心肌肌钙蛋白I特异性核酸适配体及其筛选方法和应用与流程

本发明涉及生物和医学领域，特别涉及一种可用于结合心肌肌钙蛋白i(cardiactroponini，ctni)的核酸适配体及其筛选方法和应用。
背景技术：
：心血管疾病是当今社会影响人类健康的重要疾病之一，而在心血管疾病中急性心肌梗死是造成患者死亡的重要原因。心肌损伤标志物异常是诊断心肌梗死的主要依据之一，所以现阶段有不少用于早期心肌损伤血清标志物的诊断试剂。肌钙蛋白(troponin，tn)是组成横纹肌细丝的结构蛋白，其亚单位i，t，c组成的复合物在肌肉收缩和舒张过程中起重要作用，其中，心肌肌钙蛋白i(cardiactroponini，ctni)是一种心肌的特异性蛋白，其对微小心肌损伤检测有特殊临床价值，正常时，循环中的ctni水平很低，当心肌细胞受到损伤后，ctni先于其它生化指标快速进入血液，在3-5小时内升高，随着损伤的加重，其在血液中的浓度不断升高，12-36小时内达到高峰，形成较长的时间窗。大量研究表明，ctni已被证实是心肌细胞损伤最特异和最敏感的血清标志物之一。因此，快速、敏捷且准确检测ctni具有重要的临床意义。目前ctni测定方法有酶联免疫法，固相免疫层析法，放射免疫分析法，化学发光分析法，胶体金法，免疫比浊法等，但是目前还没有统一的标准测定方法，不同厂家之间，不同方法结果差别较大，最多可差数十倍。很多方法存在不足，如酶联免疫法，固相免疫层析法，放射免疫分析法中都存在着操作繁琐，检测时间长，不适合大批量检测，结果重复性差，核素污染等问题；而胶体金法只能进行定性检测，不能定量检测。化学发光法虽具有准确，灵敏度高，特异性强，精密度好的优点，但其所用仪器和试剂价格昂贵，成本高，不适合基层实验室开展，同时不适用于急诊检验。核酸适配体(aptamer)是指通过指数富集的配基系统进化技术(selex)筛选分离得到的dna或者rna分子，它可以与其他靶标如蛋白质、金属离子、小分子、多肽甚至整个细胞进行高亲和力和特异性的结合，因此在生化分析，环境监测，基础医学，新药合成等方面展示广阔的前景。核酸适配体与抗体相比分子量小，稳定性更好，易改造修饰，无免疫原性，制作周期短，可以通过人工合成等优势，免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程。目前已经有一些研究者公布了他们所发现的一些ctni蛋白的核酸适配体序列，然而，这些ctni蛋白的核酸适配体存在一些缺点，例如，分子量大，针对ctni蛋白的结合亲和力不太高，特异性不高，稳定性不高，等等。因此，本领域对具有更高的针对ctni蛋白的结合亲和力的核酸适配体存在需求。技术实现要素：为了克服现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种具有高度特异性、分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记的能够结合ctni蛋白的核酸适配体及其衍生物，还相应提供所述核酸适配体的筛选方法与应用。为了解决上述技术问题，本发明人设计并合成了一个随机单链dna文库和相应的引物，用来筛选具有高度特异性、分子量小、化学性质稳定、易于保存和标记的能够结合ctni蛋白的核酸适配体，由此筛选得到一些特异性结合ctni蛋白的核酸适配体，并检测了它们与ctni蛋白的结合能力。在此基础上，本发明人完成了本发明。在第一方面，本发明提供一种筛选特异性结合ctni蛋白的核酸适配体的方法，所述方法包括以下步骤：(1)合成以下序列所示的随机单链dna文库和引物：随机单链dna文库：5’-ttcagcactccacgcatagc-40n-cctatgcgtgctaccgtgaa-3’其中，“40n”表示40个任意的核苷酸碱基连接而成的序列。5’端引物：5’-fam-ttcagcactccacgcatagc3’端引物：5’-(20a)-spacer18-ttcacggtagcacgcatagg其中，“20a”表示由20个腺苷酸(a)组成的polya尾，“spacer18”表示18原子的六乙二醇间臂。三种“spacer18”的结构式如下式i-iii所示。在上述3’端引物中所用的“spacer18”结构式如式i所示。(2)磁珠法筛选：使用edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；0.4m水溶液)和nhs(n-羟基琥珀酰亚胺；0.1m水溶液)两个试剂活化磁珠表面的羧基，ctni蛋白通过表面的氨基偶联到磁珠表面；将连有ctni蛋白的磁珠与经缓慢变复性处理的上述步骤(1)中随机核酸文库孵育1小时后用磁铁垂钓磁珠，去掉上清，用筛选缓冲液清洗磁珠6次，弃上清；将连有ctni蛋白的磁珠上结合的核酸加热分离作为筛选所得的核酸适配体一级文库；(3)扩增：将步骤(2)中筛选得到的文库进行乳浊液pcr(emulsionpcr，epcr)扩增，引物采用步骤(1)中提及的两种引物，得到的epcr扩增产物用正丁醇纯化；(4)制备dna单链文库：将步骤(3)中得到的产物加入变性缓冲液(生工生物工程(上海)股份有限公司：2xtbe-尿素样品缓冲液，货号：c506046)，变性10分钟使dna解链，完成后快速放入冰水混合物中，冰浴1分钟后离心，将所有的样品进行page胶电泳，使加长的一条链与有fam标记的链分开，切胶回收fam标记的链，获得dna后用超滤管浓缩或正丁醇浓缩纯化，即得到dna单链文库；(5)多轮筛选：将步骤(4)中得到的dna单链文库替代步骤(2)中的随机文库，并重复上述(2)～(4)的步骤；多轮筛选过程中通过spr(表面等离子共振)方法检测得到的dna单链文库与ctni蛋白结合能力的增强情况，直至dna单链文库对ctni蛋白的识别能力满足要求后，将最后一轮筛选所得的dna单链文库经克隆测序，得到的序列用dnaman或者rna结构软件进行二级结构的分析，根据一级结构的同源性和二级结构的相似性分成几个家族，每个家族挑选出一条自由能最低、结构最稳定的序列让生工生物工程(上海)股份有限公司合成，然后用spr仪检测每条序列与ctni蛋白结合能力，以亲和力为指标，挑选出有亲和力的序列即为特异性结合ctni蛋白的核酸适配体。其中，步骤(2)中的筛选缓冲液为pbs(nacl：8g/l，kcl：0.2g/l，na2hpo4：1.15g/l，kh2ph4：0.2g/l，cacl2：0.1g/l，mgcl2·6h2o：0.1g/l；ph7.4)在第二方面，本发明提供一种特异性结合ctni蛋白的核酸适配体，其包含seqidnos.1-4中任一个所示的核苷酸序列，或与seqidnos.1-4中任一个所示的核苷酸序列具有高同源性并且能够特异性结合ctni蛋白的核苷酸序列，或由seqidnos.1-4中任一个所示的核苷酸序列衍生的能够特异性结合ctni蛋白的核苷酸序列。其中所述的高同源性可以是与seqidnos.1-4中任一个所示的核苷酸序列至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的同源性。优选地，本发明的特异性结合ctni蛋白的核酸适配体由seqidnos.1-4中任一个所示的核苷酸序列组成。其中seqidnos.1-4所示的核苷酸序列分别显示如下：seqidno.1(ctni-13)：5’-cacgcatagctcagccggcaatgaacaacctccattctaacgcagtgttacctatgcgt-3’seqidno.2(ctni-13s)：5’-cacgcatagctcagccggcaatgaacaacctccattctaacgcagtgttacctatgcgt-3’seqidno.3(ctni-14)：5’-cacgcatagctacggcggctacaatgcagtggggagggacttgttgtaaccctatgcgt-3’seqidno.4(ctni-14s)：5’-cacgcatagctacggcggctacaatgcagtggggagggacttgttgtaaccctatgcgt-3’其中，上述seqidnos.1-4所示的核苷酸序列中，粗体显示的序列表示筛选得到的seqidno.1和seqidno.3截短时去掉的引物区。seqidno.1截去粗体显示的序列得到seqidno.2；seqidno.3截去粗体显示的序列得到seqidno.4。另外，本领域技术人员应该理解，作为对上述技术方案的改进，可对上述核酸适配体的核苷酸序列上的某一位置进行修饰，例如，磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、用硫取代氧、用硒取代氧或连接同位素化等，条件是这样修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质，例如，可以具有与修饰前的母体核酸适配体序列相等或更高的结合ctni蛋白的亲和力，或虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性。本领域技术人员应该理解，作为对上述技术方案的改进，可在上述核酸适配体的核苷酸序列上连接荧光物质，放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料、小肽、sirna或酶标记等，条件是这样修饰后得到的核酸适配体序列具有合乎需要的性质，例如，可以具有与修饰前的母体核酸适配体序列相等或更高的结合ctni蛋白的亲和力，或虽然亲和力没有明显提升但是具有更高的稳定性。换言之，以上不论是经部分取代或经过修饰后的核酸适配体序列，都具有原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能，都可应用于与ctni蛋白结合。作为一个总的技术构思，本发明所述的核酸适配体也可以包含以下三种序列中的任意一种：(1)与前述所有技术方案中所述核酸适配体的核苷酸序列的同源性在60％以上的核苷酸序列(例如可将前述核酸适配体序列删除或增加部分互补的核苷酸)，优选地，同源性可以为70％以上，80％以上，90％以上，或者99％以上；优选与seqidnos.1-4中任一个所示的核苷酸序列具有60％以上的同源性的核苷酸序列，优选地，与seqidnos.1-4中任一个所示的核苷酸序列的同源性可以为70％以上，80％以上，85％以上，90％以上，95％以上，或者99％以上；(2)能够与前述所有技术方案中所述核酸适配体的核苷酸序列在严格条件下杂交的核苷酸序列；或(3)由前述所有技术方案中所述核酸适配体的核苷酸序列转录的rna序列；其中，上述(1)-(3)中的核苷酸序列均能够特异性结合ctni蛋白。此外，作为一个总的技术构思，本发明还提供核酸适配体衍生物，所述衍生物是由前述所有技术方案中所述核酸适配体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架，或者是前述所有技术方案中所述核酸适配体改造成的相应肽核酸。以上不论是衍生出的核酸适配体还是衍生出的其他衍生物，都具有与原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能。在第三方面，本发明还提供了一种前述核酸适配体或者核酸适配体衍生物的应用。例如，本发明的核酸适配体或其衍生物可以用于ctni蛋白纯化或检测，可以使用本发明的核酸适配体或其衍生物来检测受试者血清中ctni蛋白的浓度，进而判断所述受试者是否具有心肌细胞损伤。优选地，可以利用seqidnos.1-4所示的任意一个或多个核酸适配体进行ctni蛋白纯化或检测。可以利用seqidnos.1-4所示的任意一个或多个核酸适配体检测受试者血清中ctni蛋白的浓度，进而判断所述受试者是否具有心肌细胞损伤。并且更进一步地，可以基于上述信息诊断所述受试者是否患有与心肌细胞损伤相关的疾病，例如，但不限于急性心肌梗死。在第四方面，本发明提供一种用于纯化ctni蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第二方面所述的核酸适配体。优选地，所述试剂盒包含seqidnos.1-4所示的任意一个或多个核酸适配体或其衍生物。更优选地，所述试剂盒包含seqidnos.1-4所示的任意一个或多个核酸适配体。由于本发明的核酸适配体能够特异性结合ctni蛋白，可以利用本发明的核酸适配体来纯化样品中的ctni蛋白。例如，纯化ctni蛋白时，具体的操作步骤可以为：将seqidnos.1-4所示的任意一个或多个核酸适配体或者修饰后的序列与包含ctni蛋白的样品液孵育，核酸适配体会特异性结合ctni蛋白，回收复合物，再通过高盐或者其他的方法将结合的ctni蛋白洗脱下来，即纯化得到ctni蛋白；或者先将seqidnos.1-4所示的任意一个或多个核酸适配体或者修饰后的序列固定到固相基质上，将包含ctni蛋白的样品液缓慢流经固相基质，本发明的核酸适配体会与ctni蛋白特异性结合而不会与其它无关蛋白结合，然后用缓冲液清洗固相基质，去除未结合的无关蛋白，再用高盐或者其他方法破坏核酸适配体与ctni蛋白的结合，从而特异性洗脱并收集ctni蛋白。本领域技术人员能够依据实际需要选择适当的纯化方法。在第五方面，本发明提供一种检测ctni蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第二方面所述的核酸适配体。优选地，所述试剂盒包括seqidnos.1-4所示的任意一个或多个核酸适配体或其衍生物。更优选地，所述试剂盒包含seqidnos.1-4所示的任意一个或多个核酸适配体。所述试剂盒可以精确地确定试样中ctni蛋白的浓度。更进一步地，本发明提供一种检测受试者血清中ctni蛋白浓度的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第二方面所述的核酸适配体。优选地，所述试剂盒包括seqidnos.1-4所示的任意一个或多个核酸适配体或其衍生物。更优选地，所述试剂盒包括seqidnos.1-4所示的任意一个或多个核酸适配体。所述试剂盒能够快速、敏捷且准确地检测受试者血清中的ctni蛋白浓度，根据所检测的受试者血清中ctni蛋白浓度，可以进一步判断所述受试者是否具有心肌细胞损伤。换言之，利用受试者血清中ctni蛋白浓度判断所述受试者是否具有心肌细胞损伤是一种快速、准确的诊断方法。本发明提供一种用于诊断受试者是否具有心肌细胞损伤的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第二方面所述的核酸适配体。优选地，所述试剂盒包含seqidnos.1-4所示的任意一个或多个核酸适配体或其衍生物。更优选地，所述试剂盒包括seqidnos.1-4所示的任意一个或多个核酸适配体。更优选地，所述试剂盒包括seqidno.1所示的核酸适配体。所述试剂盒能够快速、敏捷且准确地检测受试者血清中的ctni蛋白浓度，根据所检测的受试者血清中ctni蛋白浓度，可以进一步判断所述受试者是否具有心肌细胞损伤。本领域技术人员可以理解，本发明的用于诊断受试者是否具有心肌细胞损伤的试剂盒也可以用于诊断与心肌细胞损伤相关的疾病，例如，急性心肌梗死。在第六方面，本发明还提供一种检测受试者血清中ctni蛋白浓度的方法，所述方法使用本发明第二方面所述的核酸适配体进行。优选地，所述方法使用seqidnos.1-4所示的任意一个或多个核酸适配体或其衍生物进行。更优选地，所述方法使用seqidnos.1-4所示的任意一个或多个核酸适配体进行。更优选地，所述方法使用seqidno.1所示的核酸适配体进行。使用本发明的核酸适配体检测血清中ctni蛋白浓度可以按照本领域使用常规适配体检测靶标的方法进行，例如，可以通过点杂交实验用本发明的核酸适配体检测急性心肌梗死患者的血清中的ctni蛋白浓度。本发明还提供诊断受试者是否具有心肌细胞损伤的方法，所述方法使用本发明第二方面所述的核酸适配体进行。优选地，所述方法使用seqidnos.1-4所示的任意一个或多个核酸适配体或其衍生物进行。更优选地，所述方法使用seqidnos.1-4所示的任意一个或多个核酸适配体进行。更优选地，所述方法使用seqidno.1所示的核酸适配体进行。与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明通过筛选得到的特异性结合ctni蛋白的核酸适配体具有比蛋白抗体易合成，分子量小，可以对不同部位进行修饰和取代，且更稳定，易于保存等优点。采用本发明的核酸适配体取代结合ctni蛋白的抗体，可在常温下血清环境中结合ctni蛋白。另外，与目前已经公布的一些ctni蛋白的核酸适配体相比，本发明得到的核酸适配体对ctni蛋白的亲和力更高，点杂交实验中可以识别ctni蛋白，可以用于快速、敏捷且准确地检测ctni蛋白，并且本发明得到的核酸适配体序列在血清中可以与ctni蛋白结合，例如，ctni-13(seqidno.1)和ctni-13s(seqidno.2)可以检测到急性心肌梗死患者血清中的ctni蛋白，便于后期应用到相关疾病诊断。附图说明从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：图1显示本发明实施例1筛选得到的ctni-13(a)和ctni-14(b)与ctni蛋白的亲和力检测数据(spr数据)。图1a和1b说明，ctni-13和ctni-14用spr仪均检测到与ctni蛋白有结合，kd值分别为48nm和55nm。图2显示本发明实施例1筛选得到的四条核酸适配体与ctni蛋白的亲和力检测数据(emsa数据)。这些数据表明，ctni-13以及ctni-13s与ctni蛋白均显示出凝胶阻滞，有明显的结合现象；ctni-14以及ctni-14s没有明显的结合现象，可能是ctni-13以及ctni-14二者与ctni蛋白的结合方式有一定的差别。图3显示点杂交的方法检测本发明实施例筛选得到的核酸适配体ctni-13和ctni-14用于ctni蛋白检测方面的应用。图3a显示的是点杂交的原理图，图3b显示的是ctni-13检测点杂交ctni蛋白的实验结果，图3c显示的是ctni-14检测点杂交ctni蛋白的实验结果，可以看出，随着ctni蛋白浓度的提高，显色的斑点颜色变深，这说明ctni-13和ctni-14均可以用于膜杂交ctni蛋白的检测，而且灵敏度较高。图4显示ctni-13和ctni-13s用于急性心肌梗死患者血清样本的检测。分别使用ctni蛋白作为阳性对照，正常人的血清作为阴性对照，图4a可以看出本发明筛选得到的核酸适配体ctni-13可以检测急性心肌梗死患者的血清中的ctni蛋白；图4b可以看出核酸适配体ctni-13s可以检测急性心肌梗死患者的血清中的ctni蛋白图5显示点杂交的方法检测本发明实施例筛选得到的核酸适配体ctni-13s和ctni-14s在经生物素修饰后用于ctni蛋白检测方面的应用。可以看出，与对照蛋白和对照的核酸序列对应的斑点相比，实验组显色明显，这说明生物素修饰的ctni-13s和ctni-14s均可以用于膜杂交ctni蛋白的检测。具体实施方式下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，以下的实施例便于更好的理解本发明，本发明并不限于这些具体的实施例。以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂，可通过商业途径购买得到。实施例1：特异性结合ctni蛋白的ssdna核酸适配体的筛选1.合成以下序列所示的随机单链dna文库和引物：随机单链dna文库：5’-ttcagcactccacgcatagc-40n-cctatgcgtgctaccgtgaa-3’其中，“40n”表示40个任意的核苷酸碱基连接而成的序列。该文库由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。5’端引物：5’-fam-ttcagcactccacgcatagc3’端引物：5’-(20a)-spacer18-ttcacggtagcacgcatagg其中，“20a”表示由20个腺苷酸(a)组成的polya尾，“spacer18”表示18原子的六乙二醇间臂。上述引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。将随机单链dna文库和引物用pbs缓冲液(corning)配制成100um贮存液-20℃保存备用。2.磁珠法筛选2.1将ctni蛋白偶联到磁珠上：取50ul磁珠(invitrogen，dynabeadstmmyonetmcarboxylicacid，货号：65012)用水清洗干净，使用edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；0.4m水溶液)和nhs(n-羟基琥珀酰亚胺；0.1m水溶液)两个试剂等体积混合后100ul与磁珠在25℃孵育15分钟，活化磁珠表面的羧基；ctni蛋白用ph4.5的10mm醋酸钠稀释至终浓度为50μg/ml后与活化后的磁珠混合，置于垂直混合仪上在25℃孵育45分钟，ctni蛋白通过蛋白表面的氨基偶联到磁珠表面。偶联结束，将管置于磁力架上，去掉上清并立即向磁珠中加入100ulph8.5的1m盐酸乙醇胺，室温反应10分钟，封闭磁珠表面未反应的活化位点。置于磁力架上，移去封闭液，磁珠用pbs(nacl：8g/l，kcl：0.2g/l，na2hpo4：1.15g/l，kh2ph4：0.2g/l，cacl2：0.1g/l，mgcl2·6h2o：0.1g/l；ph7.4)清洗3次。2.2孵育和清洗：用130ulpbs稀释溶解1od上述的随机核酸文库至10um，分装到pcr管进行变复性处理。pcr仪设定95℃孵育10分钟使折叠的链解开，冰浴5分钟，室温平衡5分钟。将2.1得到的连有ctni蛋白的磁珠50ul与经变复性处理的随机dna核酸文库放置于垂直混合仪上在25℃孵育1小时，置于磁力架上，保留磁珠去掉上清，用pbs清洗磁珠6次，每次清洗1分钟，每次使用200ulpbs。2.3分离：将2.2得到的磁珠用沸水浴10分钟处理后收集上清，上清中得到的核酸分子用于扩增；2.4pcr扩增文库：以2.3获得的文库为模板，用乳浊液pcr(epcr)进行扩增。矿物油配方如下将模板加入2mlpcrmix中扩增。所述pcrmix的组成如下：ddh2o86.6ul10xpfu聚合酶缓冲液10μldntp(10mm)2ul正向引物(100μm)0.5ul反向引物(100μm)0.5μlpfu(5u/μl)0.4μl总体系100ul其中，所用的引物如下：正向引物：5’-fam-agcagcacagaggtcagatg；反向引物：5’-(20a)-spacer18-ttcacggtagcacgcatagg。其中“spacer18”表示18原子的六乙二醇间臂。上述引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。将上述混合好的混合物与4倍体积的矿物油混合后用涡旋混合仪震荡2分钟产生乳浊液，将乳浊液分成100ul/管，扩增条件如下：95℃预变性3分钟，95℃变性60秒，60℃退火60秒，72℃延伸60秒，共25个循环，72℃5分钟，4℃保存。扩增产物用正丁醇纯化：收集所有的epcr产物于15ml尖底离心管中，加入2倍体积的正丁醇，在旋涡混合器上震荡以充分混匀；台式离心机，9000rpm(转/分钟)于室温离心10分钟；移弃上相(正丁醇)。2.5制备dna单链文库：将步骤2.4中浓缩得到的pcr扩增产物按体积比1∶1加入tbe/尿素变性缓冲液，煮沸变性15分钟使dna变性，随后冰浴1分钟，将所有的样品进行page胶电泳，400v电压下电泳至溴酚蓝到达胶底部，使加长的一条链与有fam标记的链分开，7m尿素变性聚丙烯酰胺凝胶配方如下：尿素3.78g40％聚丙烯酰胺1.8ml5*tbe1.8mlddh2o2.25ml10％aps60ultemed15ul切胶回收fam标记的链：将凝胶取出放在塑料膜上，ex(nm)：495，em(nm)：517检测我们需要的带有fam标记的ssdna；用干净的刀片将目的条带直接切下(切胶时注意带有polya的ssdna在目的条带上方，避免切到带有polya的ssdna)，将胶条转移至1.5mlep管中并捣碎，加入1mlddh2o后沸水浴10分钟将胶中的ssdna转移至溶液中，离心去除胶的碎片，留上清。上清用正丁醇纯化，方法同2.4。得到dna单链用3kd的透析袋透析过夜，即可作为下一轮筛选的文库；3.反筛：用连有bsa蛋白的磁珠进行反筛选，偶联bsa蛋白的方法与2.1相同。第二轮之后每一轮在进行以ctni蛋白为靶标的正筛选之前用反筛磁珠进行反筛，反筛后收集上清用于正筛。4.多轮筛选：将步骤2.5得到的dna单链文库替代步骤2.2中的随机文库，重复筛选6轮，每次操作均以前一次操作中得到的次级文库为起始核酸文库，筛选过程中用spr检测dna单链文库对ctni蛋白识别能力的变化，当dna单链文库对ctni蛋白的识别能力满足要求后，将所得产物经克隆测序分析，最终得到核酸适配体。所述筛选方法中，可逐轮增加筛选压力，以增进筛选核酸适配体的富集程度，缩短筛选进程。所述增加筛选压力包括减少投入的单链dna文库的量、靶标蛋白的用量和两者的孵育时间，增加清洗时间，清洗次数以及加大反筛磁珠的用量。5.分析和鉴定多次筛选后得到的核酸适配体，将得到的富集文库产物经克隆测序分析后，挑选若干条序列由上海生工合成，检测亲和力。在后续检测中，确定seqidnos.1-4所示的核酸适配体具有理想的结合ctni蛋白的亲和力，将它们分别命名为ctni-13、ctni-13s、ctni-14和ctni-14s。实施例2：表面等离子共振(spr)检测ctni核酸适配体和ctni蛋白的亲和力1.将上海生工合成的核酸适配体ctni-13(seqidno.1)和ctni-14(seqidno.3)，用dpbs分别稀释成：0、1、5、10、25、50、100、200nm；2.将ctni蛋白偶联到cm5芯片表面：先用50mmnaoh清洗芯片，进样20ul，流速10ul/min，然后用将等体积的edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；0.4m水溶液)和nhs(n-羟基琥珀酰亚胺；0.1m水溶液)两个试剂混合后进样50ul活化芯片，流速5ul/min。将ctni蛋白用ph4.5的10mm醋酸钠稀释至终浓度为50μg/ml后进样，进样体积15μl，流速5ul/min，ctni蛋白偶联量为2000ru。进样完成后，进乙醇胺封闭芯片，流速5ul/min，进样50ul。3.检测：使用biacoret200设定动力学检测参数，稀释好各个浓度的核酸适配体ctni-13和ctni-14依次进样。亲和力检测数据见图1a(ctni-13)和图1b(ctni-14)，这些数据说明ctni-13和ctni-14用spr仪均检测到与ctni蛋白有结合，kd值分别为48nm和55nm。实施例3：琼脂糖凝胶电泳检测得到的ctni核酸适配体和ctni蛋白的亲和力1.用1×tbe配制1％的琼脂糖凝胶。将1×tbe进行预冷，将seqidnos.1-4所示的核酸适配体分别用pbs稀释成1um，95℃10分钟变性，然后立即冰浴5分钟，再室温平衡10分钟。2.将ctni蛋白分别加到步骤1的seqidnos.1-4所示的核酸适配体中进行孵育10分钟。孵育体系为：核酸适配体：1um，5ul蛋白ctni：0.35mg/ml，5ul3.将人血清(由合肥滨湖医院提供，受试者知情)56℃灭活30min，室温平衡后，加到步骤2的ctni蛋白和ssdna文库的混合液中，血清的终浓度为30％(v/v)，继续在室温孵育20分钟。4.电泳(电泳时电压为400v，电泳过程中要更换电泳液，防止电泳液温度过高)，实验结果见图2。5.结果分析：由图2可知，ctni-13(seqidno.1)以及ctni-13s(seqidno.2)与ctni蛋白均显示出凝胶阻滞效果，有明显的结合现象。ctni-14(seqidno.3)以及ctni-14s(seqidno.4)没有明显的结合现象，可能是结合方式有一定的差别。实施例4：蛋白点杂交实验检测生物素修饰的ctni核酸适配体ctni-13和ctni-14与ctni蛋白相互作用1.取一块10cm×5cm的硝酸纤维素膜(购自millipore)，将ctni蛋白分别用pbs稀释成如下浓度：0.3/0.25/0.2/0.15/0.i/0.05mg/ml。点样1ul到硝酸纤维素膜上，自然风干。2.待干燥后，用10％bsa在室温封闭2小时，封闭结束后用pbst(pbs含0.3‰tween20)清洗一次，吸净。3.将生物素修饰的核酸适配体ctni-13和ctni-14分别稀释到500nm，变复性处理：95℃10分钟变性，然后立即冰浴5分钟，再室温平衡10分钟。4.变复性后的核酸适配体分别和硝酸纤维素膜上的ctni蛋白摇床室温孵育1小时。5.孵育结束后用pbst洗三次，清洗时放置在摇床上，每次10分钟。6.加入hrp-标记的链霉抗生物素蛋白(购自碧云天，货号a0303)用pbst按照1∶10000(v/v)配制，室温摇床孵育30分钟。7.pbst洗3次，清洗时放置在摇床上，每次10分钟。8.以a液∶b液＝1∶1(v/v)的比例加入显色液(beyoeclstar特超敏ecl化学发光试剂盒，购自碧云天，货号p0018a，a液和b液为试剂盒自带溶液)，在室温显色1分钟。9.成像系统观察拍照：使用仪器为ge医疗生命科学部的imagequanttmlas4000数字成像系统。结果如图3所示，图3b显示的是用ctni-13检测点杂交ctni蛋白的结果，图3c显示的是用ctni-14检测点杂交ctni蛋白的结果。由图3b和3c可以看出，随着ctni蛋白浓度的提高，显色的斑点颜色变深，这说明ctni-13和ctni-14均可以用于膜杂交ctni蛋白的检测，而且灵敏度较高。实施例5：通过点杂交实验用核酸适配体ctni-13和ctni-13s检测急性心肌梗死患者的血清1.取出一块1.5cm×4cm硝酸纤维素膜(购自millipore)，如图4，将样品点在膜上，样品分别有对照蛋白rhil12；ctni蛋白；正常人血清；急性心肌梗死患者血清，各点1u1。2.待干燥后，用10％bsa封闭2小时，封闭结束后pbs清洗一次，吸净。3.将ctni-13(500nm)变复性：使用95℃孵育10分钟，然后冰浴10分钟；常温放置1小时后使用。4.将ctni-13和硝酸纤维素膜在室温摇床孵育1小时。孵育结束后用pbst(0.03％tween20)洗三次，每次10分钟。5.加入hrp-标记的链霉抗生物素蛋白(购自碧云天，货号a0303，1∶10000v/v，用pbst配制)，在室温摇床孵育30分钟。6.pbst洗3次，清洗时放置在摇床上，每次10分钟。加入显色液，a液∶b液＝1∶1v/v(beyoeclstar特超敏ecl化学发光试剂盒自带溶液，购自碧云天p0018a)，显色1分钟。7.成像系统观察拍照。结果如图4所示，图4a显示了ctni-13可以检测出急性心肌梗死患者血清中的ctni蛋白。图4b显示了ctni-13s可以检测出急性心肌梗死患者血清中的ctni蛋白。以上实验为定性实验，证明ctni-13和ctni-13s都可以检测急性心肌梗死患者血清中的ctni蛋白，在本实验中没有进一步测定检测的灵敏度，在优化检测条件后，本发明的核酸适配体具有高检测灵敏度(数据未显示)。实施例6：蛋白点杂交实验检测生物素修饰的ctni核酸适配体ctni-13s和ctni-14s与ctni蛋白相互作用1.取一块10cm×5cm的硝酸纤维素膜(购自millipore)，将ctni蛋白用pbs稀释成浓度0.1mg/ml。点样1ul到硝酸纤维素膜上，自然风干。2.待干燥后，用10％bsa在室温封闭2小时，封闭结束后用pbst(pbs含0.3‰tween20)清洗一次，吸净。3.将生物素修饰的核酸适配体ctni-13s和ctni-14s分别稀释到500nm，变复性处理：95℃10分钟变性，然后立即冰浴5分钟，再室温平衡10分钟。4.变复性后的核酸适配体分别和硝酸纤维素膜上的ctni蛋白摇床室温孵育1小时。5.孵育结束后用pbst洗三次，清洗时放置在摇床上，每次10分钟。6.加入hrp-标记的链霉抗生物素蛋白(购自碧云天，货号a0303)用pbst按照1∶10000(v/v)配制，室温摇床孵育30分钟。7.pbst洗3次，清洗时放置在摇床上，每次10分钟。8.以a液∶b液＝1∶1(v/v)的比例加入显色液(beyoeclstar特超敏ecl化学发光试剂盒，购自碧云天，货号p0018a，a液和b液为试剂盒自带溶液)，在室温显色1分钟。9.成像系统观察拍照：使用仪器为ge医疗生命科学部的imagequanttmlas4000数字成像系统。结果如图5所示，点杂交的方法检测核酸适配体ctni-13s和ctni-14s在经生物素修饰后仍然能够用于ctni蛋白检测，可以看出，与对照蛋白和对照的序列对应的斑点相比，实验组显色明显，这说明生物素修饰的ctni-13s和ctni-14s均可以用于膜杂交ctni蛋白的检测。应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。当前第1页12