本发明属于生物医药领域，涉及骨肉瘤转移相关标志物ENSG00000267886及其应用。
背景技术：
骨肉瘤(Osteosarcoma，OS)是一种恶性度较高的原发性骨肿瘤。尽管有着激进的标准治疗外科技术和联合化疗方案，其仍是一种快速进展且整体预后不良的毁灭性疾病。OS是多细胞成分的肿瘤，源自于原始的间充质细胞，由于分化方向不同而导致有多种类型的细胞出现。OS的主要成分是肿瘤性成骨细胞及肿瘤性骨样组织和肿瘤骨，此外还有肿瘤性软骨组织和显微组织，不难看出其特点为瘤细胞直接形成骨样组织，故其亦被称为成骨肉瘤，然而肿瘤的成骨过程不明显者也不能排除OS的发生。在原发性骨肿瘤中，OS的发病率跃居第二位，仅次于浆细胞骨髓瘤，是最常见的恶性骨肿瘤。
转移和复发是骨肉瘤恶化的主要病理难题，它不但明显降低了临床疗效而且给病人带来很不利的后果。据统计，有90％的患者在接受化疗前就已经出现了肺转移，而尽管采用多种药物治疗只有20％的患者可以被治愈，因此骨肉瘤的高转移率是要取得临床疗效必须解决的一大挑战，为此我们更好地去了解肿瘤侵袭、迁移和转移的潜在机制将变得十分有帮助。
近年来，随着生物学技术的发展，探究骨肉瘤发生发展的机制成为骨肉瘤研究的热点，如专利CN201510075917.2、CN 201510075920.4、CN201510075918.7、CN201510075919.1中就公开了与骨肉瘤发生发展相关的基因。随着对基因的进一步研究，人们发现一直以来被人们认为是基因噪音的lncRNA具有重要的调控作用，lncRNA会通过参与细胞生长，增殖，侵袭，迁移，转移和凋亡来促进骨肉瘤的生长过程，而这些研究结果表明具有潜在性临床价值的长链非编码RNA可以作为有效诊断和治疗骨肉瘤的靶点，但它们之中还有很多具体的作用机制未被挖掘出来，因此深入研究长链非编码RNA在骨肉瘤中的潜在价值具有重要的意义。
技术实现要素：
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与骨肉瘤转移相关的基因标志物，将其应用到临床中，从而实现骨肉瘤转移的诊断，进行有效干预，提高患者的生存率和生存质量。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了ENSG00000267886基因的应用，用于制备诊断骨肉瘤是否发生转移的产品。
进一步，所述产品包括检测样本中ENSG00000267886表达水平的试剂。
进一步，ENSG00000267886在转移的骨肉瘤中表达上调。
进一步，所述试剂包括通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片技术检测ENSG00000267886表达水平的试剂。
进一步，所述通过RT-PCR检测ENSG00000267886表达水平的试剂至少包括一对特异扩增ENSG00000267886基因的引物；所述通过实时定量PCR检测ENSG00000267886表达水平的试剂至少包括一对特异扩增ENSG00000267886基因的引物；所述通过原位杂交检测ENSG00000267886表达水平的试剂包括与ENSG00000267886基因的核酸序列杂交的探针；所述通过芯片技术检测ENSG00000267886表达水平的试剂包括与ENSG00000267886基因核酸序列杂交的探针。
本发明提供了一种诊断骨肉瘤是否转移的产品，包括制剂、芯片或试剂盒，其中，所述制剂、芯片或试剂盒包括检测ENSG00000267886表达水平的试剂。
进一步，所述芯片中检测ENSG00000267886表达水平的试剂包括特异性识别ENSG00000267886基因的探针。
进一步，所述试剂盒中检测ENSG00000267886表达水平的试剂包括特异性扩增ENSG00000267886基因的引物；或特异性识别ENSG00000267886基因的探针。
进一步，所述特异性扩增ENSG00000267886基因的引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
进一步，所述试剂盒包括SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增管家基因的引物对，所述扩增管家基因的引物序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
在本发明中，所述诊断骨肉瘤的产品可用于检测包括ENSG00000267886在内的与骨肉瘤相关的多个基因和/或其表达产物的表达水平。多个基因联合诊断，可以增加骨肉瘤诊断的准确性。
附图说明
图1是利用QPCR检测ENSG00000267886基因在骨肉瘤转移与非转移组织中的表达情况图
具体的实施方式
本发明经过广泛而深入的研究，采用高通量测序技术，检测骨肉瘤标本中基因在肿瘤组织和癌旁组织的表达，发现其中具有明显表达差异的lncRNA，探讨其与骨肉瘤转移之间的关系，从而为骨肉瘤转移提供一种诊断途径。通过筛选，首次发现了发生骨肉瘤转移的患者中ENSG00000267886显著性下调。
ENSG00000267886基因
ENSG00000267886是位于人19号染色体上，本发明中的ENSG00000267886包括野生型、突变型或其片段。在本发明中，一种代表性的ENSG00000267886基因序列SEQ ID NO.1所示。
本发明的人ENSG00000267886核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。如RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片技术、高通量测序技术等，本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。
诊断产品
在本发明中，诊断骨肉瘤的产品可以是任何形式，包括(但不限于)芯片、制剂、试剂盒，只要其能够检测ENSG00000267886的表达水平即可。
术语“芯片”也称为“阵列”，指包含连接的核酸或肽探针的固体支持物。阵列通常包含按照不同的已知位置连接至基底表面的多种不同的核酸或肽探针。这些阵列，也称为“微阵列”，通常可以利用机械合成方法或光引导合成方法来产生这些阵列，所述光引导合成方法合并了光刻方法和固相合成方法的组合。阵列可以包含平坦的表面，或者可以是珠子、凝胶、聚合物表面、诸如光纤的纤维、玻璃或任何其它合适的基底上的核酸或肽。可以以一定的方式来包装阵列，从而允许进行全功能装置的诊断或其它方式的操纵。
“微阵列”是杂交阵列原件有序排列在基质上，所述杂交阵列原件诸如聚核苷酸探针(例如寡核苷酸)或结合剂(例如抗体)。所述基质可以是固体基质，例如，玻璃或二氧化硅玻片、珠、纤维光学粘结剂或半固态基质，例如硝酸纤维素膜。核苷酸序列可以是DNA、RNA或其中的任何排列。
各种探针阵列已经描述在文献中并且可以用于本发明上下文中检测可能与本文所述表型相关的标志物。例如，DNA探针阵列芯片或较大的DNA探针阵列晶片(否则，可以通过打断晶片而获得各个体芯片)用于本发明的一个实施方案。DNA探针阵列晶片一般包含玻璃晶片，其上放置了高密度DNA探针(短DNA片段)阵列。这些晶片各自可以保持例如约6000万个用于识别较长样品DNA序列(例如，来自个体或群体，例如，包含所关注的标志物)的DNA探针。用玻璃晶片上的DNA探针组识别样品DNA通过DNA杂交进行。当DNA样品与DNA探针阵列杂交时，样品结合于样品DNA序列互补的那些探针。通过评价个体样品DNA与那些探针更稳固地杂交，有可能确定已知的核酸序列是否存在于样品中，由此确定核酸中发现的标志物是否存在。还可以使用这一手段通过控制杂交条件以允许区别单一核苷酸，例如，用于SNP鉴定和一种或多种SNP的样品基因分型来进行ASH。阵列提供了一种同时(或串连)检测多个多态性标志物的便利性实施方案。
上述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA、LNA、ENA、GNA、TNA等人工核酸置换得到的多核苷酸。
本发明中的芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性识别ENSG00000267886。
具体地，可根据本发明所述的基因，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。
术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严格性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。
所述的ENSG00000267886芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的基因芯片。
本发明中所述固相载体可采用芯片领域的各种常用材料，例如包括但不限于塑料制品、微颗粒、膜载体等。
本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测ENSG00000267886的表达。优选的，所述的制剂或试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对肿瘤发展进行判断、对治疗方案进行选择。
试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1与骨肉瘤相关的基因标志物的筛选
1、样本的收集与临床信息
原发组：肿瘤原发病灶
转移组：肿瘤转移病灶，转移部位为肺部
患者的临床信息如表1所示。所有样本的收集经伦理委员会批准，患者知情同意。
表1患者临床信息
2、RNA样品的制备
利用Invitrogen公司的组织RNA提取试剂盒提取RNA样品，具体操作详见说明书。
3、RNA样品的质量分析
利用Nanodrop2000对所提取的RNA浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。浓度≥20ng/μl，OD260/280介于1.8～2.2之间。
4、高通量测序
1)使用Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA；
2)利用Illumina的Truseq RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建；
3)使用Hiseq2500测序平台对cDNA文库进行测序，每个样本的产出不低于10Gb的数据。
5、高通量转录组测序数据分析
1)将测序结果tophat比对到参考基因组上，参考基因组来自于Ensembl V84；
2)使用cuffquant定量lncRNA的表达量并标准化输出；
3)cuffdiff比较原发组与转移组的lncRNA表达差异，差异基因的筛选标准为P<0.01，abs(log2(fold change))>2。
6、结果
RNA-seq结果显示，与原发组相比，骨肉瘤转移组中的ENSG00000267886表达水平显著下调。
实施例2 QPCR验证差异表达的ENSG00000267886
1、根据高通量测序结果选择ENSG00000267886进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择肿瘤原发患者36例，肿瘤转移患者33例。
2、RNA提取
利用Invitrogen公司的组织RNA提取试剂盒提取RNA样品，具体操作详见说明书。
3、逆转录：
1)将10pg-1μg的总RNA模板与2μl 10×缓冲液、2μl dATP(10mM)、0.5μl polyA多聚酶、0.5μl核糖核酸酶(RNase)抑制剂和无核糖核酸酶水(RNase free water)混合，体积最后为20μl，37℃孵育1h。
2)反应管中加入1μl 0.5μg/μl Oligo(dT)特异性RT引物，70℃孵育5min。
3)立即冰上孵育至少2min，打断RNA和引物的二级结构。
4)将上述20μl反应混合物与4μl 5×缓冲液、1μl dNTP(10mM)，0.5μl M-MLV逆转录酶，0.5μl核糖核酸酶(RNase)抑制剂，10μl polyA反应混合液和4μl无核糖核酸酶水(RNase free water)混合，42℃孵育1h。
4、QPCR反应：
1)引物设计
扩增ENSG00000267886的引物
正向引物：TATGGAGGACTTTGTGAT(SEQ ID NO.2)
反向引物：GAATGATGTCATCTTAGTATTAG(SEQ ID NO.3)
扩增snU6的引物
正向引物：CTCGCTTCGGCAGCACATATACT(SEQ ID NO.4)
反向引物：ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC(SEQ ID NO.5)
2)配制25μl PCR反应体系：
SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，正(反)向引物1μl，cDNA模板2μl，ddH2O 8.5μl。
3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，以snU6作为参照基因，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
5、结果
如图1所示，与原发组相比，骨肉瘤转移组样本中的ENSG00000267886的表达水平显著下调，与高通量测序结果一致(P<0.05)，提示ENSG00000267886可以作为临床检测标志物用于骨肉瘤是否发生转移的判断。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 杨祚璋
<120> 骨肉瘤转移相关标志物ENSG00000267886及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 581
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atttggcggg gtctttgtct ctcgctcccg ccagagcttg ggatcggtct tcactgttcc 60
gcgtcctcta cctgggaacc accgaccccc gcccggcgac tttgtcacag actctgttgc 120
cctgtgatct gcaggtcctg ggagacgcac agccaagatg ccagggcacc ctggaagctg 180
tgaagtgttc agatgcataa tctcatccct gaacatcctg ctggtgcgat tatgacatat 240
gattttaccc agcaccagag ggatttgatg ctcctgcctg ggcccaactc acagaaggga 300
ttgtgacata tcactggacc cagcactgag gggacattgt gtaatatcgt tgggcctcac 360
acgtacgtta tgtgactctc ctgcgtgtgc cctgtccatg tgggccattg tgacatattg 420
ctgggtccaa caactggttg atgtagctct actgcctagg tcctgcctat ggaggacttt 480
gtgatgtatc cctgaaccca tcacacagat tctgccctca gaggacattg tgacatgtca 540
ctgggcctaa tactaagatg acatcattct ttagttttgg c 581
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tatggaggac tttgtgat 18
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaatgatgtc atcttagtat tag 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctcgcttcgg cagcacatat act 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acgcttcacg aatttgcgtg tc 22