna抽提物1μl；浓度为10μmol/l的p2引物对的上下游引物各0.3μl，蒸馏水补足至20μl；pcr反应程序为：预变性95℃，3min，再经95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，36个循环，最后72℃延伸5min。
当采用引物对p1和p3引物对组合进行检测时，20μl的pcr反应体系包含：10μl2×greenmixbuffer；样品基因组dna抽提物1μl；浓度为10μmol/l的p1引物对的上下游引物各0.3μl，浓度为浓度为10μmol/l的p3引物对的上下游引物各0.15μl，蒸馏水补足至20μl；pcr反应程序为：预变性95℃，3min，再经95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环，最后72℃延伸5min。
当采用引物对p2和p3引物对组合进行检测时，20μl的pcr反应体系包含：10μl2×greenmixbuffer；样品基因组dna抽提物1μl；浓度为10μmol/l的p2、p3引物对的上下游引物均各0.3μl，蒸馏水补足至20μl；pcr反应程序为：预变性95℃，3min，再经95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，33个循环，最后72℃延伸5min。
本发明的有益效果是：检测周期短、灵敏度好，方法简便、操作简单、准确性好，可有效地对不带胚的半粒小麦种子和植株组织进行检测，能实现对ms1b基因的快速、大通量的检测，大幅度提高蓝粒两系法杂交小麦系统中的两用系(不育系)快速转育和选育效率。
附图说明
图1为采用p1引物对检测ms1b的琼脂糖凝胶电泳结果图，其中：m：分子量标准为dl1000dnamarker；1-2：13品6；5-2：17zh189(16l5079w/绵麦367)杂交种；8-1：14l6232b蓝粒两用系；n：清水对照。
图2为采用p2引物对检测ms1b的琼脂糖凝胶电泳结果图，其中：m：分子量标准为dl1000dnamarker；1-2：13品6；5-2：17zh189(16l5079w/绵麦367)杂交种；7-1：17zh231(15l7079w/13品6)杂交种；8-1：14l6232b蓝粒两用系；n：清水对照。
图3为采用p3引物对检测4b染色体有无缺失的琼脂糖凝胶电泳结果图，其中，m：分子量标准为dl1000dnamarker；1-2：13品6；5-2：17zh189(16l5079w/绵麦367)杂交种；8-1：14l6232b蓝粒两用系；n：清水对照。
图4为采用p1和p3引物组合进行双重pcr检测ms1b和4b染色体的琼脂糖凝胶电泳结果图，其中，m：分子量标准为dl1000dnamarker；1-2：13品6；5-2：17zh189(16l5079w/绵麦367)；8-1：14l6232b蓝粒两用系；n：清水对照。
图5为采用p2和p3引物组合进行双重pcr检测ms1b和4b染色体的琼脂糖凝胶电泳结果图，其中，m：分子量标准为dl1000dnamarker；1-2：13品6；5-2：17zh189(16l5079w/绵麦367)杂交种；7-1：17zh231(15l7079w/13品6)杂交种；8-1：14l6232b蓝粒两用系；n：清水对照。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例一、
一、引物设计及组合
根据e.j.tucker等2017年在《naturecommunication》杂志上发表的基因组序列设计引物对，先建立p1、p2和p3引物对的单个pcr检测体系，然后通过优化反应条件，检测ms1b的p1、p2引物分别与检测4b染色体的p3引物搭配，建立同时检查样品中有无ms1b基因和4b染色体有无缺失的双重pcr体系。3对引物组合详细情况见下表1：
表1本发明所使用的引物对
本发明以种子或植株的根茎叶总基因组dna为模板，利用本发明的引物对或其组合分别进行pcr扩增，反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳判定结果：具体利用p1或者p2引物对，进行pcr扩增可鉴别ms1b不育基因；利用p3引物对进行pcr扩增可鉴别4b染色体在所鉴定的材料中有无缺失；当p1、p2引物对分别与p3组合进行双重pcr扩增可以保证在4b染色体无缺失情况下鉴别ms1b基因有无、是杂合或纯合的，检测结果更准确可靠。
二、dna提取:
利用biospin全能型植物基因组dna提取试剂盒提取dna，对其操作步骤略有改动，具体步骤如下：
1)用刀片将种子切成两半，无胚部分压碎后放入1.5或2.0ml的离心管中；或用刀片将植物组织切碎后放入1.5ml的离心管中。
2)在装有样品的离心管中加800μllaplusbuffer，放置30min后加入钢珠用磨样器打碎，置于4℃冰箱中过夜。
3)振荡后置于65℃水浴锅中温浴30min，其间振荡离心管2-3次。
4)加入200μldabuffer，混合均匀后置于-20℃冰箱中或冰浴中10min。
5)将混合物在10000rpm离心3min后上清液移至shredderspincolumn，再在10000rpm离心1min。
6)将滤液转移到一个新的1.5ml离心管中，加入750ul或滤液体积1.5倍的pbindingbuffer(加酒精的)，混合均匀。
7)将混合液移至spincolumn中，6000rpm离心1min，弃去接液管中液体(由于液体较多，分2次离心过柱)。
8)向spincolumn中加入400μl的gbindingbuffer,10000rpm离心30秒，弃去接液管中液体。
9)向spincolumn中加入400μl的washingbuffer(加酒精的),10000rpm离心30秒，弃去接液管中液体，重复2次。
10)再次将spincolumn10000rpm离心1min，然后将其转移至一个新的1.5ml的离心管上。
11)向spincolumn中加入30μl的elutionbuffer，在室温下放置1min后，10000rpm离心1min，弃去spincolumn，离心管中液体即为dna抽提物，-20℃下保存备用。
三、pcr反应体系(20μl)：
10μl2×greenmixbuffer(promega公司，其成分为gotaqdna聚合酶、dntps及反应缓冲液)；样品基因组dna抽提物1μl；引物由重庆市擎科兴业生物技术有限公司合成，浓度为10μmol/l，单个pcr扩增中p1、p2引物使用量均为0.3μl，p3引物使用量为0.15μl，双重pcr扩增中p1和p3引物组合中p1和p3使用量分别为0.3μl和0.15μl，p2和p3组合引物中p2和p3使用量均为0.3μl；蒸馏水补足至20μl。
四、pcr反应程序：
1)p1引物对的pcr反应程序为：预变性95℃，3min，再经95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环，最后72℃延伸5min；
2)p2引物对的pcr反应程序为：预变性95℃，3min，再经95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，36个循环，最后72℃延伸5min；
3)p3引物对的pcr反应程序为：预变性95℃，3min，再经95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环，最后72℃延伸5min；
4)p1和p3引物对组合双重pcr反应程序为：预变性95℃，3min，再经95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环，最后72℃延伸5min；
5)p2和p3引物对组合双重pcr的反应程序为：预变性95℃，3min，再经95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，33个循环，最后72℃延伸5min。pcr产物在4℃条件下保存。
从上面可以发现，p1和p3引物对组合的双重pcr的pcr循环次数明显多于p2和p3引物对组合双重pcr的pcr循环次数，因此当提取的dna量较少时，采用p2和p3引物对组合进行双重pcr效果更好，更易得到清晰的条带。五、电泳：
电泳用2.5％的琼脂糖，dl1000dnamarker(takara公司)，80v电压，90min。
实施例二、品种(系)检测鉴定
按照实施例一中的dna提取方法、pcr反应体系、pcr反应程序、琼脂糖对不同小麦品种(系)检测(电泳结果如附图1-5所示)：
一、常规小麦品种(系)检查鉴定
检测了常规小麦品种(系)：14品16,13品6，绵麦374，绵麦367，渝麦17，西农538，小偃22，高大1号，陕987，远丰175，mts-1，15ca50，济麦22，九麦2号，伟隆121,伟隆136，伟隆169等。检测结果显示均表现1-2(13品6)的带型。
二、含1对ms1b基因的蓝粒两用系检测鉴定
检测了蓝粒两用系：08l5070b，12l8012b，12l8015b，12l8016b，14l8056b，14l8139b,14l6232b，15l7079b，15l7084b，15l7095b，15l7096b，15l7266,16l5079b，16l6010b,16l6335b,16l6355b,16l6388b,16l6392b,16l6429b,16l6432b,16l7004b,16l7043b,17l5080b,17l6062b,17l6067b,17l9034b,17l9066b,17l9076b,17l9080b等。检测结果显示均表现8-1(14l6232b蓝粒两用系)的带型。
三、含1个ms1b基因的小麦杂交种的检测鉴定
检测了小麦杂交种：17zh01，17zh02，17zh03，17zh04，17zh05，17zh06，17zh07，17zh08，17zh49，17zh50，17zh51，17zh52，17zh53，17zh54，17zh95，17zh96，17zh139，17zh140，17zh141，17zh142，17zh143，17zh186，17zh187，17zh188，17zh189，17zh229，17zh230，17zh231，17zh233，17zh234，17zh235，17zh236等。检测结果显示均表现5-2(17zh189，杂交种)的带型。
采用本发明方法得到的检测结果和这些品种(系)的已知不育表型是相符合的，说明本发明的检测方法灵敏度好，方法简便，操作简单，能实现对ms1b基因的快速、大通量的检测，大幅度提高蓝粒两系法杂交小麦系统中的两用系(不育系)快速转育和选育效率。