本发明属于生物医学领域，涉及LINC00426在制备骨肉瘤转移诊断产品、治疗药物中的用途。
背景技术：
骨肉瘤是来源于间叶组织的恶性肿瘤，其主要致病特征为体内增殖的肿瘤细胞直接形成未成熟骨或骨样组织。是一种人类骨骼系统最常见的原发性恶性肿瘤。典型的骨肉瘤是一种罕见的(占全部恶性肿瘤的0.2％)高致癌恶性肿瘤，其发病率约每年每一百万人里有三例。骨肉瘤主要出现在较长的骨骼以及少部分的软组织。其主要发病人群集中在10～20岁青少年，具有发病率高，早期转移率高，治愈生存率低等特点。X-射线，断层摄影技术，核磁共振，血管造影技术以及动态骨闪烁摄影技术等广泛应用于该病的诊断、肿瘤发生的程度及手术类型判断等等。但是利用上述临床手段进行骨肉瘤的诊断，常常导致患者的病情延误，错过最佳治疗时期。因此寻找一种骨肉瘤早期诊断标志物是亟待解决的问题。
人体中编码蛋白质的基因大约有2-3万个，仅占人类基因组的2％，其余98％不编码蛋白质的基因组DNA最初被认为是没有功能的，是生物体中的垃圾，通常被称为“垃圾DNA”。但目前的研究表明，这些垃圾DNA大多可转录产生非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)。根据成熟转录本大小的不同，ncRNA可分为小分子ncRNA(如siRNA，miRNA，piRNA等)，中等长度ncRNA(70-200nt)和长ncRNA(long ncRNA，LncRNA，>200nt)。
目前，ncRNA领域研究较多的是小分子ncRNA，而对LncRNA的研究还处于起步阶段。由于序列内部存在过多的终止密码子，LncRNA不能被翻译成蛋白质，他们通常是以RNA转录本的形式行使其生物学功能，如发育过程中的细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡和类固醇代谢等。
最近的研究发现LncRNA与肺癌、非霍杰金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病等肿瘤疾病有关。这表明LncRNA与细胞的癌变有着极为密切的联系，LncRNA在细胞增殖、分化和癌变中发挥着重要的作用。目前，已经克隆的人类lncRNAs基因已超过4万多个，但绝大部分lncRNA的功能未知。
目前，有关LncRNA在骨肉瘤的发病机制、疾病诊断及治疗方面的研究基本空白，因此本申请利用生物信息学分析研究探讨LncRNA在骨肉瘤的发病机制、疾病诊断及治疗方面的的作用，同时为后续深入研究提供实验基础及研究方向。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种用于诊断骨肉瘤转移的长链非编码RNA标志物。本发明利用实验证明LINC00426在骨肉瘤转移病灶组织中的表达水平明显高于在骨肉瘤原发病灶组织中的水平，因此可以将LINC00426作为诊断骨肉瘤转移的分子标志物。
为了实验上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了检测长链非编码RNA表达的试剂在制备骨肉瘤转移诊断产品中的应用。
本发明的长链非编码RNA在NCBI中的命名为LINC00426，其基因ID：100188949，LINC00426的转录本序列是Genbank登录号NR_024464.2(具有1608bp的长度，相应的DNA序列如SEQ ID NO.1所示)。
进一步，所述试剂包括利用SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测LINC00426表达量时使用的PCR扩增引物。
在本发明的具体实施方案中，所述引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
本发明提供了一种用于骨肉瘤转移诊断的产品，所述产品包括检测LINC00426表达水平的试剂。
进一步，所述试剂包括SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测LINC00426表达量时使用的PCR扩增引物。
在本发明的具体实施方案中，所述引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
进一步，前面所述的产品包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断骨肉瘤转移的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的RNA表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病转移患者和非转移人群的RNA表达谱，容易分析出哪个RNA的异常与疾病转移相关。因此，在高通量测序中获知LINC00426的异常与骨肉瘤转移相关也属于LINC00426的用途，同样在本发明的保护范围之内。
所述试剂盒包括检测LINC00426表达量的试剂，所述试剂包括与LINC00426或其DNA序列结合的核酸，所述核酸包括SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测LINC00426表达量时使用的PCR扩增引物。
所述芯片包括检测LINC00426表达量的试剂，所述试剂包括与LINC00426或其DNA序列结合的核酸，所述核酸包括能够检测LINC00426表达量的探针。
所述试纸包括检测LINC00426表达量的试剂，所述试剂包括与LINC00426或其DNA序列结合的核酸，所述核酸包括能够检测LINC00426表达量的探针。
本发明提供了一种用于抑制骨肉瘤转移的药物组合物，所述药物组合物包括LINC00426的抑制剂。
进一步，所述抑制剂不受限制，只要是可以抑制LINC00426表达水平或抑制LINC00426功能活性即可。
所述抑制剂包括LINC00426的siRNA或shRNA。
本发明的药物组合物可以作为医药单独施用或与其它药物一起施用。可以与本发明的药物组合物一起施用的其它药物不受限制，只要它不损害本发明的治疗性或预防性药物组合物的效果即可。
本发明的药物组合物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。
本发明的药物组合物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。
本发明的药物组合物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物组合物或预防药物组合物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。
本发明还提供了前面所述的抑制剂在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用。
本发明还提供了一种诊断骨肉瘤转移的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)获取骨肉瘤患者的样品；
(2)检测骨肉瘤患者样品中LINC00426的表达水平；
(3)将测得的LINC00426的表达水平与骨肉瘤患者肿瘤病灶转移与否关联起来；
(4)与非转移骨肉瘤患者相比，LINC00426的表达水平升高，则该骨肉瘤患者被判断已发生转移。
本发明还提供了一种骨肉瘤转移的抑制方法，所述方法包括降低LINC00426表达量或者抑制LINC00426的功能活性。
本发明还提供了一种治疗骨肉瘤的药物的筛选方法，可以通过在对骨肉瘤细胞添加测试药物后的某个时期测量LINC00426的表达水平来测定肿瘤药物改善肿瘤迁移或侵袭的效果。更具体地说，当LINC00426的表达水平在添加或施用测试药物后降低时或者恢复正常水平时，可选择该药物作为治疗骨肉瘤的治疗药物。
本文所用的“治疗”涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的疾病或疾病状态，并且包括：
(1)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾病状态，但尚未被诊断出患有这种疾病状态时；
(2)抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生；或者
(3)缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退。
术语“治疗”通常涉及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用)，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止)、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施(例如预防)的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途，也包括在术语“治疗”中。
本发明的优点和有益效果：
本发明的发现了一种诊断骨肉瘤转移的分子标志物，使用该分子标志物可以在骨肉瘤已经发生转移的早期即可作为判断，提高了患者的生存率。
本发明的包括LINC00426的抑制剂的治疗药物可用作新的治疗骨肉瘤的治疗药物。
附图说明
图1显示利用QPCR检测LINC00426在骨肉瘤转移病灶组织和骨肉瘤原发病灶组织中表达情况的统计图。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选差异表达非长链编码RNA
1、样本采集与临床信息
原发组：骨肉瘤原发病灶；转移组：骨肉瘤转移病灶，转移部位为肺部。临床信息见表1。
表1临床信息表
2、组织RNA总提取
2.1组织匀浆
取约50mg组织样品放入高温灭菌处理后的研钵内，加入的1ml的Trizol溶液，充分研磨组织用移液枪移入1.5ml的离心管内，颠倒混匀10下，室温静置10分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。
2.2分离阶段
4℃，12000rpm离心5-10分钟，取上清。离心得到的沉淀包含细胞外膜、多糖、高分子，上清液中含有RNA。取澄清的匀装溶液加入0.2ml的氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15秒，使其充分混勻，室温静置5分钟。再次4℃，12000rpm离心10min，样品会分成三层，RNA主要在上层水相中，将上层水相转移到新管的新管内(约500μL)，注意不要吸到中间层和下层液体，否则会造成DNA和蛋白污染。
2.3RNA沉淀
在新管内加入0.5ml预先冷冻的异丙醇，混匀后放置于-20℃中30分钟，后4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清。离心前RNA沉淀经常不可见，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。
2.4RNA洗涤
小心倒掉上清，留取沉淀。加入1ml的75％乙醇(用DEPC水配制)，涡旋振荡混匀样品洗涤沉淀RNA，如不能涡旋混匀，可用手动剧烈颠倒混匀2分钟。然后4℃，7000rpm离心5分钟。
2.5RNA再溶解
离心后小心弃上清，可用移液器小心吸取上清，注意不要吸到沉淀。室温晾置10分钟左右干燥RNA沉淀，注意不要让RNA沉淀完全干燥以免降低RNA的溶解性。最后用适量的DEPC水溶解沉淀，待完全溶解后分成小份-70℃保存或者立即进行逆转录。
3、RNA质量检测
使用NanoDropND-1000型紫外分光光度计测定组织总RNA的浓度和纯度。
4、组织总RNA完整性测定
经1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，紫外透射光下观察，检测RNA的完整性。
5、Agilent2100测定RIN值。
lncRNA测序要求：样品需求量：≥200ng；样品浓度：C≥20ng/μL；样品纯度：RIN≥7.0，28S/18S≥1.0。
6、去除rRNA
细胞内一部分(>24％)的长链非编码RNA都是缺少传统poly A尾的，因此采用去除rRNA的方式建库可以获得更加全面的lncRNA信息。
7、片段化RNA
Illumina平台是针对短序列片段进行测序，去除rRNA得到的mRNA和lncRNA是完整的RNA序列，平均长度可能达几kb，因此需要对其进行随机打断。利用金属离子，可以将RNA随机断裂成200bp左右的小片段。
8、反转合成cDNA
在逆转录酶的作用下，利用随机引物，以mRNA为模板反转合成一链cDNA，进行二链合成时，dNTPs试剂中用dUTP代替dTTP，使cDNA第二链中碱基包含A/U/C/G。
9、连接adaptor
双链的cDNA结构为粘性末端，加入End Repair Mix将其补成平末端，随后在3’末端加上一个A碱基，用于连接Y字形的接头。
10、UNG酶消化cDNA二链
在PCR扩增前，用UNG酶将cDNA第二链消化，从而使文库中仅包含cDNA第一链。
11、Illumina Hiseq2500上机测序
Illumina Hiseq2500测序平台，进行2*150bp测序。
12、数据下机质控与数据分析简要流程
12.1测序数据下机质量如表2所示。
表2测序数据下机质量统计表
12.2lncRNA分析过程：
(1)tophat比对到参考基因组上，参考基因组来自于Ensembl V84，结果见表3。
表3Clean Data与参考基因组比对结果统计表
(2)cuffquant定量lncRNA的表达量并标准化输出；
(3)cuffdiff包比较两组之间lncRNA的表达差异。
13、结果
筛选标准：P<0.01，abs(log2(fold change))>2，共筛选出50个差异表达lncRNA，其中27个上调，23个下调。
实施例2大样本验证筛选出的差异表达LncRNA
基于实施例1的筛选结果，根据P value的大小，选择LINC00426进行验证。
1、样本收集
按照实施例1的方法骨肉瘤原发病灶组织36例，骨肉瘤转移病灶组织33例。
2、在转录水平上进行验证
试剂：反转录试剂盒(DDR037A)购自宝生物工程(大连)有限公司。荧光实时(Real-time)定量PCR(polymerase chain reaction)所用的SYBR Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)试剂盒为日本Takara公司生产。
2.1提取组织RNA
步骤同实施例1。
2.2引物设计
根据LINC00426转录本序列，通过NCBI的引物设计工具(PRIMER BLAST)设计引物，上游引物：5’-CCACCCCAGTAAATCACCCG-3’(SEQ ID NO.2)；下游引物：5’-GCCCTGATGCAAGAGGAACA-3’(SEQ ID NO.3)。
根据SnU6序列设计引物，上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3’(SEQ ID NO.4)；5’-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3’(SEQ ID NO.5)。
2.3cDNA合成
以提取的总RNA(1μg)为模板，加入以下反应体系，具体为：Buffer 4μL，RT Enzyme Mix 1μL，Oligo dT Primer(50μM)1μL，Random 6mers(100μM)1μL，以无RNA酶的ddH2O将反应体积补足为20μL。将上述混合液置于37℃15min，85℃5s，即获得cDNA。该cDNA可用于lncRNA Real-time PCR检测。
2.4Real-time PCR
按日本Takara公司的Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)试剂盒推荐的引物最适浓度(10μM)，将LINC00426引物以去离子水溶解，并建立以下反应体系：SYBR Premix Ex TaqTM(2×)25μL，ROX Reference Dye(50×)1μL，PCR上游引物(10μM)1μL，PCR下游引物(10μM)1μL，cDNA 4μL，灭菌ddH2O 18μL。以95℃10s预变性，按95℃5s变性、60℃20s退火、70℃10s延伸过程循环40次，获得Ct值。结果釆用相对定量法，运用公式2-△△ct计算。实验重复3次。
3、结果
结果如图1显示，与骨肉瘤原发病灶组织相比，骨肉瘤转移病灶组织中LINC00426表达水平显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 谢琳
<120> LINC00426在制备骨肉瘤转移诊断产品中的用途
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1608
<212> DNA
<213> 人源(Homo sapiens)
<400> 1
actcggccat gaaagtcttt gaaggtgggg aaggggtgaa gatggtgagg ggattccacg 60
gctgggagag gtacactccc tacacgttct aaccaactgg ccgtggggag gaagctggag 120
gtcaggacac agcaaatggg ggatctcaga agtcttaatg aagtaactat ccctgaacac 180
tgggatcaat actcagcatc cagctgtcaa atcaacacca agcgtttcac tcgtcgccca 240
gcctagagtg caatggcgct atttcggctc attataacct ccgcctcccg ggttcaagca 300
attcttctgc ttcagcgtcc caagtagctg ggattacagc cgcctcctgg agcagattgt 360
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gcagttctgc agcttatcag gggtctactg ggaagtgaga tgtcactgtc cctttctggc 1380
cctgcattgt ctgtgagtgg ctctcctgga ttaagagttg gcaaagtatg gccagtggcc 1440
aggactggcc tgctgcctgt ttttgtttaa cccgtgagct aagaatagtt tttacctatt 1500
ttaagtagtt gaaaaaaaaa tcaagagaag aatactattt cgtgatatgt gaaaaatcac 1560
atgaaattca aatgtaagtg tccataaata aagtcttact ggaagaca 1608
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccaccccagt aaatcacccg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gccctgatgc aagaggaaca 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctcgcttcgg cagcacatat act 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acgcttcacg aatttgcgtg tc 22