一种ZFAS1基因的靶向抑制剂及其用途的制作方法

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种zfas1基因的靶向抑制剂及其用途。

背景技术：

脑胶质瘤是中枢系统最常见的恶性肿瘤，占原发性脑肿瘤的50%-60%。目前治疗手段主要以手术为主，放化疗为辅助治疗。但是，由于胶质瘤具有侵袭性生长的生物学特征，并且胶质瘤级别越高，侵袭性越强，手术即使达到影像学和显微镜下全切，复发还是在所难免。目前主流的手术加术后同步化疗后统计显示其中位生存期仅为12个月，5年生存率不足13%。高级别神经胶质瘤预后更差，如多形性胶质母细胞瘤（glioblastomamultiforme,gbms）的疗效仍然很差，生存中位数仍然不超过15个月。由于疗效差，越来越多的研究者致力于针对分子靶点研发新的治疗药物，包括肿瘤标志物、异常的信号途径、表观遗传学基因表达调控、肿瘤血管抑制剂和肿瘤免疫治疗等。在上述治疗策略的应用过程中，存在于脑毛细血管内皮细胞和肿瘤细胞之间的血肿瘤屏障（bloodtumorbarrier,btb），极大地限制了治疗药物进入肿瘤组织，影响疗效。如何有效增加血肿瘤屏障的通透性，促进治疗药物选择性地进入肿瘤组织是亟待解决的关键问题。

长链非编码rna(longnon-codingrna,lncrna)是一类长度超过200个核苷酸的非编码rna转录本。研究发现，lncrna能够调控胶质瘤的发生与发展。有研究表明，zfas1促进胃癌细胞的增殖和迁移，zfas1在非小细胞肺癌组织的异常表达，最近研究报道，zfas1在结直肠癌组织、卵巢癌组织和黑色素瘤组织中高表达，因而zfas1抑制剂仅限于在上述肿瘤组织中使用。目前尚未发现zfas1在胶质瘤微血管内皮中的表达并参与血肿瘤屏障通透性的调控。

rna干扰技术的原理是利用dicer酶切割rna分子，形成rna沉默复合体，靶向结合目标rna分子进而降解rna分子的过程。本发明希望利用rna干扰技术研制zfas1基因的抑制剂，在胶质瘤基因治疗领域发挥作用。

目前，zfas1影响胶质瘤血肿瘤屏障相关机制还未见报道，关于zfas1在胶质瘤基因治疗方面的应用目前还一片空白。因此，研制一种zfas1相关的药物成为目前亟待解决的问题。

技术实现要素：

本发明经实验证明zfas1基因在胶质瘤在组织中高表达，抑制zfas1的表达能够开放血肿瘤屏障，增加血肿瘤屏障的通透性，提高肿瘤组织中的药物浓度，从而提高脑胶质瘤化疗疗效。

本发明的目的在于利用rna干扰技术，设计并提供一种zfas1基因靶向抑制剂及其用途，该抑制剂可与zfas1基因特异性结合，使zfas1基因沉默，从而抑制zfas1基因对血肿瘤屏障通透性的影响，达到治疗胶质瘤的目的。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：本发明提供了一种zfas1基因的靶向抑制剂，该靶向抑制剂的基因序列为：

5'-gtgcccacttcaagaatgtca-3'（seqidno.1）。

所述zfas1基因的靶向抑制剂能够抑制zfas1基因表达的shrna序列，所述shrna模板序列包括正义链和反义链，所述正义链和反义链分别为：

正义链:

5'-caccgtgcccacttcaagaatgtcattcaagagatgacattcttgaagtgggcacttttttg-3'（seqidno.2）；

反义链：

5'-gatcaaaaaagtgcccacttcaagaatgtcatctcttgaatgacattcttgaagtgggcac-3'（seqidno.3）。

进一步地，转录上述的shrna的转录产物序列：

5'-gtgcccacttcaagaatgtcattcaagagatgacattcttgaagtgggcactt-3'（seqidno.4）。

所述zfas1基因靶向抑制剂能够开放胶质瘤组织的血肿瘤屏障，增加血肿瘤屏障的通透性。

所述zfas1基因靶向抑制剂用于制备治疗人脑胶质瘤药物的用途。

所述治疗人脑胶质瘤药物为含有治疗量的zfas1基因靶向抑制剂和药学上的载体或者赋形剂组成的药物组合物。

所述抑制剂为任何药物治疗学上可接受的剂型，包括注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、溶胶剂、冻干粉针剂、胶浆剂、气雾剂、微囊、微球、脂质体、胶束、缓释制剂或控释制剂等。该抑制剂的优选剂型为注射制剂。

所述载体或赋形剂包括本领域公知的稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂等。稀释剂包括但不限于粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、磷酸氢钙等；湿润剂包括水、乙醇、异丙醇等；粘合剂包括但不限于淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙二醇等；崩解剂包括但不限于干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂包括但不限于滑石粉、二氧化硅、聚乙二醇等。

该抑制剂为任何药物治疗学上可接受的的剂量。

所述zfas1基因靶向抑制剂，能够抑制zfas1的表达从而开放血肿瘤屏障，增加血肿瘤屏障的通透性。

所述zfas1基因靶向抑制剂协同与传统化疗药物共同使用时，协同有效治疗或预防脑胶质瘤疾病。

与现有技术相比，本发明具有如下技术效果。

1、本发明靶向抑制剂特异性强，抑制zfas1基因的表达。

2、zfas1基因靶向抑制剂，协同传统化疗药物使用时，增加化疗药物血肿瘤屏障通透性，解决了传统治疗药物的在脑内药物浓度低的问题。

3、实验已证明在体外细胞学水平上应用，治疗效果确切，无不良反应发生。

附图说明

图1为长链非编码zfas1在正常内皮细胞(对照组)和胶质瘤内皮细胞(实验组)中的表达情况柱形图。

图2为应用zfas1基因抑制剂后，跨内皮电阻值测定(a)和辣根过氧化酶通透量实验检测(b)对btb通透性的影响柱形图。

图3为应用zfas1基因抑制剂后，westernblot检测对紧密连接蛋白的表达的影响的电泳图和柱形图。

图4为应用zfas1基因抑制剂后，免疫荧光检测紧密连接蛋白的表达与分布的改变图。

具体实施方式

本发明主要技术方案是。

1.shrna的设计和干扰载体的制备。

2.干扰效率的验证。

3.跨内皮电阻值测定。

4.辣根过氧化酶通透量实验。

5.westernblot。

6.细胞免疫荧光实验。

实施例1。

一、体外血肿瘤屏障的建立。

将hcmec/d3细胞培养于transwell小室的上室中(collageniv包被，0.4umporesize，12mmdiameter，costar,usa)，放入6孔板内；同时将人脑胶质瘤u251细胞以20，000个细胞/毫升的密度种植于另一个6孔板的孔内。

待小室内内皮细胞长满单层，将长满内皮细胞的transwell小室转移至种有人脑胶质瘤u251细胞的6孔板的孔内，小室给予培养液1毫升，6孔板的孔内给予培养液2.5毫升，每隔一天更换新的培养液，共培养4天

二、实时定量pcr检测zfas1的表达。

（1）trizol法提取细胞中的总rna。

①用冷pbs洗涤收集的细胞，加入1mltrizol试剂吹打数次，镜下观察细胞成油滴状（充分裂解），后移入1.5mlep管中，静置5分钟，使其充分裂解；②向样品中加入0.2ml氯仿，手动剧烈震荡室温下静置3分钟；③于4℃12000g离心15分钟，取上层水相到新的ep管中，再加入0.5ml异丙醇，上下颠倒混匀，室温下静置10分钟；④4℃12000g离心15分钟后弃上清，加入1ml75%乙醇；4℃7500g离心5分钟，干燥15分钟后加入40μldepc水，样品可冻存于-80℃冰箱。

（2）一步染料法qrt-pcr检测zfas1的表达。

测定ct值，以gapdh为内参照，以2^-△△ct表示zfas1的相对表达量。

检测zfas1基因在正常脑微血管内皮细胞和胶质瘤微血管内皮细胞中的表达水平（如图1所示）。与正常内皮组相比，zfas1在实验组中的表达显著增加，这一结果提示zfas1参与对脑胶质瘤微血管内皮细胞的功能调控。数据表示平均值±标准差(n=3,*p<0.05)。

三、zfas1基因抑制剂的制备和应用。

设计zfas1基因的干扰序列，选定靶向人zfas1基因并特异性抑制zfas1基因表达的靶基因序列如下：

5'-gtgcccacttcaagaatgtca-3’在ncbi的同原序列比对分析nucleotideblast中输入gtgcccacttcaagaatgtca序列进行比对分析，结果表明该序列和人的其它mrna基因没有高度同源性，可作特异性干扰zfas1基因的特异性序列。

针对以上靶序列设计靶向人zfas1基因而抑制zfas1基因表达的shrna序列如下，包括正义链和反义链，此shrna序列为：

正义链:

5'-caccgtgcccacttcaagaatgtcattcaagagatgacattcttgaagtgggcacttttttg-3'，

反义链：

5’-gatcaaaaaagtgcccacttcaagaatgtcatctcttgaatgacattcttgaagtgggcac-3'，

转录上述的shrna的转录产物，序列为：

5'-gtgcccacttcaagaatgtcattcaagagatgacattcttgaagtgggcactt-3'。

将以上序列信息设计并合成相应质粒，作为zfas1基因抑制剂。zfas1基因抑制剂转染：sh-nc、sh-zfas1的质粒u6/gfp/neo，使zfas1表达沉默，不含有zfas1序列或shrna的空质粒为实验阴性对照；应用24孔培养板培养胶质瘤的血管内皮细胞，当细胞生长达到80%左右时进行转染；配置转染需要的质粒、opti-mem^®ⅰ和ltxandplusreagent(lifetechnologies)转染试剂。a管：一个孔按照1μg质粒dna溶解于50μlopti-mem^®ⅰ+1μlp3000，放置5min，b管：孔按照1μlltxandplus溶解于50μlopti-mem^®ⅰ中；将a、b两管混匀后静置5min；吸出培养液，每孔加入转染混合液100μl，再加入ebm-2培养液400μl；48h后用含有浓度为0.4mg/ml抗生素g418的培养基进行筛选，不断增加g418的浓度，大约4周后得到能够稳定沉默zfas1的细胞系。在后续实验中分为3组，分别是：正常组；转染zfas1沉默空质粒的空白对照组；转染zfas1沉默质粒的抑制剂组。

四、分别测定正常组，空白对照组和抑制剂组跨内皮电阻值。

建立体外btb模型后，跨内皮电阻值的测定：采用millicell-ers系统测定，首先将共培养的细胞培养板在37°c放置于恒温条件下，电极片分别放入小室的内外侧，读数稳定后，分别记录结果，每个小室测定三个不同的点，取平均数，减去空白背景的读数后，teer值计算为读数与transwell小室的表面积相乘计算，计算单位用ω·cm2表示。

实验结果如图2（a）所示，检测应用zfas1基因抑制剂后，相对于正常组和空白对照组，体外血肿瘤屏障模型的跨内皮电阻值显著下降；提示应用zfas1基因抑制剂后，体外btb通透性显著增加。

五、正常组，空白对照组和抑制剂组辣根过氧化酶通透量实验。

建立体外btb模型后，体外btb模型的transwell小室加入含有0.5umol/l辣根过氧化物酶的无血清ebm-2培养基。24h后收集btb模型下室中的培养液，酶标仪测定hrp含量，用hrp标准品绘制hrp标准品曲线，计算渗透到下室的hrp量。hrp量=每小时每平方厘米表面积的hrp的皮摩尔数表示。

实验结果如图2（b）所示，检测应用zfas1基因抑制剂后，相对于正常组和空白对照组，体外血肿瘤屏障模型辣根过氧化酶通透量显著增加；提示应用zfas1基因抑制剂后，体外btb通透性显著增加。

六、westernblot。

(1)收集细胞，加入ripa蛋白裂解液，震荡摇匀，冰上静置30min,4°c条件下12000g离心30min；

(2)获得并收集上清并采用bca法测定样品的蛋白浓度；

(3)取40mg蛋白与5x上样缓冲液混合(1:4)，煮沸5min变性；

(4)将变性蛋白加入8-10%不等的sds变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；

(5)转膜：电压100v，电流120ma,90min-200min；

(6)5%脱脂牛奶封闭2h；

(7)一抗稀释液以一定比例稀释相关抗体封膜，4°c过夜；

(8)ttbs洗5min，3次，加相应二抗，室温摇床上孵育2h；

(9)ecl发光，照相，quantityone软件定量分析。

实验结果如图3所示，检测应用zfas1基因抑制剂后，相对于正常组和空白对照组，体外血肿瘤屏障模型中肿瘤血管内皮细胞紧密连接相关蛋白zo-1、occludin、claudin-5的表达水平显著下调。

七、免疫荧光。

内皮细胞以2000/cm2密度接种于1.5%明胶包被的盖玻片上。达到90%融合后，pbs洗三遍每次5min，以4%多聚甲醛固定30分钟。pbs洗三遍每次5min，5%bsa封闭15min，然后以相应的抗体孵育过夜。pbs洗三遍每次5min，然后以cy3标记的山羊抗兔荧光二抗，避光孵育30min，细胞核以dapi按照1：500进行稀释染色10min。pbs洗三遍每次5min，50%甘油封片并在olympusbx60uprightfluorescence系统进行观察。

实验结果如图4所示：相对于正常组和空白对照组，检测应用zfas1基因抑制剂后，体外血肿瘤屏障模型中肿瘤血管内皮细胞紧密连接相关蛋白zo-1、occludin、claudin-5的表达由连续性分布变为间断性分布。

序列表

<110>中国医科大学附属盛京医院

<120>一种zfas1基因的靶向抑制剂及其用途

<160>4

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>artificial

<400>1

gtgcccacttcaagaatgtca21

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>artificial

<400>2

caccgtgcccacttcaagaatgtcattcaagagatgacattcttgaagtgggcacttttttg62

<210>3

<211>61

<212>dna

<213>artificial

<400>3

gatcaaaaaagtgcccacttcaagaatgtcatctcttgaatgacattcttgaagtgggcac61

<210>4

<211>53

<212>dna

<213>artificial

<400>4

gtgcccacttcaagaatgtcattcaagagatgacattcttgaagtgggcactt53