本发明属于生物技术领域，涉及一种重组人tsg-6蛋白、制备方法及其应用，具体涉及原核基因工程菌制备重组人tsg-6蛋白及其在治疗炎症性疾病动物模型中的应用。
背景技术：
tsg-6(tumornecrosisfactoralphastimulategene6)也称肿瘤坏死因子α刺激基因6，是一种细胞因子。lee等于上个世纪90年代筛选tnf-α(tumornecrosisfactoralpha)刺激人类二倍体fs-4成纤维细胞cdna表达文库时，首次发现了tsg-6基因。大多数哺乳动物基因组中均有tsg-6基因，其氨基酸序列在不同物种间具有高度同源性。tsg-6蛋白主要表达于软骨细胞、滑膜细胞、单核细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞以及具有分化潜能的干细胞。
人tsg-6基因位于人染色体2q23.3，mrna全长1439bp，其76-909nt核苷酸编码一个由277个氨基酸残基组成的蛋白，分子量大小约为31kd。主要由相邻的连接组件和cub组件(cubmodule)组成。连接组件位于tsg-6蛋白前体的第37-128氨基酸残基，由两个α螺旋和两个反向平行的β折叠绕着一个疏水核组成，属于连接组件超家族成员，可与透明质酸(hyaluronicacid，ha)、硫酸软骨素、蛋白多糖结合。位于129～250氨基酸残基，结构域高度保守，金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、甘露糖相关丝氨酸蛋白等也含有这样的结构，可以与蛋白、碳水化合物包括肝磷脂、转化生长因子β超家族成员、胶原、胶原样蛋白等配体结合。
已有的研究显示，tsg-6基因参与多种机体炎症反应应答，作为一种抑炎因子，其主要通过下调炎症因子的表达、减轻细胞外基质病理反应而发挥作用。在机体遭受感染、创伤等侵害时，适度的炎症反应会有利于机体清除病原体，修复损伤。而如果炎症反应持续很长时间，程度剧烈，则会对机体有害。
病毒感染所致的急性炎症反应往往造成多器官的损害。目前临床上治疗病毒性感染疾病的策略主要是使用抗病毒药物，而抗病毒药物发挥作用需要一定的时间，在这一过程中病毒感染引起的急性炎症反应已经发生，机体多脏器会在清除病毒的过程中遭受损伤。怎样才能减轻或者避免炎症反应对机体的损伤是临床急需解决的问题。本发明通过制备重组人tsg-6蛋白，发现其在hcmv病毒感染所致的小鼠急性肺炎模型中能够很好的保护炎症反应对肺组织的损伤。
技术实现要素：
本发明的目的是解决上述现有技术的不足，提供一种重组人tsg-6蛋白及其制备方法和在急性炎症性疾病中的应用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种重组人tsg-6蛋白，所述蛋白的氨基酸序列为seqidno.1。
优选地，所述蛋白的基因编码核苷酸序列为seqidno.2。
上述重组人tsg-6蛋白在急性炎症性疾病中的应用。
上述重组人tsg-6蛋白在治疗hcmv病毒感染所致小鼠急性肺炎中的应用。
一种所述重组人tsg-6蛋白的制备方法，所述的制备方法包括有如下的步骤：
(1)通过hcmv刺激人胚肺成纤维细胞mrc-5，激活tsg-6基因的表达，通过特异性引物获取tsg-6编码基因；
(2)将人tsg-6编码基因连接入表达载体pet-30a中，构建成表达重组质粒；
(3)将构建的表达重组质粒转化宿主菌，构建能表达重组人tsg-6蛋白的重组基因工程菌；
(4)对该重组基因工程菌进行扩增培养，通过0.2mmol/l的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷诱导表达5小时，离心收集菌体，超声破碎菌体，离心后收集沉淀；
(5)将收集的沉淀通过洗涤、变复性和分子筛过滤最终获得纯化的重组人tsg-6蛋白。
优选地，步骤(1)所述的特异性引物为：
上游引物：catatgatcatcttaatttacttatttctcttgctatgg
下游引物：ctcgagtaagtggctaaatcttccagct。
优选地，步骤(3)所述的宿主菌是e.colibl21(de3)。
优选地，步骤(5)所述的洗涤液为buffera：包含50mmtris、100mmnacl、2mm尿素和0.1％edta，ph8.0。
优选地，步骤(5)所述的变性是将洗涤后的沉淀溶解于bufferb中，所述bufferb包含50mmtris、100mmnacl、8m尿素和1％β-巯基乙醇，ph8.0。
优选地，步骤(5)所述的复性是先将蛋白变性液经bufferc稀释，然后4℃下在bufferc中透析6小时，再换bufferc透析过夜。
本发明的有益效果在于：
本发明利用原核表达载体pet30a构建了能够表达重组人tsg-6蛋白的大肠杆菌bl21(de3)宿主菌。将该菌株扩增培养，通过异丙基-β-d-硫代半乳糖苷诱导表达，离心收获菌体，裂解菌体后离心收集包涵体沉淀，经过变、复性和分子筛纯化获得重组人tsg-6蛋白，该蛋白对于hcmv病毒感染小鼠引起的急性肺炎有很好的治疗效果，为病毒感染所致的急性炎症性疾病的治疗提供新的思路。
附图说明
图1为重组tsg-6工程菌表达的sds-page检测结果图。
图2为制备的tsg-6蛋白的免疫反应性鉴定结果图。
图3为感染病毒后对照组小鼠与治疗组小鼠体重变化图。
图4为tsg-6治疗组与未治疗组小鼠肺组织he染色结果图。
具体实施方式
为更好理解本发明，下面结合实施例及附图对本发明作进一步描述，以下实施例仅是对本发明进行说明而非对其加以限定。
实施例一tsg-6基因克隆、表达
1.将人胚肺成纤维细胞(mrc-5细胞)接种于10cm细胞培养皿中，以moi＝1接种人巨细胞病毒(hcmv)，于接种病毒后第三天，提取总rna；
2.以500ngrna为模板逆转录合成cdna，采用自行设计的特异性引物pcr扩增tsg-6全长编码序列，所用的特异性引物序列如下：
上游引物：catatgatcatcttaatttacttatttctcttgctatgg
下游引物：ctcgagtaagtggctaaatcttccagct
3.将扩增的tsg-6编码基因连接至原核表达载体pet30a，构建重组表达载体pet30a-tsg-6，测序鉴定后，转化大肠杆菌bl21(de3)，获得重组表达菌pet30a-tsg-6-bl21；
4.将过夜培养的该重组菌按1:100体积接种lb培养基，37℃，220r/m震荡培养2h，加入0.2mmiptg进行诱导表达5h；
5.4000rpm离心10min，收集菌体，最终2ml菌液加入100μlpbs和25μlsds-page上样缓冲液，混匀后于沸水中煮沸5min；
6.sds-page检测目的重组蛋白的表达。
sds-page结果如附图1，其中泳道m：蛋白质分子量marker；泳道1：空载体对照；泳道2～5：tsg-6重组菌诱导表达的结果，可见在30-45kd之间有一条明显的蛋白条带，即为目的蛋白。
实施例二重组蛋白的纯化
1、将扩大培养的tsg-6重组表达菌12000r/min离心10min，收集菌体，用pbs溶液重悬，超声破碎；
2、将破碎完全的菌液12000r/min，离心15min，收集沉淀；
3、洗涤：将包涵体用buffera(50mmtris，100mmnacl，2mm尿素，0.1％edta，ph8.0)洗涤2次，每次3h；离心12000r/min，15min；
变性：离心后的沉淀以1g:20ml比例溶解于bufferb(50mmtris，100mmnacl，8m尿素，1％β-巯基乙醇，ph8.0)中，待其完全溶解后，离心12000r/min，15min，弃沉淀得到蛋白变性液；
复性：将所得到的变性液先用bufferc(50mmtris，100mmnacl，1％β-巯基乙醇，ph8.0)稀释体积比为1:2，再在bufferc(50mmtris，100mmnaclph8.0)4℃环境中透析6h。6h后进行换bufferc(50mmtris，100mmnaclph8.0)透析过夜。后将透析袋中的液体以12000r/min，离心15min后弃沉淀，收集上清，即为重组人tsg-6蛋白粗制品；
4.将获得tsg-6蛋白粗制品通过孔径40kd分子筛过滤以除去杂蛋白，最终获得的蛋白为重组人tsg-6精制品。
5.制备人重组tsg-6蛋白的免疫反应性测定
采用wb检测制备的人重组tsg-6蛋白的免疫反应性，具体步骤为：聚丙烯酰胺凝胶电泳分离目的蛋白；350ma电转70min转印目的蛋白至pvdf膜，5％脱脂牛奶封闭；采用商品化tsg-6抗体(ab128266)作为一抗1:1000倍稀释，孵育过夜；hrp标记的山羊抗兔二抗1:5000倍稀释，采用ecl法显色。检测制备的tsg-6蛋白与已知抗体的反应性。结果见图2。
实施例三tsg-6重组蛋白用于治疗hcmv感染引起的小鼠急性肺炎
1.hcmv的增殖
将人胚肺成纤维细胞mrc-51×105/ml接种于10cm细胞培养皿，每皿10ml。待细胞贴壁后，按moi＝0.02接种hcmv病毒。37℃孵育2h后更换含10％胎牛血清的mem培养液。于接种病毒后第三天更换含3％胎牛血清mem培养液继续培养5～7天。当病毒致细胞病变达“++++”后收获含病毒的上清液。2000r/min离心20min后，收集含病毒的上清液、并采用空斑形成试验测定感染型病毒颗粒数量。
2.hcmv感染小鼠急性肺炎模型的建立
取6～8周balb/c小鼠，在spf级屏障系统中饲养，试验组每只腹腔注射hcmv病毒0.5ml，效价为3.5×106pfu/ml。对照组每只腹腔注射等体积的mem培养液。于感染后的第5天，每组分别处死6小鼠，取肺组织。将肺组织放入4％的多聚甲醛中固定过夜。石蜡包埋后，he染色观察肺组织病理结构改变。
3.重组tsg-6蛋白用于治疗hcmv感染小鼠所致急性肺炎模型
取6～8周balb/c小鼠8只分成两组(4只/组)，在spf级屏障系统中饲养，每只小鼠腹腔注射hcmv病毒0.5ml，效价为3.5×106pfu/ml。接种病毒后治疗组每只通过尾静脉注射重组tsg-6蛋白(6mg/ml)0.2ml，对照组每只注射相同体积的pbs溶液。于感染后第1,3,5,7分别观察小鼠的状态、进食状况、称量体重并记录。感染组与试验组小鼠体重变化如图3所示。感染后，对照组(未给予tsg-6治疗组)小鼠食欲减退、呼吸急促、出现皱毛、弓背，体重明显减轻、体温下降等症状。而经tsg-6治疗组小鼠食欲正常未出现明显病毒感染症状，体重虽有所下降，但不明显。感染后第7天处死小鼠，解剖可见对照组小鼠肺脏充血和水肿，肺体积变大，肺组织表面局部有轻度病变。取肺组织进行固定和he染色观察肺组织病理结构改变。
结果如附图4：a图为tsg-6治疗组，可见肺组织中出现炎性细胞浸润，肺组织有一定破坏，但肺泡基本形态仍在。b图为安慰剂(pbs)治疗组，未经治疗的小鼠，肺间质充血，血管周围有大量炎性细胞浸润，细支气管内充血，部分管壁你粘膜上皮细胞坏死，脱落，肺组织破坏严重，肺泡基本形态不可见，肺组织病变主要表现为弥漫性肺泡损伤。
以上所述实施方式仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
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