本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种喹啉类衍生物5,7-二溴-8-(甲氧甲氧基)-2-甲基喹啉在治疗乳腺癌中的应用，此化合物简称dbmmq。
背景技术：
在世界范围内，乳腺癌是女性中发病率和死亡率最高的癌症(每年接近有170万新发病例，死亡人数也超过50万)，也是我国死亡率最高的恶性肿瘤之一。根据肿瘤登记数据显示，近十年来，中国城乡乳腺癌发病率呈持续上升趋势，且农村地区上升幅度较城市地区更快。尽管手术、放射治疗和化学治疗在内的治疗方法可以有效地增加治愈率或提高总体生存率，但它仍然是妇女死亡率最高的疾病之一。癌症的常规临床治疗方法虽然可以成功地治疗某些局部恶性肿瘤，但患者的死亡通常是由肿瘤的侵袭和转移导致的，且许多抗肿瘤药物的毒副作用也影响着癌症的治疗效果；同样，在乳腺癌治疗中也存在类似的问题。因此，开发具有较低毒性的、更具针对性的抗乳腺癌药物刻不容缓。
迁移和侵袭是乳腺癌的一个典型特征，导致乳腺癌发生扩散和转移。癌细胞通过淋巴管、血管等循环途径，转移至脑、肺等组织和器官，形成转移灶，是导致乳腺癌高死亡率的重要原因。因此，抑制癌症的侵袭和迁移有望成为一种潜在的乳腺癌治疗策略，同时寻找有效抑制肿瘤细胞迁移和侵袭的化合物也成为众多科研工作者努力的方向。
喹啉类化合物及其衍生物作为含氮杂环化合物中非常重要的一类，表现出广泛的抗菌、抗炎、抗病毒、抗癌等生物活性，且此类化合物比较稳定和易于合成，因而成为药物设计的理想结构，引起越来越多的关注。
技术实现要素：
鉴于当前乳腺癌治疗不理想，本发明的目的是从一系列合成的喹啉类衍生物中筛选能治疗乳腺癌的化合物，以期该化合物具有较高的抗乳腺癌活性，包括能够显著抑制乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭以及诱导乳腺癌细胞凋亡。
为了达到上述目的，本发明通过以下技术方案予以实现。
本发明提供一种喹啉类衍生物可用于治疗乳腺癌，该化合物为5,7-二溴-8-(甲氧甲氧基)-2-甲基喹啉或其药用盐，该化合物简称dbmmq，结构式为：
本发明涉及的5,7-二溴-8-(甲氧甲氧基)-2-甲基喹啉或其药用盐在治疗乳腺癌中的应用，具体的，5,7-二溴-8-(甲氧甲氧基)-2-甲基喹啉药用盐是指药学上可接受的盐，既包括与无机酸如磷酸、盐酸、硫酸形成的盐，也包括与有机酸如柠檬酸、酒石酸形成的盐。
本发明涉及的5,7-二溴-8-(甲氧甲氧基)-2-甲基喹啉在治疗乳腺癌中的应用，具体的，5,7-二溴-8-(甲氧甲氧基)-2-甲基喹啉能显著抑制乳腺癌细胞增殖。
本发明涉及的5,7-二溴-8-(甲氧甲氧基)-2-甲基喹啉在治疗乳腺癌中的应用，具体的，5,7-二溴-8-(甲氧甲氧基)-2-甲基喹啉能显著诱导乳腺癌细胞凋亡。
本发明涉及的5,7-二溴-8-(甲氧甲氧基)-2-甲基喹啉在治疗乳腺癌中的应用，具体的，5,7-二溴-8-(甲氧甲氧基)-2-甲基喹啉能显著抑制乳腺癌细胞迁移。
本发明涉及的5,7-二溴-8-(甲氧甲氧基)-2-甲基喹啉在治疗乳腺癌中的应用，具体的，5,7-二溴-8-(甲氧甲氧基)-2-甲基喹啉能显著抑制乳腺癌细胞侵袭。
本发明同时提供了5,7-二溴-8-(甲氧甲氧基)-2-甲基喹啉的制备方法，具体步骤是：
(1)称取0.02mol2-甲基-8-羟基喹啉溶解于30ml甲醇于100ml两颈圆底烧瓶中，再加入0.04mol碳酸氢钠搅拌；将含0.06molbr2的10ml甲醇溶液缓慢地加入瓶中，混合物搅拌30min，然后加入0.17molna2so3固体淬灭反应，混合物抽滤，滤液倒入水中搅拌30min，抽滤真空干燥得白色产物5,7-二溴-2-甲基-8-羟基喹啉。
(2)控制温度为0℃，将含0.01mol步骤(1)制备的5,7-二溴-2-甲基-8-羟基喹啉四氢呋喃溶液缓慢地滴加至0.0417molnah的四氢呋喃悬浮液中，滴加完毕后保持0℃继续搅拌0.5h，然后将0.035mol氯甲基甲醚慢慢加入其中，然后恢复室温搅拌12h；待反应结束后，过滤，将滤液倒入水中，用dcm萃取三次，用无水na2so4干燥2h，过滤后减压蒸去溶剂，得到粗产品；最后用体积比1:1的dcm/石油醚作为洗脱剂柱分离出目标产物：5,7-二溴-8-(甲氧甲氧基)-2-甲基喹啉。
与现有的技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明所述的化合物5,7-二溴-8-(甲氧甲氧基)-2-甲基喹啉是从合成的一系列喹啉类衍生物中筛选出的活性最高的化合物，且该化合物在乳腺癌中的活性从未有报道。
2、本发明所涉及的化合物5,7-二溴-8-(甲氧甲氧基)-2-甲基喹啉能明显抑制乳腺癌细胞的增殖，且能诱导乳腺癌细胞发生显著的凋亡；划痕实验及transwell实验显示此化合物能抑制具有高迁移能力乳腺癌细胞的迁移和侵袭。上述结果表明，本发明所述化合物dbmmq具备较好的抗乳腺癌活性，在今后乳腺癌的治疗方面具备潜在的应用价值。
3、本发明所述的化合物5,7-二溴-8-(甲氧甲氧基)-2-甲基喹啉合成方法简单、高效，具有潜在的药物开发前景。
4、本发明所述的化合物5,7-二溴-8-(甲氧甲氧基)-2-甲基喹啉可作为乳腺癌药物开发的先导化合物，可通过进一步结构改造开发出活性更高的抗乳腺癌药物。
附图说明
图1dbmmq的制备方法原理图。
图2dbmmq对乳腺癌细胞mcf-7的生长抑制作用。
图3dbmmq对乳腺癌细胞mda-mb231的生长抑制作用。
图4dbmmq诱导乳腺癌细胞发生显著的凋亡；
图中*表示p值<0.05，具有统计学意义。
图5dbmmq抑制高转移性乳腺癌细胞mda-mb231的迁移；
图中**表示p值<0.01，具有统计学意义。
图6dbmmq抑制高转移性乳腺癌细胞mda-mb231的侵袭；
图中***表示p值<0.001，具有统计学意义。
具体实施方式
以下结合附图，通过实施例对本发明做进一步详细的说明，给出的实施例是为了阐述本发明，而不是限制本发明的应用范围。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的方法均为常规方法，所用的试剂、材料均可从公司购买。
实施例1：5,7-二溴-8-(甲氧甲氧基)-2-甲基喹啉的制备方法
称取2-甲基-8-羟基喹啉(3.18g，0.02mol)溶解于30ml甲醇于100ml两颈圆底烧瓶中，再加入碳酸氢钠(3.18g，0.04mol)搅拌。将br2(3.2ml，0.06mol)的甲醇(10ml)溶液缓慢地加入瓶中，混合物搅拌30min，然后加入na2so3(22g，0.17mol)固体淬灭反应，混合物抽滤，滤液倒入水中搅拌30min，抽滤真空干燥得白色产物5,7-二溴-2-甲基-8-羟基喹啉。
取含5,7-二溴-2-甲基-8-羟基喹啉(3.15g，0.01mol)的四氢呋喃溶液，控制温度为0℃，缓慢地滴加至nah(1.0g，0.0417mol)的四氢呋喃悬浮液中，滴加完毕后保持0℃继续搅拌0.5h，然后将氯甲基甲醚(2.7ml，0.035mol)慢慢加入其中，然后恢复室温搅拌12h。待反应结束后，过滤，将滤液倒入水中，用dcm萃取三次，用无水na2so4干燥2h，过滤后减压蒸去溶剂，得到粗产品。用dcm/石油醚(1:1)作为洗脱剂柱分离出目标产物(5,7-二溴-8-(甲氧甲氧基)-2-甲基喹啉)，参见图1所示。
实施例2：乳腺癌细胞的培养和传代
实验所用到的mcf-7以及mda-mb231乳腺癌细胞均使用含有10％的胎牛血清，100u/ml青霉素及100μg/ml链霉素的dulbecco'smodifiedeaglemedium(dmem)培养基培养，培养条件为：37℃，5％co2。随时观察细胞生长状态，一般密度长至80％及以上时可进行细胞传代，传代方法如下：
(1)先用磷酸盐缓冲液pbs将细胞洗一次，然后加入适量胰蛋白酶消化细胞，至细胞变圆可脱落为止。
(2)用2倍体积的新鲜培养基中和胰酶，将细胞悬液收集至离心管中。
(3)离心获得细胞沉淀，800-1000转/分钟，离心5分钟。
(4)用新鲜的培养基重悬细胞，按1:3至1:4传至新的培养皿中。
实施例3：利用mtt方法筛选具有潜在抗乳腺癌活性的喹啉类衍生物
具体操作步骤为：
(1)将处于对数生长期的细胞用胰蛋白酶消化收集，用含10％胎牛血清的dmem培养基重悬，反复吸打混匀，配成单细胞悬液。
(2)细胞计数：用血球计数板进行细胞计数，配置密度为8×104个/ml左右的细胞悬液。
(3)细胞接种：将细胞接种到96孔板中，每孔100μl细胞悬液。
(4)细胞培养：将96孔板放入co2培养箱，在37℃、5％co2及饱和湿度下培养细胞，过夜待细胞贴壁。
(5)化合物处理细胞：配置不同浓度梯度的化合物(分别为0μm,2.5μm,5μm,10μm,25μm,50μm)，将96孔板中培养基吸掉，每孔加入100μl不同浓度的药物溶液，并设置不含细胞只含有dmem培养基作为空白对照组，每个浓度设3个重复，细胞培养箱中继续培养。
(6)培养44小时后，于每孔中加入10μlmtt溶液(5mg/ml)，培养箱中继续培养4小时。
(7)吸掉培养基，每孔加入150μl二甲基亚砜(dmso)，充分溶解反应生成的蓝紫色结晶甲瓒。在酶标仪上设置波长为490nm，振荡5分钟，读取od值，保存数据。
(8)统计学处理：
细胞存活率(％)＝(给药孔od值-空白对照孔od值)/(对照孔od值-空白对照孔od值)×100％
用graphpadprism6.0计算半数抑制浓度(ic50)。
利用mtt方法对合成的喹啉类衍生物进行筛选，结果如表1所示，衍生物hq-9具有较好的抗乳腺癌活性，即本发明所述化合物5,7-二溴-8-(甲氧甲氧基)-2-甲基喹啉，简称dbmmq，进一步的验证实验显示，dbmmq能剂量依赖性抑制mcf7乳腺癌细胞的生长(见图2)，且该化合物对其它乳腺癌细胞如mda-mb231也有显著的生长抑制作用，结果参见图3。
表1喹啉衍生物对乳腺癌细胞mcf7的ic50值
实施例4：dbmmq诱导乳腺癌细胞发生明显的细胞凋亡
在检测了化合物dbmmq对乳腺癌细胞的生长影响后，我们进一步探讨此化合物是否能引起乳腺癌细胞的凋亡。首先，我们采用免疫印迹方法分析化合物处理后细胞中凋亡相关蛋白的表达变化。
免疫印迹具体步骤如下：
mcf和mda-mb231细胞经化合物处理48小时后，用ripa裂解液提取细胞中总蛋白。蛋白定量后，等量的蛋白样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后通过湿转法将凝胶上的蛋白样品转印到硝酸纤维素膜上，接着对膜用5％的脱脂奶粉进行室温封闭1小时，而后孵育抗parp、caspase9的一抗(德国cst公司)置4℃过夜，用含1‰的吐温-20的tbs(tbs-t)溶液洗膜4次，接着孵育一抗对应的二抗，室温孵育2小时，最后通过高灵敏度化学发光检测试剂盒(eeclwesternblotkit，北京康为世纪生物科技有限公司)进行显影，得到蛋白条带。
结果如图4所示，乳腺癌细胞mcf7和mda-mb231经化合物dbmmq处理48小时后，细胞凋亡过程中关键蛋白caspase9及parp发生明显的切割，提示细胞走向凋亡途径，且有可能与caspase的激活有关。进一步，我们用caspase的抑制剂z-vad与化合物联合处理细胞，结果显示，z-vad明显抑制了dbmmq诱导的细胞凋亡，说明dbmmq确实引起了乳腺癌细胞mcf7和mda-mb231的凋亡。
实施例5：化合物dbmmq对高转移性乳腺癌细胞mda-mb231迁移和侵袭的影响
抑制乳腺癌的转移对于提高乳腺癌的治疗效果非常重要，因此，我们以高转移性乳腺癌细胞mda-mb231为模型，检测本发明所述化合物dbmmq对mda-mb231迁移和侵袭能力的影响。
首先利用划痕实验检测dbmmq对mda-mb231细胞迁移能力的影响。
具体步骤如下：
(1)将mda-mb231细胞以4×105/孔的密度传至六孔板中，培养过夜，直至细胞长至90％的密度。
(2)用200μl的移液枪枪头对每个孔的细胞进行划痕，之后用pbs将脱落的细胞洗去
(3)配置含有25μm化合物的无血清培养基溶液，然后加入细胞中，并设置不含化合物的溶剂对照孔。
(4)0小时在倒置显微镜下进行拍照，并做好位置标记。
(5)细胞培养48小时后，对相应位置的划痕情况进行拍照。
结果如图5所示，化合物dbmmq明显抑制了高转移性乳腺癌细胞mda-mb231的迁移，p<0.01，差异显著。
接着，我们进一步通过trans-well实验探讨了dbmmq对mda-mb231细胞侵袭能力的影响。
具体步骤如下：
包被和水化基底膜：先用基质胶(50mg/lmatrigel1:8稀释液)包被transwell小室(poresize,8μm；costar,cambridge,ny,usa)底部膜的上室面，4℃风干，吸出孔板中残余液体，每孔加入50ul含10g/lbsa的无血清培养液，于37℃培养箱中水化30分钟。
制备细胞悬液：用胰酶消化mda-mb231细胞，配制成密度为2×105/毫升的细胞悬液，然后加入化合物dbmmq至终浓度为25μm，室温孵育30分钟。
接种细胞：取100μl细胞悬液加入transwell小室中，24孔板下室对应加入650μl不含或含有25μm化合物的培养基溶液，此过程中注意上层小室和下层培养液之间不能有气泡。将孔板置于细胞培养箱中继续培养48小时。
结果统计：用棉球擦去小室上层细胞，弃孔中培养基，用pbs快速洗小室3次，然后下孔中加入500μl甲醇，小室加入200μl甲醇固定细胞10分钟。丢弃孔中固定液，pbs洗小室3次，并将小室中残余pbs吸取干净。用0.2％的结晶紫染液对小室下层的细胞进行染色10-15分钟，然后用33％醋酸溶液洗脱结晶紫，在酶标仪上测定洗脱液(波长570nm)的吸光值。
如图6所示，化合物dbmmq处理下，侵袭至小室下层的细胞明显减少，且其对应洗脱液的od值明显降低，p<0.001，具有统计学意义上的差异。此结果表明，dbmmq能显著抑制高转移性乳腺癌细胞mda-mb231的侵袭能力。