本发明涉及一种新型tlr4/md2抑制剂，具体是一类化合物n-取代-4-(5-二甲氨基-1-萘)磺酰氧基苯并噁唑-2-酮及其在抗炎药物中的应用。
背景技术：
炎症，是机体对抗外界感染或损伤时的一种防御反应，然而当致炎因子，如no，il-1β，il-6和tnf-α等，未能得到及时清除，受损组织器官未能得到修复，炎症则严重影响人们的生活与学习，成为临床常见疾病。炎症发生于多个组织和器官，如肺炎、肾炎、扁桃体炎，且与多种疾病的发生发展密切相关，如哮喘，类风湿性关节炎，妇科疾病，动脉粥样硬化，糖尿病，神经变性疾病，肾病，癌症等。其病理部位较多，炎症种类繁多，诱发因素多样，且发病机制复杂。因此，抗炎药物在临床的应用范围极为广泛，是全球使用最多的药物种类之一。
临床常用抗炎药物主要分为甾体类抗炎药物和非甾体类抗炎药物，其中甾体类抗炎药，如糖皮质激素、地塞米松，虽然抗炎效果明显，但长期使用会导致骨质疏松，肾上腺功能下降，糖皮质激素的依赖综合症等严重不良反应，而限制了此类药物在治疗慢性炎症中的应用。非甾体类抗炎药，如阿司匹林，吲哚美辛等，在临床中应用虽然较多，然而其对cox-1的抑制作用引起了严重的胃肠道与肾脏的毒副作用，如胃及十二指肠溃疡出血，肾水肿、间质性肾炎等。选择性cox-2抑制剂，如塞来昔布、罗非昔布，虽表现出更强的抗炎活性，且可克服传统非甾体类抗炎药物的胃肠道、肾脏的毒副作用，但长期使用仍会造成心血管的不良反应。新型tnf-α阻滞剂、il-1受体拮抗剂等，能针对特异分子进行治疗，作用机制与靶点更加明确，其抗炎疗效得到了公认，但该类药物大多为生物大分子，口服吸收差，易快速被机体清除，且不能选择性到达靶组织，对神经系统与心血管系统等有不同程度的毒副反应。因此，寻找并开发具有更高抗炎活性，毒副作用更小且作用靶点更明确的新型小分子化合物成为目前抗炎类药物发展的目标。
tlr4是一种天然免疫模式识别受体，其可识别外界细菌或病毒等病原体入侵的重要刺激分子，形成病菌-tlr4-md2复合物，并将胞外的炎性信号转移至胞内重要衔接蛋白myd88，进而募集irak4，使irak4被磷酸化而激活，并通过下游traf6、tak1等因子的活化，最终使核转录因子nf-κb发生磷酸化修饰而入核，启动炎性因子的转录，使得炎性因子大量产生并释放，进而促进炎症反应的发生与发展。因此，tlr4/md2在炎性疾病的发生发展中起着重要的作用。与此同时，天然免疫tlr4/md2通路的异常也是许多疾病的分子病因，如自身免疫疾病(系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎)、癌症(肺癌、乳腺癌和卵巢癌等)、糖尿病、糖尿病肾病、动脉粥样硬化和阿尔兹海默病。因此，实现tlr4/md2信号通路的调控对于控制多种疾病的发展，尤其是炎性相关疾病具有重要意义。
4-(5-二甲氨基-1-萘)磺酰氧基苯并噁唑2-酮(dsb)及其衍生物n-取代-4-(5-二甲氨基-1-萘)磺酰氧基苯并噁唑2-酮类化合物为发明人自主设计合成的一类新结构化合物，其结构及其药理活性在国内外均无报道。该类化合物可显著抑制tlr4/md2-myd88-irak4-nf-κb信号通路，为新型的tlr4/md2抑制剂。本发明揭示该类化合物能够有效的抑制炎症反应，且毒性极低，具有较好的抗炎新药开发价值。
技术实现要素：
本发明旨在提供一类化合物n-取代-4-(5-二甲氨基-1-萘)磺酰氧基苯并噁唑-2-酮的结构、制备及其药理用途。
本发明是通过以下技术方案实现的：化合物n-取代-4-(5-二甲氨基-1-萘)磺酰氧基苯并噁唑-2-酮，其结构式为：
所述r基可独立选自氢，1至4个碳的烷基，1至4个碳的芳香烷基，烷基、硝基等基团取代的1至4个碳的芳香烷基或酰基。
在本发明中，1至4个碳的烷基可选甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基等；1至4个碳的芳香烷基可选苄基、苯乙基等；烷基、硝基等基团取代的1至4个碳的芳香烷基可选对甲基苄基、对硝基苄基等；酰基可选乙酰基、苯甲酰基、邻甲基苯甲酰基。
本发明以4-羟基苯并噁唑酮为原料，经过与5-二甲氨基-1-萘磺酰氯发生缩合反应，制得目标化合物4-(5-二甲氨基-1-萘)磺酰氧基苯并噁唑-2-酮(dsb，r基为氢)。上述产物可继续在k2co3的无水丙酮溶液中与溴乙烷、溴丙烷、溴丁烷、溴苄、苯乙基溴、对甲基溴苄、对硝基溴苄、乙酰氯、苯甲酰氯、邻甲基苯甲酰氯等卤代烃或酰卤反应，制得n-取代-4-(5-二甲氨基-1-萘)磺酰氧基苯并噁唑2-酮类化合物。其结构经ms、1h-nmr和13c-nmr进行确证。
本发明的其中一个目的是提供所述化合物在制备tlr4/md2抑制剂中的应用。
本发明的另一个目的在于提供所述化合物在制备抗炎药物中的应用。较临床常用抗炎药物相比，该类化合物具有毒性低，副作用小，抗炎效果显著的优势。
具体的，所述抗炎药物所针对的疾病包括急、慢性与免疫性炎症。
进一步的，所述抗炎药物所针对的疾病包括肺炎、乳腺炎、肠炎等急慢性炎症和类风湿性关节炎、阿尔兹海默病等免疫性炎症。
本发明以脂多糖(lps)诱导的小鼠巨噬细胞raw264.7为炎症模型，分别给予不同剂量的化合物4-(5-二甲氨基-1-萘)磺酰氧基苯并噁唑-2-酮(dsb)及其衍生物。该类化合物可剂量依赖性的抑制no和炎症因子il-1β和il-6的释放。其中化合物dsb可显著抑制tlr4、irak4、nf-κb、cox-2与il-6等炎症信号通路中重要蛋白的表达，为新型tlr4/md2抑制剂。
本发明通过建立二甲苯致小鼠耳肿胀炎症模型，灌胃给予化合物4-(5-二甲氨基-1-萘)磺酰氧基苯并噁唑-2-酮(dsb)的羧甲基纤维素钠(cmc-na)混悬液，通过检测耳肿胀程度证实化合物可显著降低二甲苯所致的小鼠耳肿胀，且在相同剂量下，较临床常用抗炎药塞来昔布效果更强。
本发明建立了脂多糖(lps)诱导的小鼠炎症反应，灌胃给予化合物4-(5-二甲氨基-1-萘)磺酰氧基苯并噁唑-2-酮(dsb)的羧甲基纤维素钠(cmc-na)混悬液后，小鼠血清炎症因子il-1β明显降低，且肺组织水肿程度明显得到改善，显示出明确的抗炎疗效。
本发明以胶原诱导性关节炎大鼠模拟类风湿性关节炎，灌胃给予化合物4-(5-二甲氨基-1-萘)磺酰氧基苯并噁唑-2-酮(dsb)的脂质体后，血清炎症因子tnf-α和il-1β的表达显著降低，且关节肿胀度明显改善。
本发明通过小鼠口服给予化合物4-(5-二甲氨基-1-萘)磺酰氧基苯并噁唑-2-酮(dsb)5000mg/kg，评价了化合物的急性毒性。该化合物属于基本无毒的等级，且其最大耐受量>5000mg/kg。
进一步的，本发明另外提供了一种药物组合物，包含①，以及②、③、④中的至少一种物质；
所述①为所述的化合物；
所述②为药学上可接受的药用辅料；
所述③为佐剂；
所述④为媒介物。
具体的，提供了上述的药物组合物在制备抗炎药物中的应用。药物组合物中以化合物为活性成分，与②、③、④中的至少一种物质共同使用，制成临床剂型。
进一步的，所述抗炎药物所针对的疾病包括急、慢性与免疫性炎症。
具体应用时，所述药物组合物通过口服、经皮、肌肉、皮下、皮肤黏膜、静脉途径给药。
或者，所述药物组合物以口服制剂、注射剂或局部给药制剂形式存在。
具体实施时，所述口服制剂包括片剂、胶囊剂、固体分散体、散剂、脂质体或溶液剂；注射剂包括注射液剂型或注射用冻干粉针剂型；局部给药制剂包括霜剂、软膏剂、喷雾剂、气雾剂、贴剂、凝胶剂或巴布剂。
本发明所述的化合物dsb及其衍生物，为新型tlr4/md2抑制剂，可显著抑制脂多糖(lps)诱导的小鼠巨噬细胞no和炎症因子il-1β,il-6的释放，可显著抑制tlr4炎症信号通路tlr4和irak4的表达，阻止nf-κb入核，进而抑制炎症效应分子cox-2和il-6的表达而发挥抗炎活性；dsb可显著抑制二甲苯所致的小鼠耳肿胀，且在相同剂量下较临床常用抗炎药塞来昔布效果更强；dsb可显著抑制脂多糖(lps)所致的小鼠肺组织炎症因子的释放；dsb可显著抑制胶原诱导性关节炎大鼠的关节肿胀度及其炎性因子il-1β和tnf-α的表达，且较临床常用抗关节炎药物保泰松疗效更好；dsb口服的最大耐受量>5000mg/kg，属于基本无毒的化合物。化合物dsb结构新颖，制备工艺简单，其对急、慢性与免疫性炎症均表现出较好的疗效，具有良好的市场开发前景。其可单独或与其他药学上可接受的药用辅料共同使用，用于抗炎药物的制备。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为化合物dsb对lps诱导的raw264.7细胞炎症信号通路蛋白tlr4、irak4、nf-κb、cox2和il-6表达的影响图。图a为tlr4、irak4、cox2和il-6蛋白的westernblot图，图b为细胞质与细胞核中nf-κb蛋白的westernblot图。
图2为化合物dsb对lps诱导的raw264.7细胞炎症信号通路蛋白tlr4、irak4、nf-κb、cox2和il-6蛋白表达的柱状图。*代表与lps模型组相比，p<0.1；**代表与lps模型组相比，p<0.05。
图3为化合物dsb对lps诱导的raw264.7细胞膜表面tlr4表达的影响。
图4为化合物dsb对lps诱导的小鼠血清、肝脏和肺脏炎症因子il-1β表达的抑制作用对比图。
图5为化合物dsb对胶原诱导性关节炎大鼠血清炎症因子il-1和tnf-α表达的抑制作用对比图。图中lps-脂多糖；normal-正常组；disease-模型组；dsb-dsb药物组；butazodine-阳性药物组。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
一般地，本发明的化合物可以通过本发明所描述的方法制备得到。下面的反应方案和实施例用于进一步举例说明本发明的内容。
所属领域的专业人员将认识到：本发明所描述的化学反应可以用来合适地制备许多本发明的其他化合物，且用于制备本发明的化合物的其它方法都被认为是在本发明的范围之内。例如，根据本发明那些非例证的化合物的合成可以成功地被所属领域的技术人员通过修饰方法完成，如适当的保护干扰基团，通过利用其他已知的试剂除了本发明所描述的，或将反应条件做一些常规的修改。另外，本发明所公开的反应或已知的反应条件也公认地适用于本发明其他化合物的制备。
所属领域的专业技术人员也应认识到：本发明实例里所证明的个别化合物的特点(实施例5-11试验数据及结果)，其他本发明那些非例证的化合物也同样具备，同样在抗炎方面有显著的药理作用。化合物、药学上可接受的盐(包含例证以及非例证的化合物)只是对实施例中化合物作变化或替换，不会对它们在药物组合物中的效果明显有不利的影响。
实施例中所述实验方法，如无特殊说明；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细的说明。
实施例1：化合物4-(5-二甲氨基-1-萘)磺酰氧基苯并噁唑-2-酮(dsb)的制备及其结构确证
称取化合物4-羟基苯并噁唑酮500mg溶于30ml无水丙酮中，逐渐滴加缚酸剂三乙胺500μl，于冰浴反应30min后，缓慢滴加5-二甲氨基-1-萘磺酰氯900mg的无水丙酮溶液20ml，室温反应30min后，于55℃回流反应6h后，蒸除溶剂，经柱层析分离得目标化合物4-(5-二甲氨基-1-萘)磺酰氧基苯并噁唑-2-酮(dsb)700mg。
结构表征：分子式c19h16n2o5s(384.08g/mol)；黄色粉末；产率(％):65.3％；mp(℃):164.3-166.4℃；esi-ms(m/z):385.17([m+h]+)；1hnmr(600mhz,cdcl3):δ3.05(s,6h,ch3),6.44(d,j＝8.4hz,1h,ar-5-h),6.83(t,1h,j＝8.4hz,ar-6-h),7.02(d,1h,j＝8.4hz,ar-7-h),7.43(d,1h,j＝4.2hz,naphthalene-6-h)，7.56(t,1h,j＝7.2hz,naphthalene-7,8-h),7.79(t,2h,j＝7.8hz,naphthalene-3-h),8.14(d,1h,j＝7.2hz,naphthalene-4-h),8.58(d,1h,j＝7.2hz,naphthalene-2-h),8.87(br,1h,nh)；13cnmr(150mhz,cdcl3):δ29.35,45.43,108.95,115.94,117.86,118.63,122.47,123.04,123.13,129.54,129.65,129.79,129.97,131.81,132.33,132.89,145.09,152.38,153.21.
实施例2：化合物n-苄基-4-(5-二甲氨基-1-萘)磺酰氧基苯并噁唑-2-酮(dsb-2)的制备及其结构确证
称取4-(5-二甲氨基-1-萘磺酰氧基)苯并噁唑-2-酮(dsb)50mg于50ml茄形瓶中，于20ml无水丙酮中溶解，加入96.9mg无水k2co3于反应体系中，室温反应30min后，加入两倍当量溴苄，60℃回流6h，tlc监测反应终点。过滤除去固体k2co3，旋干溶剂，以乙酸乙酯/石油醚(1:9)为洗脱体系，柱层析分离纯化得目标化合物n-苄基-4-(5-二甲氨基-1-萘)磺酰氧基苯并噁唑-2-酮(dsb-2)。
结构表征：分子式c26h22n2so5，产率51.40％；mp.162.0～164.8℃；性状为亮黄色固体粉末；1h-nmr(400hz,cdcl3)δ：8.69(d,j＝8.5hz,1h),8.30(d,j＝8.7hz,1h),8.14(dd,j＝7.4,1.1hz,1h),7.67-7.57(m,1h),7.53(dd,j＝8.5,7.5hz,1h),7.35(dd,j＝6.6,2.8hz,2h),7.29(dd,j＝7.7,3.6hz,3h),7.25(s,1h),7.06(dd,j＝8.1,0.7hz,1h),6.76(t,j＝8.3hz,1h),6.21(dd,j＝8.6,0.7hz,1h),5.23(s,2h),2.93(s,6h)。
实施例3：化合物n-苯乙基-4-(5-二甲氨基-1-萘)磺酰氧基苯并噁唑-2-酮(dsb-3)的制备及其结构确证
称取4-(5-二甲氨基-1-萘磺酰氧基)苯并噁唑-2-酮(dsb)100mg于50ml茄形瓶中，于30ml无水丙酮中溶解，加入120mg无水k2co3于反应体系中，室温反应45min后，加入两倍当量苯乙基溴，65℃回流8h，tlc监测反应终点。过滤除去固体k2co3，旋干溶剂，以乙酸乙酯/石油醚(2:8)为洗脱体系，柱层析分离纯化得目标化合物n-苯乙基-4-(5-二甲氨基-1-萘)磺酰氧基苯并噁唑-2-酮(dsb-3)。
结构表征：分子式c27h24n2so5，产率39.03％；mp.141.8～145.3℃；性状为黄绿色固体粉末；esi-ms(m/z)475.07(m+h+)；1h-nmr(400hz,cdcl3)δ：8.70(d,j＝8.5hz,1h),8.43(d,j＝8.7hz,1h),8.16(dd,j＝7.3,1.1hz,1h),7.73–7.61(m,1h),7.52(dd,j＝8.4,7.5hz,1h),7.27(d,j＝7.9hz,2h),7.22(dt,j＝13.6,6.3hz,4h),7.06(dd,j＝8.0,0.6hz,1h),6.79(t,j＝8.3hz,1h),6.27(dd,j＝8.6,0.6hz,1h),4.29-4.20(m,2h),3.14-3.02(m,2h),2.94(s,6h)。
实施例4：按照实施例2的制备方法得到如表1所示的各化合物。并且实施例4中的各化合物与实施例2的制备方法的区别仅在于替换了其中的溴苄试剂。
表1.化合物dsb-4至dsb-7的结构式
表1中各化合物的结构确证如下：
n-对硝基苯乙基-4-(5-二甲氨基-1-萘)磺酰氧基苯并噁唑-2-酮(dsb-4)：分子式c27h23n3so7，产率38.62％；黄色固体粉末；esi-ms(m/z)534.15(m+h+)；1h-nmr(400hz,cdcl3)δ：8.56(d,j＝8.6hz,1h),8.34(d,j＝7.3,1.1hz,1h),8.11(d,j＝8.2hz,1h),7.63(dd,j＝8.4,7.5hz,1h),7.35(d,j＝7.9hz,2h),7.31(dt,j＝13.6,6.3hz,4h),7.12(dd,j＝8.0,0.6hz,1h),6.82(t,j＝8.3hz,1h),6.36(dd,j＝8.6,0.6hz,1h),4.33-4.27(m,2h),3.24-3.12(m,2h),2.89(s,6h)。
n-对甲基苯乙基-4-(5-二甲氨基-1-萘)磺酰氧基苯并噁唑-2-酮(dsb-5)：分子式c28h26n2so5，产率43.57％；黄色固体粉末；esi-ms(m/z)513.42(m+h+)；1h-nmr(400hz,cdcl3)δ：8.25(d,j＝8.3hz,1h),8.11(d,j＝7.4hz,1h),7.52(d,j＝7.5hz,1h),7.41(d,j＝8.4,7.5hz,1h),7.15(d,j＝7.9hz,2h),7.08(dt,j＝13.6,6.3hz,4h),6.77(d,j＝8.0,0.6hz,1h),6.58(t,j＝8.3hz,1h),6.15(d,j＝8.6,0.6hz,1h),4.29-4.20(m,2h),3.14-3.02(m,2h),2.94(s,6h)，2.35(s,3h)。
n-苯甲酰基-4-(5-二甲氨基-1-萘)磺酰氧基苯并噁唑-2-酮(dsb-6)：分子式c26h20n2so6，产率33.87％；黄色固体粉末；esi-ms(m/z)489.38(m+h+)；1h-nmr(400hz,cdcl3)δ：8.17(d,j＝8.5hz,1h),8.06(d,j＝7.6hz,1h),7.86(d,j＝7.6hz,1h),7.78(d,j＝8.4,7.6hz,1h),7.67(d,j＝7.8hz,1h),7.46(d,j＝7.8hz,2h),7.16(dt,j＝13.6,6.3hz,4h),6.91(d,j＝8.0,0.6hz,1h),6.65(t,j＝8.3hz,1h),6.42(d,j＝8.6,0.6hz,1h),2.84(s,6h)。
n-对甲基苯甲酰基-4-(5-二甲氨基-1-萘)磺酰氧基苯并噁唑-2-酮(dsb-7)：分子式c27h22n2so6，产率42.63％；黄色固体粉末；esi-ms(m/z)513.43(m+h+)；8.15(d,j＝8.4hz,1h),8.07(d,j＝7.6hz,1h),7.38(d,j＝7.5hz,1h),7.24(d,j＝8.4,7.5hz,1h),7.12(d,j＝7.9hz,2h),7.02(dt,j＝13.6,6.3hz,4h),6.70(d,j＝8.0,0.6hz,1h),6.65(t,j＝8.3hz,1h),6.15(d,j＝8.6,0.6hz,1h),2.84(s,6h)，2.37(s,3h)。
实施例5：化合物4-(5-二甲氨基-1-萘)磺酰氧基苯并噁唑-2-酮(dsb)及其衍生物对lps诱导的小鼠巨噬细胞raw264.7炎症模型的抗炎活性
巨噬细胞在炎症的发生机制中起着关键作用，其广泛参与了非特异性免疫(急性、亚急性与慢性炎症)与特异性免疫(如关节炎、甲状腺等)过程。当外界刺激(如细菌、内毒素等)诱导巨噬细胞活化后，使得其分泌大量的炎症介质，如il-1β、il-6等，进而激活nf-κb，使其入核，并释放cox、il-6等炎症因子，如此循环，进一步加重炎症反应。因此，通过检测巨噬细胞炎症因子的表达，可实现化合物的抗炎活性评价。
实验步骤：raw264.7细胞以含10％胎牛血清的dmem高糖作为培养基，于37℃，5％co2的培养箱中培养，取对数生长期的细胞均匀接种到24孔板中，细胞密度为70％～80％，放入细胞培养箱中过夜至细胞贴壁后，分别加入无血清培养基(空白对照)，lps(1μg/ml)(模型组)，lps(终浓度1μg/ml)和化合物(终浓度100μm、50μm、25μm、12.5μm、6.25μm)或阳性药塞来昔布(药物组)培养24h。取所需体积细胞上清液，分别按照相关因子检测试剂盒说明检测no和炎症因子il-1β、il-6的表达。
实验结果：
如表2所示：化合物4-(5-二甲氨基-1-萘)磺酰氧基苯并噁唑-2-酮(dsb)及其衍生物可明显抑制lps诱导的raw264.7小鼠巨噬细胞no和炎症因子il-1β、il-6的表达，且与临床常用抗炎药塞来昔布相比较，其对il-6的抑制效果显示出极好的优势。
表2.化合物dsb及其衍生物对lps诱导的raw264.7细胞释放炎症因子的抑制作用
实施例6：化合物4-(5-二甲氨基-1-萘)磺酰氧基苯并噁唑-2-酮(dsb)对tlr4/md2-myd88-irak4-nf-κb的调控作用研究
raw264.7细胞以含10％胎牛血清的dmem高糖作为培养基，于37℃，5％co2的培养箱中培养，取对数生长期的细胞均匀接种到24孔板中，细胞密度为70％～80％，放入细胞培养箱中过夜至细胞贴壁后，分别加入无血清培养基(空白对照)，lps(1μg/ml)(模型组)，lps(终浓度1μg/ml)和dsb(终浓度100μm、50μm、25μm)培养24h，弃去上清，收集细胞，用含有1％pmsf的ripa高效细胞裂解液提取细胞蛋白，bca法进行蛋白定量。于sds-page电泳进行蛋白分离，转膜，5％脱脂奶粉封闭2-3h，一抗孵育，4℃过夜，二抗孵育1h，ecl超敏显影液显影，检测tlr4、myd88、p-irak4、cox-2、il-6nf-κb的蛋白表达。
实验结果：
如图1和2所示，化合物4-(5-二甲氨基-1-萘)磺酰氧基苯并噁唑-2-酮(dsb)可抑制tlr4信号通路相关蛋白tlr4、myd88的表达，抑制irak4的磷酸化，进而阻止nf-κb的入核，抑制cox-2和il-6的表达，且呈现明显的剂量依赖性。
实施例7：化合物4-(5-二甲氨基-1-萘)磺酰氧基苯并噁唑-2-酮(dsb)对tlr4的抑制作用研究
将对数期细胞接种于六孔板，37℃、5％co2条件下培养，待细胞贴壁后，随机分为6组：空白对照组，lps-fitc组，lps-fitc与不同浓度dsb(12.5μm、25μm、50μm)同时作用组，继续培养24h后，弃去上清，pbs洗涤细胞后用0.25％胰酶消化离心，用pbs冲洗，于1000g离心4min，重复三次，洗尽游离的lps-fitc，加入200μlpbs摇散细胞，网纱过滤后于流式细胞术检测各组细胞平均荧光强度，通过荧光强度来反应细胞表面tlr4的表达水平。
实验结果：
如图3所示，lps刺激细胞后，lps与tlr4/md2形成复合物，细胞表面荧光强度明显增强，而化合物4-(5-二甲氨基-1-萘)磺酰氧基苯并噁唑-2-酮(dsb)可剂量依赖性降低细胞表面荧光强度，证明其可抑制tlr4/md2的表达，为tlr4/md2抑制剂。
实施例8：化合物4-(5-二甲氨基-1-萘)磺酰氧基苯并噁唑-2-酮(dsb)对二甲苯致小鼠耳肿胀炎症模型的抗炎活性
二甲苯是一种化学刺激剂，也是常用的化学致炎剂，可以诱导组胺、激肽及纤维蛋白溶解酶等炎症介质的释放，进而引起局部毛细血管通透性的增加、炎症细胞的浸润、急性渗出性炎性水肿等。将二甲苯涂布于小鼠耳廓，可使小鼠耳廓肿胀，耳重增加，为常见的一种急性炎症模型，用于新型抗炎药物的筛选。
实验动物：健康昆明小鼠，雌雄各半，体重18-22g，实验前禁食12h。
动物分组：
对照组：灌胃给予空白溶剂(0.5％cmc-na)。
dsb药物组：灌胃给予dsb的cmc-na混悬液3.125、6.25、12.5mg/kg。
阳性对照组：灌胃给予阳性对照药塞来昔布12.5mg/kg。
实验步骤：
化合物dsb混悬液的制备：取化合物的粉末置于研钵中，研磨均匀后加入0.5％cmc-na制成不同浓度的混悬液，经旋窝混悬器充分匀浆后即可直接使用。
灌胃45min后，各组小鼠右耳涂二甲苯(20μl/只)致炎，15min后处死小鼠，用直径8mm的打孔器在双耳对称处打下耳片，称重。以左右耳片质量差为肿胀度指标，将药物组与对照组数据进行统计学分析计算抑制率。
抑制率＝(平均对照组肿胀度–药物组肿胀度)/平均对照组肿胀度×100％。
实验结果：
如表3所示：化合物4-(5-二甲氨基-1-萘)磺酰氧基苯并噁唑-2-酮(dsb)可剂量依赖性抑制二甲苯所致的小鼠耳肿胀程度，且当给药剂量为12.5mg/kg时，其对耳肿胀的抑制率超过50％，较同等剂量阳性药塞来昔布明显提高。
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表3.化合物dsb对二甲苯致小鼠耳肿胀的抑制作用(x±s,n＝10)
实施例9：化合物4-(5-二甲氨基-1-萘)磺酰氧基苯并噁唑2-酮(dsb)对lps诱导的小鼠炎症模型的抗炎活性
脂多糖(lps)是介导炎症反应最主要的病原分子之一。动物腹腔单次注射大剂量lps(5-10mg/kg)，可导致剧烈的炎症反应。
实验动物：健康昆明小鼠，雌雄各半，体重18-22g，实验前禁食12h。
动物分组：
正常组：灌胃给予空白溶剂(0.5％cmc-na)。
模型组：腹腔注射给予lps5mg/kg。
dsb药物组：灌胃给予化合物dsb的cmc-na混悬液12.5mg/kg。
实验步骤：小鼠腹腔注射lps5mg/kg，4h后，分别口服空白溶剂和化合物dsb，20h后，分别收集小鼠血清，肝脏组织和肺组织。按照il-1β测定试剂盒的说明书要求分别处理血清、肝组织和肺组织，并测定il-1β的表达。
实验结果：
如图4所示：小鼠腹腔注射lps后，血清、肝脏和肺脏中il-1β的表达较正常组明显升高，而口服给予化合物4-(5-二甲氨基-1-萘)磺酰氧基苯并噁唑-2-酮(dsb)后，il-1β的表达降低，而这种抑制炎症因子il-1β的作用在肺脏组织中的效果最为明显，可明显减弱肺脏的肿胀程度，对于肺组织炎症表现出较好的应用前景。
实施例10：化合物4-(5-二甲氨基-1-萘)磺酰氧基苯并噁唑-2-酮(dsb)对胶原诱导性关节炎大鼠炎症模型的抗炎活性
ⅱ型胶原可引起大鼠的炎症性多发性关节炎，其症状与人类风湿性关节炎相似，为评价药物的抗炎和免疫抑制作用的经典免疫性炎症模型。足肿胀度或关节炎指数为其抗炎活性评价指标。
实验动物：健康sd大鼠，雌雄各半，体重160-180g。
动物分组：
正常组：灌胃给予空白溶剂(0.5％cmc-na)。
模型组：注射牛ⅱ型胶原免疫混合物。
dsb药物组：造模成功后，灌胃给予化合物dsb的脂质体50mg/kg、25mg/kg和12.5
mg/kg。
阳性药物组：造模成功后，灌胃给予保泰松50mg/kg。
实验步骤：
化合物4-(5-二甲氨基-1-萘)磺酰氧基苯并噁唑-2-酮(dsb)脂质体的制备：
称取0.5g化合物dsb，7g卵磷脂，1.1g胆固醇，1.5g半胱氨酸，和2g吐温80完全溶于48ml无水乙醇中，在40℃水浴除去无水乙醇，形成均匀的薄膜，加入90gpbs磷酸盐缓冲液洗膜，于60℃恒温搅拌30min，bpt匀质机高速剪切3次，高压微射流于140mpa微流化处理得dsb的脂质体。
将牛ⅱ型胶原溶解于ph3.5的冰醋酸溶液中(ⅱ型胶原终浓度为2mg/ml)，与完全弗氏佐剂反复乳化，制成含牛ⅱ型胶原1mg/ml的乳化液。sd大鼠麻醉后，分5点(背部三点、尾根部、及任一后足掌)皮内注射上述免疫混合物各0.1ml。初次免疫1周后，加强免疫1次。造模后第2周，分别灌胃给予化合物dsb(50mg/kg、25mg/kg和12.5mg/kg)的脂质体和阳性药保泰松(50mg/kg)，连续给药3周，测定关节肿胀度，测定血清tnf-α与il-1的表达水平。
实验结果：
sd大鼠免疫后第3周，关节呈现明显红肿，第5周其关节肿胀度由正常组的0.57±0.05cm增加至1.13±0.04cm。而dsb药物各组与阳性对照组均可减弱大鼠的关节肿胀程度，且dsb药物的抑制作用呈现出明显的剂量依赖性。相比同等剂量的阳性药保泰松(0.82±0.04cm)，dsb的抗炎效果较强(0.71±0.08cm)。
如图5所示：胶原诱导型关节炎大鼠血清炎症因子tnf-α和il-1会显著升高，化合物dsb和阳性药均可降低炎症因子的表达水平，且dsb50mg/kg和25mg/kg剂量组相比模型组具有显著性差异，而相比同等剂量的阳性药保泰松，dsb的抑制效果更强。
实施例11：化合物4-(5-二甲氨基-1-萘)磺酰氧基苯并噁唑2-酮(dsb)的小鼠急性毒性实验
急性口服毒性是指动物经口接受单剂量或在24h内接受多次剂量受试物，动物在短期内出现毒性反应的试验。对于低毒的受试物，可采用经口给予5g/kg，观察14d，如果无动物死亡，则无必要进行更高剂量的实验。
化合物dsb混悬液的制备：取化合物的粉末置于研钵中，研磨均匀后加入0.5％cmc-na制成终浓度为200mg/ml的混悬液，经旋窝混悬器充分匀浆后即可直接使用。
昆明小鼠16只，雌雄各半，体重18-22g，实验前禁食12h。随机分为药物组和对照组，分别灌胃给予化合物5000mg/kg和空白溶剂(0.5％cmc-na)。给药后连续观察14d，记录动物反应情况及死亡数量，参考世界卫生组织(who)颁布的“化学物质急性毒性分级标准”，对化合物的毒性作出评价，并计算最大耐受量(mtd)。
实验结果：
小鼠口服5000mg/kg剂量，动物均未出现死亡。当给药后1-5天，动物出现不同程度的体重减轻现象，且应激性降低，行为安静，上述症状于5-8天后消失。因此，按照who颁布的毒性分级标准，该化合物属于基本无毒的等级，且其最大耐受量>5000mg/kg。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。