一种双碱基突变的高活性sgRNA骨架、sgRNA骨架载体及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及一种载体，具体涉及一种双碱基突变的高活性sgrna骨架、sgrna骨架载体及其应用。

背景技术：

crispr/cas9系统是第三代基因编辑技术，依赖sgrna引导cas9核酸酶在特定位置进行基因编辑，被广泛用于基因组编辑，在农业、生命科学以及医学领域发挥重要的价值。crispr/cas9系统主要包括两个部分：(1)来自链球菌(s.pyogenescas9(spcas9))的核酸酶；(2)singleguiderna(sgrna)，sgrna表达载体包含20bp特异性可变靶位点和82bp固定不变的sgrna骨架(sgrnascaffold)。sgrna骨架是人为构建的crispr靶向识别系统中两个rna分子(crisprrna(crrna)、trans-activatingcrisprrna(tracrrna))的嵌合体(jinek，etal.，2012；hsupd，etal.，2013)。

crrna是全长为42bp的rna，其5’端20bp的碱基可以和基因组目标序列(targetsequence)匹配，其随着目标基因改变。crrna的3’端为22bp不可变序列，即“repeat”序列，用于和tracrrna配对。tracrrna是全长约为87bp的rna序列，其5’可以和crrna的3’的“repeat-sequence”配对，称为“anti-repeat”，而剩余序列可以形成多个有发卡环的二级结构。sgrna就是将原来单独的crrna和tracrrna人工嵌合成单一的导向rna，使其可以发挥原来crrna和tracrrna的作用又方便之后的实验操作。目前广泛应用的全长82bp的sgrna骨架序列来自张峰实验室(ranfa，etal.，2013；hsud，etal.，2013)，该sgrna骨架也是经过多个团队多次优化的。2012年末，jennifera.doudna和emmanuellecharpentier两个团队合作首次提出将crrna和tracrrna连接起来成为一个rna，即sgrna(jinek，etal.，2012)，这就是现在通用sgrna骨架的原型。该sgrna骨架将crrna的3’端10个碱基以及tracrrna的5’碱基19个碱基删除，并且将tracrrna的3’尾巴切掉一部分，通过gaaa4个碱基将剩下的crrna和tracrrna连接起来。该sgrna后来被张峰团队证明在体内介导cas9酶的基因编辑效果不够理想。之后2013年初，张峰团队和georgem.church分别在同一期science杂志对jennifera.doudna的sgrna进行优化，通过加上tracrrna的3’尾巴，使得该sgrna介导的cas9对目标基因的编辑效果更好更稳定(congl，etal.，2013、malip，etal.，2013)。2013年6月份，张峰团队又再次对该sgrna进行评估，认为tracrrna尾巴对于体内spcas9的最佳表达和活性至关重要(hsupd，etal.，2013)。至此，sgrnascaffold序列就已成型，其包括12bpcrrna，66bptracrrna以及人工添加的4个用于连接crrna和tracrrna的碱基gaaa。sgrna骨架任何序列都很关键，对于cas9酶的活性介导至关重要，对cas9核酸酶复合体切割dna是必需的。

sgrna表达载体以u6启动子启动sgrna序列的表达。u6启动子是rna聚合酶iii依赖的启动子，在哺乳动物细胞内引导rna的转录，u6启动子具有明确的转录起始点g，以连续的5个t序列终止转录，转录产物会在3′端悬挂2-4个寡聚u(linx,etal.2004)，且遇到连续的4-5个tttt也会终止转录。在张峰实验组sgrnascaffold序列中，除过序列末端有5个连续的t碱基，在sgrnascaffold起始位点即crrna的repeat序列也有4个连续的t碱基，申请人推测该序列会影响转录提前终止，从而降低sgrnascaffold转录，也就间接影响cas9/sgrna复合体的基因编辑活力。张峰团队为了解决该问题而将tttt改为tatt碱基，但是通过t7endonucleaseⅰ酶切鉴定，结果显示，该突变对其介导cas9的编辑活力几乎没有提高(hsupd，etal.，2013)。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种双碱基突变的高活性sgrna骨架、sgrna骨架载体及其应用，显著提高crispr/cas9系统的基因编辑效率。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种双碱基突变的高活性sgrna骨架，将其命名为sgrna(ttat)scaffold，其核苷酸序列如seq.id.no.1所示。

一种双碱基突变的高活性sgrna骨架载体，将其命名为pu6-sgrna(ttat)scaffold，其核苷酸序列如seq.id.no.4所示。

一种靶向目标基因的高活性sgrna骨架载体，是在上述pu6-sgrna(ttat)scaffold上，利用粘性末端连入靶向目标基因的sgrna片段，获得的载体命名为pu6-sgrna(ttat)-targetsite。

优选的，目标基因为人tpi1p2基因、人emx1基因或者人rankl基因。

进一步的，靶向人tpi1p2基因的sgrna片段的核苷酸序列如seq.id.no.5所示。

进一步的，靶向人emx1基因的sgrna片段的核苷酸序列如seq.id.no.6所示。

进一步的，靶向人rankl基因的sgrna片段的核苷酸序列如seq.id.no.7所示。

所述的靶向目标基因的高活性sgrna骨架载体在基因组编辑中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明通过改变现有sgrna骨架序列中的两个碱基，即原sgrna骨架序列crrnarepeat序列中连续的tttt碱基替换为ttat碱基，并将与其对应互补的trancrna序列中连续aaaa碱基替换为ataa碱基，形成新的sgrna骨架，命名为sgrna(ttat)scaffold。实验证明sgrna(ttat)scaffold可以提高sgrna转录水平及其介导的cas9酶切活性，能够使sgrna引导的crispr/cas9系统在进行基因编辑和转录调控时，活性增强。这种方法简便易操作，只通过两个碱基的改变就能显著增强sgrnascaffold的转录水平，从而提高crispr/cas9系统打靶效率，提高基因编辑效率。

本发明所构建的包含sgrna(ttat)scaffold的高活性sgrna骨架载体，能有效介导cas9蛋白的基因组编辑作用，且高于普通sgrna载体介导的编辑效果。

本发明构建的高活性sgrna骨架载体pu6-sgrna(ttat)-targetsite与载体hcas9共转染hek293细胞，进行了对目标基因的编辑实验，同时将已有通用sgrna骨架载体与载体hcas9共转染hek293细胞作对照。实验结果表明，本发明的高活性sgrna的载体与hcas9载体共转染细胞后，对目标基因可以进行有效编辑，且显著高于已有通用sgrna载体介导的编辑效果。

附图说明

图1是sgrnascaffold和sgrna(ttat)scaffold序列结构图。

图2是pu6-sgrnascaffold和pu6-sgrna(ttat)scaffold载体结构图。

图3是pu6-sgrna-targetsite和pu6-sgrna(ttat)-targetsite载体结构图。

图4是实施例1构建的pu6-sgrna(ttat)-tpi1p2载体介导的目标基因编辑效率检测图。

图5是实施例2构建的pu6-sgrna(ttat)-emx1载体介导的目标基因编辑效率检测图。

图6是实施例3构建的pu6-sgrna(ttat)-rankl载体介导的目标基因编辑效率检测图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明的高活性sgrna骨架载体是在张峰实验室的sgrnascaffold载体的基础上通过对该sgrna骨架序列两个碱基的改变实现的。pcr获得的高活性骨架片段sgrna(ttat)scaffold，通过ecorⅰ与speⅰ位点连入载体puc19/hu6-sgrnascaffold中，替换原载体的sgrnascaffold获得高活性sgrna骨架载体pu6-sgrna(ttat)scaffold(如图1和图2)；使用bsaⅰ酶切载体pu6-sgrna(ttat)scaffold，并利用粘性末端连入针对目标基因的sgrna序列，获得载体pu6-sgrna(ttat)-targetsite(如图3)。所述粘性末端连入针对目标基因编辑靶点的长度为19或20个核苷酸，退火构成其sgrna片段的引物序列，所述的针对目标基因的sgrna序列是针对目标基因编辑靶点，它们是针对tpi1p2基因、emx1基因或者rankl基因启动子中的任意一种，但并不只限于这三种。

本发明构建方法，具体步骤为：

(1)pcr合成高活性sgrna骨架片段sgrna(ttat)scaffold；

根据已知sgrna骨架序列，以骨架上游ecorⅰ位点为5’起点向下游即3’方向延伸合成上游引物59bp，该上游引物将原sgrna骨架序列crrnarepeat序列中连续的tttt碱基替换为ttat碱基，并将与其对应互补的trancrna序列中连续aaaa碱基替换为ataa碱基，即改变原sgrna骨架两个碱基。以该已知骨架末端下游spei位点为5’起点并加上保护碱基向上游即3’方向延伸合成下游引物59bp，上下游引物之间有16bp碱基可以互相匹配。pcr扩增形成5’末端带有ecorⅰ位点，3’末端带有speⅰ位点的长度与原sgrnascaffold长度相同的高活性sgrna(ttat)scaffold片段。

(2)构建pu6-sgrna(ttat)scaffold载体

将高活性sgrna(ttat)scaffold片段经过ecorⅰ与speⅰ酶切，使用1％的琼脂糖凝胶电泳后回收片段，载体puc19/hu6-sgrnascaffold通过ecorⅰ与speⅰ酶切后，使用1％的琼脂糖凝胶电泳后回收载体；使用t4连接酶将片段sgrna(ttat)scaffold与载体puc19/hu6-sgrnascaffold连接，产物转化入大肠杆菌dh5α，挑取单克隆菌株，经过培养后经碱性裂解法提取质粒dna，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆为所需要的载体，命名为pu6-sgrna(ttat)scaffold。

(3)构建靶向人tpi1p2基因的pu6-sgrna(ttat)-tpi1p2载体

靶向人tpi1p2基因的sgrna片段由引物退火形成，引物由苏州金唯智公司合成，序列如下(下划线表示粘性末端序列)：

正向引物序列为：accgcctagagtggccacagtac；

反向引物序列为：taacgtactgtggccactctagg。

两条引物用超纯水稀释成浓度为10μm的溶液，各取15μl混合后于室温退火3-4小时。获得的片段即为靶向人tpi1p2基因的sgrna片段，其末端带有特定的粘性末端。载体pu6-sgrna(ttat)scaffold经bsai酶切后，经质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳后回收载体，用t4连接酶将靶向人tpi1p2基因的sgrna片段与经bsai酶切的载体pu6-sgrna(ttat)scaffold连接，产物转化入大肠杆菌dh5α，挑取单克隆菌株，经过培养后经碱性裂解法提取质粒dna，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆为所需要的载体，命名为pu6-sgrna(ttat)-tpi1p2。

(4)构建靶向人emx1基因的pu6-sgrna(ttat)-emx1载体

靶向人emx1基因的sgrna片段由引物退火形成，引物由上海生工公司合成，序列如下(下划线表示粘性末端序列)：

正向引物序列为：accgagtccgagcagaagaagaa；

反向引物序列为：taacttcttcttctgctcggact。

两条引物用超纯水稀释成浓度为10μm的溶液，各取15μl混合后于室温退火3-4小时。获得的片段即为靶向人emx1基因的sgrna片段，其末端带有特定的粘性末端。载体pu6-sgrna(ttat)scaffold经bsai酶切后，经质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳后回收载体，用t4连接酶将靶向人emx1基因的sgrna片段与经bsai酶切的载体pu6-sgrna(ttat)scaffold连接，产物转化入大肠杆菌dh5α，挑取单克隆菌株，经过培养后经碱性裂解法提取质粒dna，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆为所需要的载体，命名为pu6-sgrna(ttat)-emx1。

(5)构建靶向人rankl基因的pu6-sgrna(ttat)-rankl载体

靶向人rankl基因的sgrna片段由引物退火形成，引物由上海生工公司合成，序列如下(下划线表示粘性末端序列)：

正向引物序列为：accggcttcttcttcttctctct；

反向引物序列为：taacagagagaagaagaagaagc。

两条引物用超纯水稀释成浓度为10μm的溶液，各取15μl混合后于室温退火3-4小时。获得的片段即为靶向人rankl基因的sgrna片段，其末端带有特定的粘性末端。载体pu6-sgrna(ttat)scaffold经bsai酶切后，经质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳后回收载体，用t4连接酶将靶向人rankl基因的sgrna片段与经bsai酶切的载体pu6-sgrna(ttat)scaffold连接，产物转化入大肠杆菌dh5α，挑取单克隆菌株，经过培养后经碱性裂解法提取质粒dna，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆为所需要的载体，命名为pu6-sgrna(ttat)-rankl。

以下是发明人给出的具体实施例，需要说明的是，以下的实施例是较佳的例子，本发明并不限于这些实施例。

实施例1：

本实施例构建的表达靶向人tpi1p2基因的高活性sgrna载体pu6-sgrna(ttat)-tpi1p2如下：

高活性sgrna(ttat)scaffold中，将原骨架序列crrnarepeat序列中连续的tttt碱基替换为ttat碱基，并将与其对应互补的trancrna序列中连续aaaa碱基替换为ataa碱基，即改变原sgrna骨架两个碱基(图1)。利用pcr合成该高活性sgrna(ttat)scaffold片段：

上游引物序列seq.id.no.2如下：

gaattcggtctccgttatagagctagaaatagcaagttataataaggctagtccgttat

下游引物序列seq.id.no.3如下：

tactagtaaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagcctt

5’端包含ecorⅰ且3’端包含speⅰ酶切位点的sgrna(ttat)scaffold骨架的完整序列seq.id.no.1为：

gaattcggtctccgttatagagctagaaatagcaagttataataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttactagt

高活性sgrna骨架载体pu6-sgrna(ttat)scaffold中，u6启动子序列seq.id.no.8如下：

gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggac

完整表达元件u6-sgrna(ttat)scaffold部分的序列seq.id.no.4为：

gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgggagaccgaattcggtctccgttatagagctagaaatagcaagttataataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttta

在两个bsaⅰ中插入的靶向人tpi1p2基因的sgrna片段的序列seq.id.no.5如下：

cctagagtggccacagtac。

上述的表达靶向人tpi1p2基因的高活性pu6-sgrna(ttat)-tpi1p2的载体构建方法步骤如下：

1、合成将原骨架序列crrnarepeat序列中连续的tttt改为ttat碱基和trancrna序列中与其对应互补的连续aaaa改为ataa碱基的高活性sgrna骨架所需的两条引物，普通pcr获得目标高活性sgrna(ttat)scaffold骨架；

根据已知序列和发明人设计，由上海生工公司合成5’前端带有ecorⅰ位点的上游引物p1如seq.id.no.2，5’前端带有speⅰ位点的下游引物p2如seq.id.no.3。在该上下游引物中，有16bp(互补序列双下划线表示)碱基完全互相匹配(引物如下)：

以该引物为模板，使用普通pcr扩增合成sgrna(ttat)scaffold骨架片段

反应体系：

聚合酶链式反应的条件是：98℃15秒，98℃10秒，60℃30秒，72℃10秒，72℃5分钟，25个循环。

2、构建pu6-sgrna(ttat)scaffold载体

将sgrna(ttat)scaffold骨架片段经过ecorⅰ与speⅰ酶切，使用1％的琼脂糖凝胶电泳后回收片段，载体puc19/hu6-sgrnascaffold通过ecorⅰ与speⅰ酶切后，使用1％的琼脂糖凝胶电泳后回收载体；使用t4连接酶将片段sgrna(ttat)scaffold与载体puc19/hu6-sgrnascaffold连接，连接条件为：puc19/hu6-sgrnascaffold载体0.5μl，sgrna(ttat)scaffold片段4.5μl，t4-ligationmix5μl，25℃反应20min后转化感受态细胞dh5α，并涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的lb平板中。挑取菌落接种到含有100μg/ml的氨苄青霉素的lb培养液中，14小时后，经碱性裂解法提取质粒dna，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆。将所获得阳性克隆命名为pu6-sgrna(ttat)scaffold载体，该pu6-sgrna(ttat)scaffold载体结构图(如图2)所示。

3、构建靶向人tpi1p2基因的pu6-sgrna(ttat)-tpi1p2载体

设计的靶向人tpi1p2基因的sgrna片段由引物退火形成，引物由上海生工公司合成，上游引物p3即seq.id.no.9，下游引物p4即seq.id.no.10(下划线表示粘性末端序列)：

p3：accgcctagagtggccacagtac；

p4：taacgtactgtggccactctagg。

两条引物用超纯水稀释成浓度为10μm的溶液，各取15μl混合后于室温退火3-4小时。获得的片段即为靶向人tpi1p2基因的sgrna片段，其末端带有特定的粘性末端。载体pu6-sgrna(ttat)scaffold经bsaⅰ酶切后，经质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳后回收载体，将靶向人tpi1p2基因的sgrna片段与经bsaⅰ酶切的载体pu6-sgrna(ttat)scaffold连接，连接条件为：puc19/hu6-sgrnascaffold载体0.5μl，靶向人tpi1p2基因的sgrna片段4.5μl，t4-ligationmix缓冲液5μl，25℃反应20min后转化感受态细胞dh5α，并涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的lb平板中。挑取菌落接种到含有100μg/ml的氨苄青霉素的lb培养液中，14小时后，经碱性裂解法提取质粒dna，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆。将所获得阳性克隆命名为pu6-sgrna(ttat)-tpi1p2。

实施例2：

本实施例构建的表达靶向人emx1基因的高活性sgrna载体pu6-sgrna(ttat)-emx1如下：

实施例1中靶向人tpi1p2基因的sgrna片段由靶向人emx1基因的sgrna片段替换。在两个bsaⅰ中插入的靶向人emx1基因的sgrna片段的序列seq.id.no.6如下：

agtccgagcagaagaagaa。

载体的其它结构与实施例1相同。

其构建方法步骤3中，构建靶向人emx1基因的pu6-sgrna(ttat)-emx1载体的方法是：

靶向人emx1基因的sgrna片段由引物退火形成，引物由上海生工公司合成，上游引物p5即seq.id.no.11，下游引物p6即seq.id.no.12，序列如下(下划线表示粘性末端序列)：

p5：accgagtccgagcagaagaagaa；

p6：taacttcttcttctgctcggact。

其余构建方法与实施例1相同，构建成表达靶向人emx1基因的的高活性sgrna载体pu6-sgrna(ttat)-emx1。

实施例3：

本实施例构建的表达靶向人rankl基因的高活性sgrna载体pu6-sgrna(ttat)-rankl如下：

实施例1中靶向人tpi1p2基因的sgrna片段由靶向人rankl基因的sgrna片段替换。在两个bsaⅰ中插入的靶向人rankl基因的sgrna片段的序列seq.id.no.7如下：

gcttcttcttcttctctct。

载体的其它结构与实施例1相同。

其构建方法步骤3中，构建靶向人rankl基因的pu6-sgrna(ttat)-rankl载体的方法是：

靶向人rankl基因的sgrna片段由引物退火形成，引物由上海生工公司合成，上游引物p7即seq.id.no.13，下游引物p8即seq.id.no.14，序列如下(下划线表示粘性末端序列)：

p7：accggcttcttcttcttctctct；

p8：taacagagagaagaagaagaagc。

其余构建方法与实施例1相同，构建成表达靶向人rankl基因的的高活性sgrna载体pu6-sgrna(ttat)-rankl。

为了验证构建的高活性sgrna骨架载体有益效果，发明人采用实施例1构建的表达靶向人tpi1p2基因的高活性sgrna载体pu6-sgrna(ttat)-tpi1p2，实施例2构建的表达靶向人emx1基因的高活性sgrna的载体pu6-sgrna(ttat)-emx1，实施例3构建的表达靶向人rankl基因的高活性sgrna的载体pu6-sgrna(ttat)-rankl，并进行了实验，实验情况如下：

1、表达靶向人tpi1p2基因的高活性sgrna的载体对目标基因的编辑效率

将未经修饰的通用型sgrna骨架载体命名为puc19/hu6-sgrnascaffold，在本实验中作为阳性对照。载体puc19/hu6-sgrnascaffold中也插入了靶向人tpi1p2基因的sgrna片段，上游引物为p3即seq.id.no.9，下游引物为p9即seq.id.no.15(aaacgtactgtggccactctagg，仅将引物p4第一个碱基从t变为a)其方法与实施例1中构建方法步骤3相同，获得的载体命名为pu6-sgrna-tpi1p2。接种hek293细胞于6孔板，每孔4×10⁵个细胞，共同转染表达cas9的蛋白的载体hcas9(addgene，#41815)与pu6-sgrna(ttat)-tpi1p2进入细胞；而同时，共同转染表达cas9的蛋白的载体hcas9与pu6-sgrna-tpi1p2进入细胞，作为阳性对照。72小时后提取细胞基因组dna。使用巢式pcr扩增基因组中包含编辑位点的区域。

外巢反应：

上游引物p10即seq.id.no.16，下游引物p11即seq.id.no.17：

p10:aaggctctccgtggaagttg；

p11:agtgcaaaggactagcagca。

反应体系：

聚合酶链式反应的条件是：95℃3分钟，95℃15秒，56℃15秒，72℃60秒，72℃5分钟，30个循环。

内巢反应：

上游引物p12即seq.id.no.18，下游引物p13即seq.id.no.19：

p12:gtacactacaaacggcctcct；

p13:agctgtaagcagaatgaagacct。

反应体系：

聚合酶链式反应的条件是：95℃3分钟，95℃15秒，56℃15秒，72℃30秒，72℃5分钟，30个循环。

所获得的pcr产物经过pcr仪器变性退火的程序是：

95℃，5分钟；95℃-85℃，每秒降低2℃(-2℃/s)；85℃-25℃，每秒降低0.1℃(-0.1℃/s)。

pcr变性退火产物经过质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳后回收后，测量含量，然后使用经典的t7endonucleaseⅰ内切酶检测法检测各组中目标基因的编辑效率。具体方法如下：每组取pcr产物dna500ng，0.5μl的t7endonucleaseⅰ(neb,m0302s)内切酶，2μl的10×buffer，补水至总体积20μl。37℃，反应25分钟。结束后进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。t7endonucleaseⅰ内切酶能够将pcr产物中不配对的部分切断，如果pcr产物被切开成两条小的条带，则说明其在目标位置发生了基因组编辑，产生了碱基突变，而两条小的条带的亮度越亮，则说明基因组编辑的效率越高。结果见图4所示，在相同的转染条件下，与control组(阴性对照，空转cas9质粒细胞)相比，pu6-sgrna-tpi1p2与pu6-sgrna(ttat)-tpi1p2均能介导cas9进行基因组编辑，但载体pu6-sgrna(ttat)-tpi1p2介导cas9进行基因组编辑的效应强于pu6-sgrna-tpi1p2。此结果说明，经过碱基改变以后的高活性sgrna表达载体介导cas9对人tpi1p2位点基因组编辑的效应高于普通sgrna载体。

2、表达靶向人emx1基因的高活性sgrna的载体对目标基因的编辑效率

发明人将在验证实验1中使用的载体puc19/hu6-sgrnascaffold中也插入了靶向人emx1基因的sgrna序列，上游引物为p5即seq.id.no.11，下游引物为p14即seq.id.no.20(aaacttcttcttctgctcggact，仅将引物p6的第一个碱基从t变为a)，其方法与实施例1中构建方法步骤3相同，获得的载体命名为pu6-sgrna-emx1。接种hek293细胞(同实验1)后并转染表达cas9的蛋白的载体hcas9(addgene，#41815)与pu6-sgrna(ttat)-emx1进入细胞；以及共同转染表达cas9的蛋白的载体hcas9与pu6-sgrna-emx1进入细胞，作为阳性对照。72小时后提取细胞基因组dna并使用巢式pcr扩增基因组中包含编辑位点的区域。

外巢反应：

上游引物p15即seq.id.no.21，下游引物p16即seq.id.no.22：

p15:ggagcagctggtcagagggg；

p16:gggaagggggacactgggga。

反应体系：

聚合酶链式反应的条件是：95℃3分钟，95℃15秒，60℃15秒，72℃42秒，72℃5分钟，30个循环。

内巢反应：

上游引物p16即seq.id.no.23，下游引物p17即seq.id.no.24：

p17:gcctgagtgttgaggccc；

p18:gaaggccaagtggtcccag。

反应体系：

聚合酶链式反应的条件是：95℃3分钟，95℃15秒，60℃15秒，72℃42秒，72℃5分钟，30个循环。

所获得的pcr产物经过pcr变性退火并进行t7eⅰ酶切，具体操作同实验1。结果见图5所示，虽然相同的转染条件下，pu6-sgrna-emx1与pu6-sgrna(ttat)-emx1均能介导cas9进行基因组编辑，但是载体pu6-sgrna(ttat)-emx1介导cas9进行基因组编辑的效应强于pu6-sgrna-emx1。此结果说明，经过碱基改变以后的高活性sgrna表达载体介导cas9对人emx1位点基因组编辑的效应高于普通sgrna载体。

3、表达靶向人rankl基因的高活性sgrna的载体对目标基因的编辑效率

发明人将在验证实验1中使用的载体puc19/hu6-sgrnascaffold中也插入了靶向人rankl基因的sgrna序列，上游引物为p7即seq.id.no.13，下游引物将p19即seq.id.no.25(taacagagagaagaagaagaagc，仅将引物p8中的第一个碱基从t变为a)，其方法与实施例1中构建方法步骤3相同，获得的载体命名为pu6-sgrna-rnakl。接种hek293细胞(同实验1)后并转染表达cas9的蛋白的载体hcas9(addgene，#41815)与pu6-sgrna(ttat)-rankl进入细胞；以及共同转染表达cas9的蛋白的载体hcas9与pu6-sgrna-rankl进入细胞，作为阳性对照。72小时后提取细胞基因组dna并使用巢式pcr扩增基因组中包含编辑位点的区域。

外巢反应：

上游引物p20即seq.id.no.26，下游引物p21即seq.id.no.27：

p20:ttgctagggcaacaagtgga；

p21:tggcctctggatctcaccaa。

反应体系：

聚合酶链式反应的条件是：95℃3分钟，95℃15秒，62℃15秒，72℃2分钟，72℃5分钟，30个循环。

内巢反应：

上游引物p22即seq.id.no.28，下游引物p23即seq.id.no.29：

p22:tcacccaatgcagagctgaag；

p23:tctctgatgtttgtgggggaag。

反应体系：

聚合酶链式反应的条件是：95℃3分钟，95℃15秒，60℃15秒，72℃25秒，72℃5分钟，30个循环。

所获得的pcr产物经过pcr变性退火并进行t7eⅰ酶切，具体操作同实验1。结果见图6所示，虽然相同的转染条件下，pu6-sgrna-rankl与pu6-sgrna(ttat)-rankl均能介导cas9进行基因组编辑，但是载体pu6-sgrna(ttat)-rankl介导cas9进行基因组编辑的效应强于pu6-sgrna-rankl。此结果说明，经过碱基改变以后的高活性sgrna表达载体介导cas9对人rankl位点基因组编辑的效应高于普通sgrna载体。

上述实验1、实验2和实验3说明，高活性sgrna的载体介导cas9对目标位点基因组编辑的效应显著强于普通sgrna载体。

序列表

<110>西安交通大学

<120>一种双碱基突变的高活性sgrna骨架、sgrna骨架载体及其应用

<160>29

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>101

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gaattcggtctccgttatagagctagaaatagcaagttataataaggctagtccgttatc60

aacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttactagt101

<210>2

<211>59

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gaattcggtctccgttatagagctagaaatagcaagttataataaggctagtccgttat59

<210>3

<211>59

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tactagtaaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagcctt59

<210>4

<211>353

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagag60

ataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtaga120

aagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcat180

atgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaagga240

cgaaacaccgggagaccgaattcggtctccgttatagagctagaaatagcaagttataat300

aaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttta353

<210>5

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

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<210>6

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

agtccgagcagaagaagaa19

<210>7

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

gcttcttcttcttctctct19

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagag60

ataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtaga120

aagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcat180

atgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaagga240

c241

<210>9

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

accgcctagagtggccacagtac23

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

taacgtactgtggccactctagg23

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<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

accgagtccgagcagaagaagaa23

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

taacttcttcttctgctcggact23

<210>13

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

accggcttcttcttcttctctct23

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

taacagagagaagaagaagaagc23

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<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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aaacgtactgtggccactctagg23

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>17

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<213>人工序列(artificialsequence)

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gtacactacaaacggcctcct21

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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aaacttcttcttctgctcggact23

<210>21

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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ggagcagctggtcagagggg20

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<211>18

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<400>24

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<211>23

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ttgctagggcaacaagtgga20

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tcacccaatgcagagctgaag21

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<400>29

tctctgatgtttgtgggggaag22