SlDALR2基因在提高番茄细菌性叶斑病抗性中的应用的制作方法

本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及sldalr2基因在提高番茄细菌性叶斑病抗性中的应用。

背景技术：

番茄(solanumlycopersicuml.)是重要的园艺学作物，也是一种深受世界人民喜欢的蔬菜，2016年全球番茄总产量达1.77亿吨，是目前设施栽培面积最大的蔬菜之一。在设施番茄培育中，设施高湿、寡照环境非常利于病原菌入侵、繁殖以及病虫侵害，这严重影响了植株的生长以及农产品的产量和品质。其中丁香假单胞菌番茄变种(pseudomonassyringaepv.tomatostraindc3000，pstdc3000)所引发的番茄细菌性斑点病在我国辽宁、福建、内蒙古、新疆、广西、河北、甘肃、吉林、天津等省市区均有发生。该病主要危害番茄叶、茎、花、叶柄和果实，可造成5％-75％的产量损失(张冠群。“光呼吸在番茄防御pseudomonassyringae中的作用与机制研究”浙江大学，2014。)，给人们生产和生活造成了很大的经济损失。目前对番茄细菌性叶斑病的防治仍以化学药剂为主，但是过多使用化学杀菌剂不仅会危及人类身体健康、破坏生态环境，还容易使病菌产生抗药性。实践证明，培育抗病品种一项经济有效的防止病害的措施。

传统育种是对表型直接进行选择，因此常常又被成为“经验育种”，一般存在周期长、效率低等缺点。近20年来，随着分子生物学和基因组学等新兴学科的飞速发展，使育种家对基因型进行直接选择成为可能，作物分子育种因此应运而生。分子育种是可以将表型和基因型选择结合起来的一种作物遗传改良理论和方法体系，可实现基因的直接选择和有效聚合，大幅度地提高了育种效率，缩短育种年限，成为现代作物育种的主要方向(黎裕等，“中国作物分子育种现状与发展前景”作物学报，2010，36(9)：1425-1430。)。而对其中的关键基因进行功能研究是开发利用这些基因的前提。

类受体蛋白激酶(receptor-likeproteinkinase，rlk)是植物体内普遍存在的一类蛋白激酶，是许多信号识别传递途径中的关键组分。富亮氨酸类受体蛋白激酶(leucine-richrepeatsreceptor-likeproteinkinase，lrr-rlk)是植物中已知的最大的一类跨膜类受体蛋白激酶。典型的lrr-rlk包含胞外lrr结构域、单次跨膜区及胞内激酶结构域(coutod，zipfelc.“regulationofpatternrecognitionreceptorsignallinginplants”naturereviewsimmunology，2016，6：537-552。)。此类蛋白胞外的富亮氨酸结构域识别外界及植物体自身的信号物质，如来自微生物的鞭毛蛋白、系统素等，从而介导和调控生长发育、环境感应和免疫反应等诸多过程(mayy.“biologicalfunctionsofleucine-richrepeatclassofreceptor-likeproteinkinasesinplants”journalofplantphysiologyandmolecularbiology，2005，31(4)：331。)。

植物细胞膜上的lrr-rlk感知信号后，一般会引起质膜上离子通量快速改变，同时伴随着细胞溶质ca²⁺水平的升高，细胞外活性氧(ros)的大量产生。进而引发ca²⁺依赖蛋白激酶(cdpk)和丝裂原活化蛋白激酶(mapk)级联的激活向细胞核内传递免疫信号，激发免疫相关基因的转录调控(boller,t.&felix,g.“arenaissanceofelicitors:perceptionofmicrobe-associatedmolecularpatternsanddangersignalsbypattern-recognitionreceptors”annualreviewofplantbiology，2009，60：379-406。)

目前，在模式植物拟南芥中已经报导过sldalr2基因同源基因at1g74360(tairhttps://www.arabidopsis.org/servlets/tairobjectid＝28523&type＝locus)，该基因被命名为grace(germinationrepressionandcellexpansionreceptor-likekinase，grace)，研究发现在拟南芥中过表达该基因后表现出子叶增大，莲座叶加粗、根系增长等特征(zhenw等，“functionalandstructuralcharacterizationofareceptor-likekinaseinvolvedingerminationandcellexpansioninarabidopsis”frontiersinplantscience，2017，8：1999-2012。)。而番茄的sldalr2基因在抗病方面尚未见相关的研究报导。

技术实现要素：

本发明提供了sldalr2基因(即：defense-associatedlrr-rlk2)在增强番茄细菌性叶斑病抗性的新用途，为培育抗细菌性叶斑病的番茄种质提供依据。

具体技术方案如下：

本发明提供了sldalr2基因在增强番茄细菌性叶斑病抗性中的应用，所述sldalr2基因的编号为solyc03g115610，该基因的蛋白编码区的核苷酸序列如seqidno.1所示，其蛋白质编码区长度为3279bp，全基因序列如seqidno.10所示。

sldalr2基因编码的蛋白为富亮氨酸类受体蛋白激酶，由1092个氨基酸组成，其氨基酸序列如seqidno.2所示。该蛋白激酶包括胞外lrr结构域、单次跨膜域和胞内激酶域3部分，蛋白激酶结构见附图1。

本发明将sldalr2基因作为目的基因导入普通番茄‘condinered’中得到sldalr2基因的t0代过表达植株，经过连续自交，获得纯合高表达的t2代株系，命名为oe:sldalr2-1和oe:sldalr2-3。

本发明利用病毒诱导基因沉默技术，在普通番茄‘condinered’中沉默sldalr2基因，制备得到sldalr2基因沉默植株sldalr2。

通过将t2代过表达纯合株系oe:sldalr2-1、oe:sldalr2-3和其对照普通番茄植株，sldalr2基因沉默植株sldalr2和其对照植株ptrv(ptrv空载体转染番茄植株)接种番茄细菌性叶斑病病原菌。3天后统计发病率，发现sldalr2过表达番茄发病率显著低于相比普通番茄，而sldalr2基因沉默番茄sldalr2发病率显著高于对照植株。

通过将过表达纯合株系oe:sldalr2-1、oe:sldalr2-3和其对照普通番茄植株，sldalr2基因沉默植株sldalr2和其对照植株ptrv取叶圆片，处理100nmflg22(flg22多肽是细菌鞭毛蛋白n端的一段保守性极高的区域，能够诱导植物天然的免疫反应)。结果表明sldalr2过表达植株比普通番茄植株能够激发更高水平的活性氧，而sldalr2基因沉默植株sldalr2激发的活性氧水平则显著降低。

综合上述实验证明：过表达sldalr2基因能够提高番茄对细菌性叶斑病的抗性，沉默sldalr2基因则降低了番茄对细菌性叶斑病的抗性。sldalr2基因编码的类受体蛋白激酶能够促进活性氧的爆发，表明sldalr2基因在植物抗细菌性叶斑病基因工程中具有十分重要的应用价值。

本发明还提供了一种培育抗细菌性叶斑病的番茄种质的方法，包括以下步骤：

(1)构建含sldalr2基因的过表达载体；所述sldalr2基因的蛋白编码区的核苷酸序列如seqidno.1所示；

(2)将所述过表达载体转入农杆菌感受态细胞中，构建含sldalr2基因过表达载体的农杆菌工程菌a；

(3)将所述农杆菌工程菌a介导转化番茄子叶，培育得到过表达纯合株系。

进一步地，在步骤(1)过表达载体的制备过程中，采用的上游引物如seqidno.3所示，下游引物如seqidno.4所示。

进一步地，所述农杆菌为根癌农杆菌菌株gv3101。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明通过在普通番茄‘condinered’中过表达和沉默sldalr2基因，发现其增强番茄细菌性叶斑病抗性的新用途。并为培育抗细菌性叶斑病的番茄品种提供了重要的基因资源。

(2)本发明利用转基因技术提供一种抗细菌性叶斑病的番茄种质的选育方法，并获得了抗细菌性叶斑病的sldalr2基因过表达纯合植株。

附图说明

图1为sldalr2基因编码的富亮氨酸类受体蛋白激酶的结构示意图。

图2为实施例2中构建的sldalr2基因t2代过表达纯合株系oe:sldalr2-1和oe:sldalr2-3的验证；

其中，wt为普通番茄植株；oe:sldalr2-1和oe:sldalr2-3为sldalr2基因过表达的两个纯合株系；

如图2所示，oe:sldalr2-1和oe:sldalr2-3均能检测到过表达株系所携带的flag标签蛋白，表明实施例1所构建的pac007-35s::sldalr2::flag载体已转入普通番茄中，并在植株中表达。

图3为实施例3中番茄sldalr2基因过表达植株与普通番茄植株接种细菌性叶斑病病原菌3天后之后统计的病级指数；

其中，发病越严重，病级指数越高；sldalr2过表达纯合株系病级指数显著低于普通番茄植株。

图4为实施例3中番茄sldalr2基因过表达植株与普通番茄植株接种细菌性叶斑病病原菌后叶片表型；

其中，发病越严重，病斑越密集；sldalr2过表达纯合株系病斑显著少于普通番茄植株。

图5为实施例3中番茄sldalr2基因过表达植株与其对照普通番茄植株，处理flg22后活性氧爆发情况；

其中，rlu为相对光单位，数值越高，活性氧含量越高；活性氧爆发水平越高，植物免疫性越强；sldalr2过表达植株比普通番茄植株能够激发更高水平的活性氧。

图6为实施例4中番茄sldalr2基因沉默植株sldalr2与对照番茄植株ptrv接种细菌性叶斑病病原菌3天后之后统计的病级指数；

其中，发病越严重，病级指数越高；sldalr2沉默植株病级指数显著高于对照番茄植株。

图7为实施例4中番茄sldalr2基因沉默植株sldalr2与对照番茄植株ptrv，处理flg22后活性氧爆发情况；

其中，rlu为相对光单位，数值越高，活性氧含量越高；活性氧爆发水平越高，植物免疫性越强；sldalr2基因沉默植株sldalr2与对照番茄植株ptrv相比激发活性氧水平显著降低。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。下述实施例中的实验方法，若未特别指明，实施例中的培养基及实验条件均为常规培养基和实验条件，如分子克隆实验手册(greenmr，sambrookj.molecularcloning:alaboratorymanual:three-volumeset.coldspringharborlaboratorypr，2012。)，或按照相应实验试剂和仪器说明书建议的条件进行。实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1番茄sldalr2基因的克隆，基因过表达工程菌和基因沉默工程菌的构建

1、番茄总rna提取

采用tiangenplanttotalrnaextractionkit提取番茄幼嫩叶片的总rna，将所提取的rna用thermofisher公司的反转录试剂盒按说明书进行反转录得到cdna，存于-20℃保存备用。

2、sldalr2基因过表达工程菌a的构建

设计番茄sldalr2基因编码区序列的特异性扩增引物，引物序列及所携带的酶切位点如下(带有下划线的为酶切位点序列)：

sldalr2-oe-asci-f：5’-ttggcgcgccatgtcagaagaggaatctga-3’；(seqidno.3)

sldalr2-oe-bamhi-r：5’-cgggatccaaatgaaggagaagtgctacg-3’；(seqidno.4)

以上述从普通番茄品种‘condinered’叶片总rna反转录得到的cdna(complementarydna)为模板，通过聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，pcr)扩增sldalr2基因外显子的核苷酸序列，经asci与bamhi双酶切后，用t4连接酶连接至载体pac007，16℃连接过夜。42℃热击转化涂板，抗性为氯霉素。

挑单克隆菌落，用pac007载体前引物(seqidno.5)：tcgcatccactatccttcgc和基因后引物(seqidno.4)：cgggatccaaatgaaggagaagtgctacg进行pcr验证。

将条带大小正确的菌液送至测序公司测序，测序结果显示载体包含sldalr2基因外显子的核苷酸序列，用全式金公司质粒提取试剂盒提取质粒，将质粒电击入gv3101农杆菌感受态，28℃培养两天后挑斑进行pcr验证，即得到含有过表达载体pac007-35s::sldalr2::flag的农杆菌工程菌a。

3、sldalr2基因沉默工程菌b的构建

利用solgenomicnectwork网站(https://solgenomics.net/)设计番茄sldalr2基因沉默靶标片段序列(seqidno.6)，设计其特异性的扩增引物。引物序列及所携带的酶切位点如下(下划线的为酶切位点序列)：

sldalr2-trv-ecori-f:5’-ccggaattcggagaaaccctggagaat-3’；(seqidno.7)

sldalr2-trv-bamhi-r:5’-gcgggatccagcaaccaccaaactatc-3’；(seqidno.8)

以上述从普通番茄品种‘condinered’叶片总rna反转录得到的cdna(complementarydna)为模板，通过聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，pcr)扩增sldalr2基因沉默靶标片段序列，经ecori与bamhi双酶切后，用t4连接酶连接至载体ptrv2，16℃连接过夜。42℃热击转化涂板，抗性为卡那霉素。

挑单克隆菌落，用ptrv2载体前引物(seqidno.9)：ggtcaaggtacgtagtagag和基因后引物(seqidno.8)：gcgggatccagcaaccaccaaactatc进行pcr验证。将条带大小正确的菌液送至测序公司测序，测序结果显示载体包含sldalr2基因沉默靶标片段序列，用全式金公司的质粒提取试剂盒提取质粒，将质粒电击入gv3101农杆菌感受态，28℃培养两天后挑斑进行pcr验证，即得到含有沉默载体ptrv2-sldalr2的农杆菌工程菌b。

实施例2番茄sldalr2基因的遗传转化与过表达纯合植株的获得

1、农杆菌介导的番茄基因遗传转化

利用含有pac007-35s::sldalr2::flag过表达载体的农杆菌工程菌a侵染番茄子叶并经过分化培养基和生根培养基的筛选后，对得到的植株用pac007-35s的flag蛋白标签进行检测。

具体的步骤如下：

(1)挑选饱满的普通番茄品种‘condinered’种子于清水中，28℃、200转/分钟摇6-8小时，用75％酒精消毒种子30秒，再转入10％次氯酸钠溶液灭菌10-15分钟，最后用灭菌水清洗5-7遍。将灭菌后的种子点播于播种培养基，置于暗处生长3天左右，种子萌芽后，将其转移到光下，25℃培养4天，至子叶完全展开。

(2)切番茄子叶，子叶完全展开而真叶未长出时，用解剖刀将番茄幼苗切下叶尖及下胚轴，每片子叶切成2-3段，将灭菌滤纸放入看护培养基，用镊子小心夹取切好的子叶，轻置于看护培养基上，黑暗下看护过夜，次日用含上述构建好的含pac007-35s::sldalr2::flag载体的农杆菌工程菌侵染子叶，时间为2分钟30秒，期间不断摇晃侵染后用灭菌滤纸擦干残留菌液并将子叶放回培养基，暗培养2天。

(3)子叶与农杆菌在看护培养基共同培养2天后，将子叶转入2z分化培养基中(潮霉素抗性，诱导愈伤组织)，筛选抗性愈伤组织，约15天后转入0.2z分化培养基(潮霉素抗性，诱导发芽)，之后每隔15天左右转入新的0.2z分化培养基。

(4)当愈伤组织上生出小苗后，转入生根培养基进行生根培养20-30天，直至根系发育完全，待根系发育良好，且长势较好时，打开培养瓶盖往瓶内稍稍倒入少量灭菌水保湿，套上一透明的塑料袋进行炼苗，得到t0代过表达番茄幼苗。

2、过表达材料验证

(1)取上述t0代过表达苗叶片少许，放入加有小钢珠的2ml离心管中，用液氮冷冻，研磨仪粉碎样品30秒后，分别向离心管中加入100μl蛋白上样缓冲液和2μl的巯基乙醇，颠倒混匀放入95℃水浴锅中变性5-10分钟，期间轻轻上下颠倒几次。

(2)将(1)中的变性蛋白质样品4℃，12000转每分钟离心10分钟，离心后取上清液15μl上样，200v电压下，待蛋白条带分开后，随即依次转膜、脱脂奶粉封闭、孵育一抗(anti-flag)、二抗(anti-mouseigg，antibody)。最后，用化学发光仪(仪器型号bio-radchemidocimagingsystem)曝光，具有正确大小蛋白条带的植株即为t0代sldalr2基因过表达植株。

3、过表达纯合株系的获得

将t0代转基因过表达植株自交分别得到t1代种子，从每个t0代过表达植株所产生的t1代中取6-9个阳性株继续自交产生t2代并进行分离分析。当t1代阳性株产生的t2代幼苗经过检测全部为阳性株，则该t1代植株为过表达纯合株；反之，则为杂合株。

实施例3sldalr2基因过表达番茄对细菌性叶斑病抗性试验

对实施例2所得番茄sldalr2过表达t2代纯合株系oe:sldalr2-1、oe:sldalr2-3与其对照普通番茄植株接种细菌性叶斑病病原菌。

1、番茄细菌性叶斑病病原菌的准备

将番茄细菌性叶斑病病原菌菌种涂布于含25mg/l利福平的固体kb(king’sb)培养基(蛋白胨10g，k2hpo41.5g，甘油15ml，琼脂15g，无菌水1l)上于28℃培养箱中活化培养2天后，挑取单菌落于含有同样抗生素的液体kb培养基中28℃，以200转每分钟离心，扩大培养8-16小时，直至od600＝0.8-1.0，然后于2500转每分钟离心10分钟，收集菌体。将收集的菌体用10mmmgcl2溶液重悬，并调节细菌浓度至od600＝0.1，按0.03％加入有机硅，准备对过表达与对照番茄植株进行喷施。

2、细菌性叶斑病病原菌接种

分别选取t2代纯合株系oe:sldalr2-1、oe:sldalr2-3的植株各8株和普通番茄植株8株，进行病原菌接种实验，对过表达与普通番茄植株的叶背进行同样地喷施等量上述所准备的病原菌，至菌液浸润所有叶片背部。将植株置于25℃，95％空气相对湿度、12小时光照12小时黑暗，光强200μmolm^-2s^-1的环境下培养3天后，观察植株发病情况，统计发病率，并进行菌落计数。

3、病级指数统计

接种番茄细菌性叶斑病病原菌3天后观察发病症状，并统计叶片发病情况。发病症状按轻重程度依次为0、ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ五个等级，分级标准为：0级，叶片正常；ⅰ级，叶片下表皮可见少数病斑；ⅱ级，叶片下表皮局部密集病斑；ⅲ级，叶片下表皮多部位密集病斑，但未散布整片叶；ⅳ级，叶片下表皮全片叶可见病斑分布。同时每个处理至少统计50片番茄叶片。病情指数的计算公式如下：

病级指数＝∑(各级叶片数×发病级别)×100/(总叶片数×最高发病级数)

统计结果如图3所示，两个过表达株系oe:sldalr2-1、oe:sldalr2-3的番茄植株相比于普通番茄植株发病症状明显减轻。

4、活性氧爆发

通过将过表达纯合株系oe:sldalr2-1、oe:sldalr2-3和普通番茄植株取叶圆片，处理100nmflg22(flg22多肽是细菌鞭毛蛋白n端的一段保守性极高的区域，能够诱导植物天然的免疫反应)，结果如图5所示，sldalr2过表达植株比普通番茄植株能够激发更高水平的活性氧。

实施例4番茄sldalr2基因沉默植株的构建及其对细菌性叶斑病抗性试验

1、病毒诱导的番茄基因沉默

(1)将培养好的沉默载体ptrv2-sldalr2的农杆菌工程菌b，悬浮在侵染液(10mm氯化镁，10mm2-(n-吗啡啉)乙磺酸，ph＝5.7，用时加150μm乙酰丁香酮)中。

(2)将ptrv1：ptrv2-sldalr2＝1:1混合侵染得番茄sldalr2基因沉默植株sldalr2，ptrv1：ptrv2＝1:1混合作为ptrv空载体侵染得对照植株ptrv。

(3)当番茄幼苗两片子叶辗平时，以注射法进行侵染。侵染后的番茄置于22/19℃，16小时光照8小时黑暗，200μmolm^–2s^–1光强的人工气候室培养。

2、番茄sldalr2基因沉默植株对细菌性叶斑病抗性试验

实验方法同实施例3。病级指数统计结果如图6所示，sldalr2基因沉默植株sldalr2相比于对照植株，发病症状明显加重。活性氧爆发实验结果如图7所示，sldalr2基因沉默植株sldalr2与对照植株相比，激发的活性氧水平显著降低。

综合实施例3和实施例4的上述实验，结果均说明在番茄植株中过表达sldalr2基因后对番茄细菌性叶斑病的抗性显著增强，在番茄植株中沉默sldalr2基因后对番茄细菌性叶斑病的抗性显著减弱。上述实验各设有三次重复，三次实验结果基本一致。

以上实施例仅用于说明，而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求书范围当中。

序列表

<110>浙江大学

<120>sldalr2基因在提高番茄细菌性叶斑病抗性中的应用

<160>10

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>3279

<212>dna

<213>番茄(solanumlycopersicuml.)

<400>1

atgtcagaagaggaatctgatattcttcttcttcctgttgcattattccatttgttgctt60

ctaatcactactgtttgtggagaaaccctggagaatgacaagcaagtgttactgagttac120

aaggattttcttgaactgcaaaatccggttaataaaggatacagacatacaaaatggaat180

gcttctgattcctctccatgtagttggagtggagtttcttgtgatgttgatcgtgttact240

cgaattgatctctctggtgatggtttagctgggaatatgtttaacaacttctcagctatg300

acagagttgacatatattgacctgtctatgaatacaattggagggtctattcctgcagac360

ttaggccaatgtaaaaacctgaggttcttgaatttgtctcataatattattgatggtgag420

cttaatttgactggtttgaacaatttgcaagttcttgatttgaccatgaacaggattcat480

ggtgagatcagtctaactttccctggaatttgtgatagtttggtggttgctaacatttcg540

aataacaattttactggtgagattggaactacttttgatcagtgctggaatcttaggtat600

cttgatctgagctacaataacttgactggaggattgtcatttggttttgataagcttaag660

gagttttcggtgtctaaaaacaagtgtaatggctctctgctttcgtcgtttttcactcca720

aactgcaccttgcaggtgttggatttatcagaaaatggatttgttggaggagtgcctaaa780

gagatatcgaattgtaagacgttggaggacttgaatttgtctggaaatgacttttcaggg840

ccaattcctgaggaaattggatcagttacgagtcttcaagcactttacttgggaagcaac900

aatttttcaagggatattccagagagtctattaagtttaagtaacttagtgtttcttgat960

cttagtaggaacaacttcagaggagaaatacaagaaattttcaggcaatttacacaggta1020

aagtttcttctgttgcatggtaattcttatactggaggtatagttacctctggaattcca1080

aacttagtgaacctttctcgattggacttgagcgataaccaattctccggtccattgcca1140

gttgaactttctaagatgaaagggttgaagtttctgattcttgcatacaaccactttaat1200

ggaagtataccatcagtatacggagacattccgacacttcaggcccttgatctttcatct1260

aataagttaactggctcaataccaccaagtttaggtaagctaagctcacttttgtggttg1320

atgcttgctaacaattcactcaccggtggaatcccacccgagttgggaaattgcagtagc1380

ttattgtggttgaatcttgctaacaatcaactttctggttcaataccacctcagttagca1440

agaattggctcgaatcctatgcctactttcttgtcgaatagggctaaggataaggtgact1500

gctggctcaggggaatgctttgctatgaagagatggataccagctgattatcctccattt1560

agctttgtatatcctctccttaccaggaagaattgtagaagcctatgggataagttgctc1620

aaagggtatggtttatttccagtgtgtgaaccgggtagtaatgttcgttcaaatcagata1680

tcaggctatcttcaacttagtatgaacaaattttctggtgggatccctcctgaaattggc1740

agcatgcagaatttcagtatgcttcatttgggtgtaaatgaattcggtggcacgttccct1800

tcagagattggaaaaatgcagctagtagtccttaatgtttcacaaaacagaatatctggt1860

gagattccaagccagattggcaacattaagtgcttattgaatcttgatctgtccagcaac1920

aatttctctggtctgttcccagctagttttagtaacttgactgatctaagcaagttcaat1980

atctcttacaacgcgcacatctatggtactataccagaaaatgggcagttagccacattt2040

gagaagtcatcatatcttggcgtaccattgctgcaccttccacctttcattgataacact2100

acgaataatgctataaacaagggtggaagtttcaaaaggccaacaaaggttggtactgtt2160

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tgcctcgttctaaaatctccgatagatacaccaggatacctactggaggactcaaagggc2280

cgacatgatcttgcatcgagttcaggtgcatcctccccatggttgtctaatgatgttaag2340

gttatccgtttggacagaacaagcttcacacattctgacatattgaaggccacaggcaga2400

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gagtttagagctgaaatggaagtactaagtggaaatgactttggttggcatccgaatctt2580

gtaacactttacggttggtgccttaatggatcagagaaattgttagtctatgaatacatg2640

ggaggtggaagcttagatgagatcatcacagatagatccaaattcacatggaagaaacga2700

atcaacgtggcaattgatgttgcacgtgctttggtcttcttacaccacgagtgctaccct2760

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ggagcagaggaattatgtgaattgcttagaataggaataaggtgcattgctgatattcct3180

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agatcaggatccagtcgtagcacttctccttcattttga3279

<210>2

<211>1092

<212>prt

<213>番茄(solanumlycopersicuml.)

<400>2

metsergluglugluseraspileleuleuleuprovalalaleuphe

151015

hisleuleuleuleuilethrthrvalcysglygluthrleugluasn

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