一种甘薯几丁质酶基因、其编码的蛋白质与应用的制作方法

本发明涉及分子生物学、基因工程领域，具体地涉及一种甘薯几丁质酶基因、其编码的蛋白质与应用。

背景技术：

甘薯是世界上重要的粮食、蔬菜、饲料、工业原料和生物能源作物，是我国粮食安全的底线作物，作为一种健康食品，越来越受到欢迎，人们对甘薯的产量和品质要求也在逐年提高。但是不可忽视的是甘薯在种植和储藏过程中经常受到各种病虫害的威胁，其中甘薯黑斑病的危害最为严重，传播途径广泛，难以彻底根除，我国已将其列为国内检疫对象。染病薯块会产生黑疱霉酮等呋喃萜类有毒物质，人畜食用后会引起中毒或者死亡。生产上以抗真菌剂为主的农业综合防治虽然能起到一定的效果，但这些化学药剂对环境造成了不同程度的污染。目前，尚未发现黑斑病免疫的甘薯品种，因此利用已有的抗病品种，研究抗病基因进行分子设计育种，是防治黑斑病的最经济有效的途径。

当植物受到病原真菌的侵染时，自身会形成复杂独特的防御机制，包括合成植保素、病程相关蛋白等，使植物获得系统性抗性。而几丁质酶是最早被鉴定的一类病程相关蛋白，研究已表明它能催化真菌细胞壁几丁质的水解，使其原生质外渗，从而抑制真菌的生长与繁殖；水解产物寡聚糖又可以作为诱导因子启动植物进一步的防御反应，更进一步提高植物的抗真菌能力。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供一个具有较强的酶活性和抑菌活性的几丁质酶的基因序列及其同源核苷酸序列；本发明的第二个目的在于提供上述基因所编码的蛋白序列及其同源序列。

为了实现以上发明目的，本发明提供了一种甘薯几丁质酶基因，命名为基因ibchia，其核苷酸序列为下列序列之一：

(1)如seqidno.1所示的核苷酸序列；

(2)如seqidno.1所示的核苷酸序列经添加、替换、插入或缺失一个或几个核苷酸而成的同源序列；

(3)如seqidno.1所示的核苷酸序列的等位基因或所述等位基因衍生物的核苷酸序列。

本发明还提供了一种上述甘薯几丁质酶基因编码的蛋白质，其氨基酸序列为下列序列之一：

(1)如seqidno.2所示的氨基酸序列；

(2)如seqidno.2所示的氨基酸序列经替换、缺失、或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明还提供了一种质粒，其含有上述甘薯几丁质酶基因的全序列或部分片段。

本发明还提供了一种宿主细胞，其有上述甘薯几丁质酶基因的全序列或部分片段。

优选的，上述宿主细胞为大肠杆菌细胞。

本发明还提供了上述甘薯几丁质酶基因、甘薯几丁质酶基因编码的蛋白质、质粒、或大肠杆菌细胞在培育高抗病性转基因甘薯中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供的一种甘薯几丁质酶基因，其表达量与甘薯品种抗病性呈正相关,高抗品种中的表达量是高感品种中表达量的6.8倍；该甘薯几丁质酶基因可以通过转基因技术获得过表达的转基因植株，从而提高植物的抗病能力，也可将其用于利用基因工程技术制备该几丁质酶应用到产业化中。

附图说明

图1为本发明实施例4中的甘薯几丁质酶基因ibchiadna的pcr电泳图，其中，泳道1为dna标准分子，泳道2、3为高抗品种，泳道4、5为高感品种；

图2为本发明实施例4中的甘薯几丁质酶基因ibchia在南京92和烟台252块根中的表达量对比图。

具体实施方式：

本发明提供的项目实施方案用于说明本发明，但是不局限于本发明的研究范围。如果没有特别指出，本发明实施中的技术手段为本研究领域的常用技术，所用原料为市场所购。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1甘薯几丁质酶cdna的制备

(1)甘薯总rna的提取

由于甘薯块根富含多糖，而多糖可能会抑制rna提取过程中酶的效果，因此使用天根生化科技有限公司的多糖多酚植物总rna提取试剂盒提取rna。将甘薯洗净，晾干后迅速切成小片，取100mg液氮研磨，按照说明书上的方法进行提取，1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测其完整度，微量分光光度计测量rna含量与纯度。

(2)甘薯几丁质酶cdna第一链的制备

反转录采用由promega公司生产的反转录酶，具体操作如下：

25μl反应体系

42℃温浴60min；95℃加热5min终止反应，冷冻保存。

对多个甘薯转录组文库进行筛选、分析比对，得到一个几丁质酶基因序列，命名为基因ibchia。

实施例2甘薯几丁质酶基因ibchia的引物设计

使用软件primer5.0进行引物设计，根据转录组文库筛选的几丁质酶基因ibchia序列设计引物，其中primer1用于扩增基因全长，primer2用于实时荧光定量pcr：

primer1

fw(p1)5’-cgggatccatgagggttattctggg-3’

rev(p2)5’-cggaattcttaggagccaaaagg-3’

primer2

fw(p1)5’-ctttcattcaggcggctaact-3’

rev(p2)5’-gggttgccttgttcttgcttg-3’

引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

实施例3甘薯几丁质酶基因ibchia克隆与测序

(1)甘薯几丁质酶基因ibchia的pcr扩增

用phusion超保真pcrmastermix，primer1的p1、p2为引物，甘薯块根cdna为模板，pcr反应体系为25μl：

反应条件为：98℃3min；98℃，30s；58℃，30s；72℃，50s；72℃，10min；循环34次；4℃保持，电泳检测结果。

(2)扩增产物回收、加a尾及纯化

使用普通dna产物纯化试剂盒对pcr产物进行回收。

由于使用高保真酶扩增得到的片段不具有a-末端，因此回收得到的pcr产物进行加a尾，以便与t载体连接。

反应体系为60μl：

72℃反应20min，降温至4℃保持；

配制浓度1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳，全自动凝胶成像仪进行切胶，使用试剂盒进行胶回收；最后用微量紫外分光光度计检测浓度。

(3)基因ta克隆及测序

将获得的pcr产物与pgem-t载体进行连接，总体系10μl

4℃过夜连接，吸取2μl连接产物转入50μl感受态大肠杆菌，震荡培养，37℃下200rpm持续60-90min；菌液涂布蓝白斑筛选平板，待干燥后放入恒温培养箱37℃倒置培养12h-16h；挑选白色单菌落进行划线培养，37℃倒置培养12h-16h。

培养完成后，进行菌落pcr：挑取菌苔，于10μldd-h2o中涮洗，直至dd-h2o浑浊，100℃加热10min；加入下列反应液总体系25μl

2ⅹtaqmastermix13μl

primer2-forwardprimer1μl

primer2-reverseprimer1μl

扩增条件为95℃预变性3min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，50s；72℃，10min；4℃保持；其中循环数为30cycles；电泳鉴定扩增片段，确定阳性克隆。

蘸取阳性菌苔放入10mlamp-lb液体培养基，37℃，200rpm，培养12h-16h；使用质粒小提试剂盒提取质粒，送上海生物工程有限公司测序，该基因序列如seqidno.1所示，全长为804bp，编码234个氨基酸，所编码的氨基酸序列如seqidno.2所示。

实施例4甘薯几丁质酶基因ibchia在抗、感品种中表达分析

实时荧光定量pcr选gapdh为内参，引物为primer1；南京92为参照因子，烟台252为实验组，生物重复和技术重复各3个，根据takara的sybrpremixextaqtlirnasehplus说明书配制反应液，严格控制加样，采用2^(-δδcт)法计算其相对表达量。

反应体系20μl

反应条件为：95℃，10min；循环反应是95℃，15秒；60℃，15秒；共40个循环。

如图1和图2所示，实验结果表明，甘薯几丁质酶基因ibchia的表达量与甘薯品种抗病性呈正相关,高抗品种中的表达量是高感品种中表达量的6.8倍。通过转基因技术获得该甘薯几丁质酶基因ibchia过表达的转基因植株，可提高植物的抗病能力，也可将其用于利用基因工程技术制备该几丁质酶应用到产业化中。

序列表

<110>江苏师范大学

<120>一种甘薯几丁质酶基因及其编码的蛋白质

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>3

<211>804

<212>dna

<213>甘薯(ipomoeabatatas)

<400>3

atgagggttattctgggattgggtttggtttgtgttgccctgtctgtcctgacagggaca60

ataatggcgcagggtgtggggtccattgtgacaaaaccgttgtttgatgagatgcttaag120

catcgtaacgacgcaaactgtgcgagtgggttttacacctacgaagctttcattcaggcg180

gctaactccttcgccgcttttgggaccgccggcgacgttgatactcgtaagagagagatt240

gctgcctttttggctcaaacttctcacgaaactactggtggatgggcaactgcaccagat300

ggaccatatgcatggggatactgcttcaagcaagaacaaggcaacccaccagattactgt360

caagcaagccaagagtggccttgtgctcccggcaagaagtattttggtcgtggtcctatc420

caaatttcctacaacttcaactatggtccagctgggaaagccataggatcggatctacta480

aacaacccggatttggtggctaccgacccggtgatatccttcaagacggccttctggttc540

tggatgacaccccaatctcccaagccgtcggcccacgccgtcatgaccggcggatggact600

ccgtcggcggcagacaccgccgccggccgcgtccccggctacggtgtggtcaccaacatt660

atcaacggcgggattgagtgcgggaagggatctaacccgcagatggaggataggattggg720

ttttacaagagatattgtgacattcttggagttggatatggcaataatttggattgcgcc780

aaccaaaggccttttggctcctaa804

<210>2

<211>267

<212>prt

<213>甘薯(ipomoeabatatas)

<400>2

metargvalileleuglyleuglyleuvalcysvalalaleuserval

151015

leuthrglythrilemetalaglnglyvalglyserilevalthrlys

202530

proleupheaspglumetleulyshisargasnaspalaasncysala

354045

serglyphetyrthrtyrglualapheileglnalaalaasnserphe

505560

alaalapheglythralaglyaspvalaspthrarglysarggluile

65707580

alaalapheleualaglnthrserhisgluthrthrglyglytrpala

859095

thralaproaspglyprotyralatrpglytyrcysphelysglnglu

100105110

glnglyasnproproasptyrcysglnalaserglnglutrpprocys

115120125

alaproglylyslystyrpheglyargglyproileglnilesertyr

130135140

asnpheasntyrglyproalaglylysalaileglyseraspleuleu

145150155160

asnasnproaspleuvalalathraspprovalileserphelysthr

165170175

alaphetrpphetrpmetthrproglnserprolysproseralahis

180185190

alavalmetthrglyglytrpthrproseralaalaaspthralaala

195200205

glyargvalproglytyrglyvalvalthrasnileileasnglygly

210215220

ileglucysglylysglyserasnproglnmetgluaspargilegly

225230235240

phetyrlysargtyrcysaspileleuglyvalglytyrglyasnasn

245250255

leuaspcysalaasnglnargpropheglyser

260265