本发明涉及蛋白质纯化，具体涉及一种疏水层析动态清除重组人神经生长因子前体的方法。
背景技术：
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基因工程表达的在中国仓鼠卵巢细胞(cho)生产的人神经生长因子(以下亦称为rhngf)中含有多种杂质，不能直接应用，需要进行纯化才能使用。
现有技术的层析方法虽然能够除去rhngf中的许多过程相关杂质(如宿主细胞蛋白及核酸)，但是很难除去作为产品相关杂质的rhngf前体，其中前体是主要的变异体种类。因为这些变异体通常与成熟rhngf一同产生，其中前体变异体由于含rhngf序列,与rhngf产品理化性质相近，并且由于加工程度的不同导致不同分子量前体的产生，增加了纯化的复杂性，使得rhngf大规模纯化比较困难。
重组人神经生长因子在体内以前体形式合成，包括信号肽、前导肽和成熟rhngf。其中前导肽中有两部分保守区域为前体表达、酶解形成具有生物活性的蛋白以及成熟rhngf的分泌所必需，且其还有助于蛋白的正确折叠。前体经弗林蛋白酶或激素酶原转化酶在特定部位水解后形成具有生物学活性的成熟rhngf。由于弗林蛋白酶或激素酶原转化酶加工不完全会产生完全或部分前体，统称为前体变异体。
虽然前体变异体与rhngf产品性质相近，但通过分析技术及前体本身性质可以确定前体变异体与rhngf存在的差异有：分子量(前体分子量大于rhngf)、电荷(rhngf等电点小于前体变异体)、疏水性(前体变异体由于含糖基化修饰疏水性弱于rhngf)，这些细微的差异通常需要更低粒径的层析材料才能够分辨出来。
目前，对rhngf进行纯化的报道有：
专利cn102702341a采用阳离子交换及分子筛(superdex75)两步方法制备了纯度大于98％的rhngf，虽然猜测分子筛(superdex75)用以清除前体变异体，但该专利并未提及，且分子筛要求样品高度浓缩，上样量只能在柱体积1％-4％之间，树脂本身也较贵，规模化工业生产中不太适用。
专利cn1268639c采用疏水作用层析(优选苯基)用以去除前体，该方法采用了线性梯度的洗脱方式。
专利cn106478801a采用阳离子交换及疏水层析(优选苯基)两步方法制备的纯度大于99％的rhngf，该方法疏水作用层析同样采用了线性梯度的洗脱方式。线性梯度洗脱方式通常需要双泵层析系统，对设备要求较高，不利于大规模工业生产。
以上这些方法均未使用疏水作用层析分离前体与成熟rhngf，更没有采用阶段动态清洗的方式在层析之前清除前体变异体。
技术实现要素：
本发明的目的是提供清除重组人神经生长因子中前体的方法。
本发明分析了rhngf及其前体的理化性质。由于ngf前体中含有糖基化修饰，而成熟rhngf不含糖基化修饰。前体由于存在糖链，比成熟rhngf疏水性更弱。本发明利用该性质，使用疏水作用层析分离前体与成熟rhngf，并使用疏水作用层析进行阶段清洗以清除前体变异体。而且本发明采用动态清洗的方式，提高了纯化rhngf的效率。具体操作方法如下：
一种清除重组人神经生长因子中前体的方法，其特征是：
1)原料预处理：将cho细胞培养物先经过一次或多次柱层析，初步纯化，得到待层析的原料；
2)原料清洗：将步骤1)所得物质加载于疏水层析柱中，用清洗缓冲液清洗，弃去含有前体的流出液；
3)用洗脱缓冲液对进行了步骤2)的层析柱进行洗脱，得到重组人神经生长因子纯品；
洗脱缓冲液是醇的水溶液，或醇和nacl的水溶液，含7％-20％醇，0-100mmnacl。
步骤1)中，所述“人神经生长因子粗品”是本发明方法的待纯化物质，由中国仓鼠卵巢(cho)细胞重组宿主细胞培养物表达的重组生产的人神经生长因子经过至少一次柱层析纯化的产物，含有重组人神经生长因子前体以及其它污染物。
步骤1)所述柱层析的方式不限，按本领域技术人员熟知的所有柱层析方法均可进行。
步骤2)采用阶段电导率比层析洗脱液升高及醇溶液浓度比层析洗脱液降低的方法以清除前体，具体来说，所用清洗缓冲液是醇和nacl的水溶液，清洗缓冲液应同时满足以下条件：
a醇的含量低于步骤3)所用的洗脱液中醇的含量；
bnacl的含量是200～400mm
cph与步骤1)所得物质范围相同；
所述醇，优选乙醇；在本发明的实例中，所用的清洗缓冲液是4％-6％乙醇(体积比)
步骤2)中，所述清洗采用“动态清洗”方式，即根据步骤1)柱层析洗脱产物峰面积线性关系式得出清洗体积，按下式计算：
清洗体积(cv)＝8.5-峰面积/ml树脂/1000。
本发明人对疏水作用层析材料进行了研究。经实验发现，固相颗粒粒径较大的疏水作用层析材料，例如来自ge的octylff、captobutyl、captophenylhs、butylff及phenylff等，对前体的清除效果不明显。本发明所用的疏水作用层析介质配基为苯基或丁基，优选使用butylsepharosehighperformance。
附图说明
图1是疏水层析纯化重组人神经生长因子过程，包括平衡、加载、清洗及洗脱。
图2疏水层析前样品峰面积与清洗柱体积关系
揭示了疏水作用层析之前一步洗脱样品峰面积与疏水作用层析清洗体积之间的关系，峰面积越大，清洗体积越小。
图3装载上样前样品与洗脱样品sec-hplc分析
提供了疏水作用层析过程样品的sec-hplc分析结果，结果显示清洗过程清除了大部分前体变异体。
图4前体清除率及产品回收率数据总结
提供了多批次疏水作用层析数据统计结果，结果显示了良好的前体变异体清除率及产品回收率，显示本发明具有良好的工艺性能。
具体实施方式
以下实施例仅用于举例说明本发明的方法和装置，并不限定本发明的范围。
以下提到的术语，其意义如下：
“重组人神经生长因子(rhngf)”为基因工程表达的在中国仓鼠卵巢细胞(cho)生产的人神经生长因子，表达序列为1-118个氨基酸，在表达过程中会发生c末端碱性氨基酸部分切除，产生1-117个氨基酸的序列分子，形成1-117个氨基酸序列分子与1-118个氨基酸序列分子的复合物。
“重组人神经生长因子前体”指与表达自同一重组人神经生长因子基因但由于胞内分泌过程中翻译后修饰或分泌后氨基酸残基侧链发生化学反应或肽链降解而形成的一系列蛋白。
“前体”指表达的重组人神经生长因子的未加工或部分加工形式。通常，人神经生长因子在体内以前体形式合成，前体经弗林蛋白酶或激素酶原转化酶在特定部位水解后形成具有生物学活性的成熟人神经生长因子。在本文中，前体可以是完全的，也可以是部分的，但均含有糖基化。
“疏水作用层析”指利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合的分离方式。商品化的疏水作用层析材料包括在琼脂糖上固定化苯基、丁基、叔丁基等或在聚甲基丙烯酸酯上固定苯基、丁基、醚基等。
“载荷”指加载到疏水作用层析材料上的粗品。
“缓冲液”指通过其酸-碱成对成分作用来抵抗ph变化的溶液。
“平衡缓冲液”指用在将所述粗品加载到疏水作用层析材料上之前平衡疏水作用层析材料的缓冲液。
“清洗缓冲液”指加载粗品之后且在洗脱感兴趣蛋白质之前流过疏水作用层析材料的缓冲液。
“洗脱缓冲液”指用于自固相洗脱重组人神经生长因子的缓冲液。
“再生缓冲液”可用于再生疏水作用层析填料，使它能够再次使用。再生缓冲液具有自疏水作用层析填料清除基本上所有污染物及重组人神经生长因子的电导率和ph。
“电导率”指水溶液在两个电极之间传导电流的能力。溶液电导率可以通过改变溶液的离子浓度来改变。
“加载”指将所述粗品流过疏水作用层析材料，重组人神经生长因子及部分污染物结合至疏水作用层析材料。
“顶洗”指在所述粗品加载后，使用平衡缓冲液将所述粗品从疏水作用层析柱洗出的过程。
“清洗”指清洗缓冲液流过疏水作用层析材料的过程，一般指清除污染物。
“洗脱”指洗脱缓冲液流过疏水作用层析材料的过程，一般指得到期望的产品。
mes为2-(n-吗啉)乙磺酸，mopos是3-(n-吗啉)-2-羟基丙磺酸，sec-hplc是分子排阻高效液相色谱，pb指磷酸盐缓冲液。
依照本发明，疏水作用层析纯化方案通常包括以下按序步骤：(1)平衡疏水作用层析材料；(2)将粗品加载到疏水作用层析材料；(3)使用平衡缓冲液进行顶洗；(4)使用清洗缓冲液进行中间清洗；(5)使用洗脱缓冲液洗脱期望的重组人神经生长因子。
本发明采用疏水作用层析，可用各种流动相条件进行清洗重组人神经生长因子前体(主要为前体)，该流动相条件包括降低盐浓度，也包括增加极性溶剂的浓度，ph同样对重组人神经生长因子与树脂的结合有影响，优选中性ph。本发明的实施方案中，缓冲液所用缓冲盐包括乙酸钠、磷酸盐、mes、mopso，优选地，选用磷酸盐作为缓冲盐。缓冲液所用洗脱盐包括但不限于氯化钠、乙酸钠、氯化钾及硫酸铵，优选地，选用氯化钠作为洗脱盐。缓冲液中所用有机溶剂包括但不限于乙醇、丙二醇、乙二醇及己二醇，优选地，选用乙醇作为所用有机溶剂。
通常，在将包含重组人神经生长因子和一种或多种分子变异体的粗品加载到疏水作用层析材料上之前，使平衡缓冲液流过所述材料。在本发明的优选实施方案中，平衡缓冲液具有约5.5至约7.0的ph，例如约ph6.0，过低的ph(小于5.0)会导致疏水作用增强。平衡缓冲液盐浓度控制在约0.8m至1.2mnacl范围内，例如约1.1mnacl。一种示例性的平衡缓冲液包含20mmmes，1.1mnacl，ph6.0或20mmpb，1mnacl，ph7.0。
平衡后，将包含重组人神经生长因子和一种或多种分子变异体的粗品加载到疏水作用层析材料上，所述粗品的ph在ph5.5至ph7.0范围中，例如ph6.0或ph7.0，盐浓度控制在约0.8m至1.2mnacl范围内，例如约1.1mnacl。在一个实施方案中，将来自疏水层析洗脱的粗品加载到疏水作用层析，加载密度约5-10g/l树脂，重组人神经生长因子与前体结合至疏水作用层析填料。
加载后，使用平衡缓冲液进行顶洗，顶洗条件与平衡步骤相同，一般进行顶洗2-3个柱体积。
顶洗结束后，使用清洗缓冲液清洗疏水作用层析材料。在清洗过程中清洗缓冲液流过疏水作用层析材料。清洗缓冲液组成一般选择成自树脂洗脱尽可能多的杂质的分子变异体(前体)，而不洗脱期望的得到的重组人神经生长因子。清洗缓冲液ph控制在5.5-7.0范围内，例如约ph6.0或ph7.0，盐浓度控制在约0.2至约0.4mnacl范围内，例如约0.25m，有机溶剂控制在约4％至约6％乙醇，例如约5％。清洗体积采用动态控制的方式，根据疏水作用层析上一步层析的洗脱峰面积决定，一般为5-7cv。优选的清洗缓冲液包括20mmpb，0.4mnacl，6％乙醇，ph6.0或20mmpb，0.25mnacl，5％乙醇，ph7。
在所述清洗步骤后，自疏水作用层析材料洗脱期望的重组人神经生长因子。重组人神经生长因子的洗脱可以通过降低盐浓度或提高有机溶剂浓度来实现。在一个实施方案中，所述洗脱缓冲液包含约0至约100mmnacl，约7％至约20％的乙醇。洗脱缓冲液一般与清洗缓冲液具有大致相同的ph。一种优选的洗脱缓冲液包含20mmpb，0.1mnacl，7％乙醇，ph7.0。另一种优选的洗脱缓冲液包含20mmpb，20％乙醇，ph6.0。
虽然涵盖别的其它步骤，但优选的是，本文中的疏水作用层析纯化方法只由下列步骤组成：平衡，加载包含重组人神经生长因子及分子变异体的粗品，用于洗脱分子变异体的清洗步骤，和洗脱重组人神经生长因子的洗脱步骤。
如果必要，依照本文中的疏水作用层析方法获得的重组人神经生长因子制备物可以进行别的纯化。上文已经讨论了示例性的进一步纯化步骤。
实施例1重组人神经生长因子的疏水作用层析
1.1总过程
以结合-洗脱模式操作层析柱，在环境温度中进行。所述层析柱使用疏水作用层析树脂(butylsepharosehighperformance)。该树脂由偶联丁基官能团的高交联琼脂糖基质组成。将疏水作用层析树脂装填入柱至9-11cm的床高度。在加载疏水层析洗脱产物前，使用平衡缓冲液将疏水作用层析柱中的贮存液清洗出，并且进行柱平衡。将离子交换层析洗脱产物加载到经过平衡的层析柱上，产物结合在树脂上。加载后，使用平衡缓冲液进行顶洗，将未结合载荷洗出。顶洗结束后，使用清洗缓冲液进行清洗，以清除分子变异体。然后使用洗脱缓冲液进行最多3cv的洗脱，收集洗脱产物。洗脱后，使用再生缓冲液(20％乙醇)及清洁液(0.5nnaoh)清洁柱子，之后在贮存液中贮存，直至下次使用(见图1)。
表1是本发明的重组人神经生长因子疏水作用层析的具体工艺条件。
表1重组人神经生长因子工艺
1.2动态控制中间清洗体积
根据装载上样量的不同，等度清洗过程的清洗体积是可变的，上样量与中间清洗体积存在着一定的关系。以疏水层析之前一步洗脱样品峰面积代替上样量，可以实时在线进行中间清洗体积决策。以清洗过程中第一个峰谷处(即图1圆圈处)清洗体积为基准，根据多批次疏水层析纯化数据统计清洗体积与疏水层析之前一步洗脱样品峰面积，两者之间的关系如图2所示。由图2可见，最高清洗体积可达8.5cv，随着上样量的增加，清洗体积随之减少。通常，正常清洗体积需大于第一峰谷。
1.3层析前后样品的分析对比
采用sec-hplc方法分析重组人神经生长因子回收率及前体变异体清除率。色谱柱为tskgelg2000swxlcolumn,7.8x300mm。流动相为0.15m磷酸氢二钠0.1m磷酸二氢钠溶液/乙腈＝85:15(体积比)。分析时上样体积20μl，流速0.5ml/min，柱温25度，检测波长280/214nm，分析时间40min。比例计算采用面积归一化方法。由于溶液体系温和，不会引起重组人神经生长因子两个亚基的解离，所以峰对应二聚体。sec-hplc可以较好的分辨成熟体和前体变异体。对纯化过程中的加载上样前及洗脱样品进行sec-hplc分析，结果如图3所示。由图可见，经过本发明所示工艺的纯化，产品中的前体变异体得到了清除。
1.4数据统计分析
根据sec-hplc对上样前粗品及洗脱产物的分析，统计前体的清除率及产品的回收率。前体变异体清除率＝(1-洗脱产物前体变异体比例/上样前粗品前体变异体比例)*100％；产品回收率＝(洗脱产物单位进样量主峰峰面积*洗脱体积)/(上样前粗品单位进样量主峰峰面积*装载上样体积)*100％。对多批次疏水作用层析工艺进行数据分析，如图4所示。该工艺条件对前体变异体的清除率为98.0％±0.9％，回收率为58％±7％，显示了良好的工艺性能。