本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及线性抗菌寡肽slap-s25及其应用。
背景技术：
：抗菌药物在治疗和控制微生物感染疾病方面发挥着至关重要的作用，保障了人类和动物的健康。但是，抗菌药物的大规模和不规范使用导致的细菌耐药性问题日益严重，致使多种抗菌药物对细菌感染的疗效降低或无效。2011年南亚发现能产生ndm-1的革兰氏阴性细菌和未见报道的致病菌志贺氏菌和霍乱弧菌；同年北美发现与社区相关的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(ca-mrsa)；2015年中国发现质粒介导的多粘菌素耐药(mcr-1)大肠杆菌，治疗耐药性革兰氏阴性菌的“最后一道防线”岌岌可危。如不合理控制及解决细菌耐药性问题，将会对人类健康造成巨大威胁，引起社会的恐慌。为保障人类健康和畜牧业的持续发展，开发有效的治疗方案或寻找新型抗菌药物及其增效剂势在必行。首先，通过抗菌药物联合应用或抗菌药物增效剂，可以提高抗菌药物的生物利用度及使用寿命，降低现有抗菌药物使用量，有效预防和控制耐药细菌发展。如最早发现的抗菌药物增效剂—甲氧苄氨嘧啶，其本身具有较弱的抗菌作用，当其与磺胺类药物合用后，可以将磺胺类药物的抗菌效力提高数十倍；研究显示曲霉明a可恢复产金属β-内酰胺酶(ndm-1)革兰氏阴性菌对美罗培南的敏感性(nature，2014，510，503-506)。此外，线性抗菌寡肽(shortlinearantibacterialpeptide，slap)具有结构简单、生产成本低、安全性高等优点，应用前景良好。开发新型线性寡肽作为广谱的抗菌药物增效剂，恢复或提高现有抗菌药物的抗菌活性，是控制细菌耐药性的重要手段之一。综上，抗菌药物增效剂及线性抗菌寡肽可为控制耐药菌发展提供有利保障，具有较高的开发和研究价值。技术实现要素：本发明的目的是提供一种抗细菌制剂。本发明首先提供了一种寡肽，可为a1)或a2)或a3)或a4)或a5)或a6)：a1)序列表中序列1所示的寡肽；a2)将a1)所述寡肽的氮端进行乙酰化修饰、碳端进行酰胺化修饰，得到的寡肽；a3)结构式如式(i)所示的寡肽；a4)改变a3)所示寡肽中至少一个氨基酸的手性，得到的寡肽；a5)将a1)或a2)或a3)或a4)所示寡肽首尾相连，得到的环状寡肽；a6)将a1)或a2)或a3)或a4)或a5)所示寡肽的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的寡肽。上述a6)中，所述经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加可为不超过4个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述a6)中，所述氨基酸可为稀有氨基酸和/或天然氨基酸。上述a6)所述的寡肽具体可为序列表中序列2、序列3、序列4、序列5、序列6、序列7、序列8、序列9、序列10、序列11、序列12、序列13、序列14、序列15、序列16、序列17或序列18所示的寡肽(依次对应实施例表7中的slaps25-1、slaps25-2、slaps25-3、slaps25-4、slaps25-5、slaps25-6、slaps25-7、slaps25-8、slaps25-9、slaps25-10、slaps25-11、slaps25-12、slaps25-13、slaps25-14、slaps25-15、slaps25-16和slaps25-17)。slaps25-1至slaps25-14是将结构式如式(i)所示的寡肽经过不超过4个氨基酸残基的取代得到的。slaps25-15至slaps25-17是将结构式如式(i)所示的寡肽经过不超过4个氨基酸残基的缺失得到的。上述a4)所述的寡肽具体可为实施例7中表7的slaps25-18、slaps25-19或slaps25-20(依次对应序列表中序列19、序列20和序列21)。实施例7中表7所示的所有寡肽，氮端的氨基酸均进行乙酰化修饰，碳端的氨基酸均进行酰胺化修饰。所述寡肽的应用也属于本发明的保护范围；所述寡肽的应用可为b1)或b2)或b3)或b4)或b5)或b6)或b7)或b8)：b1)抑制细菌；b2)制备抗细菌制剂；b3)预防细菌感染引起的疾病；b4)制备用于预防细菌感染引起的疾病的产品；b5)治疗细菌感染引起的疾病；b6)制备用于治疗细菌感染引起的疾病的产品；b7)防止食物腐败；b8)制备用于防止食物腐败的产品。所述寡肽联合抗菌药物的应用也属于本发明的保护范围；所述寡肽联合抗菌药物的应用可为c1)或c2)或c3)或c4)或c5)或c6)：c1)抑制细菌；c2)制备抗细菌制剂；c3)预防细菌感染引起的疾病；c4)制备用于预防细菌感染引起的疾病的产品；c5)治疗细菌感染引起的疾病；c6)制备用于治疗细菌感染引起的疾病的产品。所述抗菌药物可为四环素类药物、β-内酰胺类药物、糖肽类药物、喹诺酮类药物、利福霉素类药物或环肽类药物。上述任一所述细菌感染引起的疾病具体可为菌血症。上述任一所述产品可为药物或疫苗。本发明还保护所述寡肽在恢复耐多粘菌素的革兰氏阴性菌对多粘菌素的敏感性中的应用。上述应用中，所述革兰氏阴性菌可为非肺炎克雷伯氏菌的革兰氏阴性菌。所述耐多粘菌素的革兰氏阴性菌具体可为含mcr耐药基因的革兰氏阴性菌(非肺炎克雷伯氏菌)。所述含mcr耐药基因的革兰氏阴性菌具体可为含mcr-1耐药基因的大肠杆菌、含mcr-1耐药基因的鲍氏不动杆菌、含mcr-1耐药基因的弗氏枸橼酸杆菌、含mcr-1耐药基因的解鸟氨酸乌拉尔菌、含mcr-1耐药基因的粘质沙雷氏菌、含mcr-1耐药基因的沙门氏菌、含mcr-3耐药基因的维氏气单胞菌、含mcr-1耐药基因的产碱普罗威登斯菌、含mcr-1耐药基因的植生乌拉尔菌或含mcr-1耐药基因的阴沟肠杆菌。所述含mcr-1耐药基因的大肠杆菌具体可为大肠杆菌(escherichiacoli)1-1(mcr-1)、大肠杆菌(escherichiacoli)1-5(mcr-1)、大肠杆菌(escherichiacoli)1-6(mcr-1)、大肠杆菌(escherichiacoli)2-1(mcr-1)、大肠杆菌(escherichiacoli)2-6(mcr-1)、大肠杆菌(escherichiacoli)2-8(mcr-1)或大肠杆菌(escherichiacoli)b2(ndm-5+mcr-1)。所述含mcr-1耐药基因的鲍氏不动杆菌具体可为鲍氏不动杆菌(acinetobacterbaumannii)2-38(mcr-1)。所述含mcr-1耐药基因的弗氏枸橼酸杆菌具体可为弗氏枸橼酸杆菌(citrobacterfreumdii)2-4(mcr-1)。所述含mcr-1耐药基因的解鸟氨酸乌拉尔菌具体可为解鸟氨酸乌拉尔菌(raoultellaornithinolytica)16-68(mcr-1)。所述含mcr-1耐药基因的粘质沙雷氏菌具体可为粘质沙雷氏菌(serratiamarcescens)16-99(mcr-1)。所述含mcr-1耐药基因的沙门氏菌具体可为沙门氏菌(salmonellaenterica)sh30(mcr-1)、沙门氏菌(salmonellaenterica)sh170(mcr-1)、沙门氏菌(salmonellaenterica)sh1-3(mcr-1)、沙门氏菌(salmonellaenterica)sh2-8(mcr-1)或沙门氏菌(salmonellaenterica)8h-3(mcr-1)。所述含mcr-3耐药基因的维氏气单胞菌具体可为维氏气单胞菌(aeromonasveronii)172(mcr-3)。所述含mcr-1耐药基因的产碱普罗威登斯菌具体可为产碱普罗威登斯菌(providenciaalcalifaciens)16-1(mcr-1)。所述含mcr-1耐药基因的植生乌拉尔菌具体可为植生乌拉尔菌(raoultellaplanticola)16-15(mcr-1)。所述含mcr-1耐药基因的阴沟肠杆菌具体可为阴沟肠杆菌(enterobactercloacae)16-15(mcr-1)。本发明还保护所述寡肽联合抗菌药物在耐多粘菌素或不耐多粘菌素的肺炎克雷伯氏菌的协同作用的应用。所述抗菌药物可为利福霉素类药物、喹诺酮类药物、四环素类药物或β-内酰胺类。上述应用中，所述耐多粘菌素的肺炎克雷伯氏菌可为含mcr耐药基因的肺炎克雷伯氏菌。所述不耐多粘菌素的肺炎克雷伯氏菌可为不含mcr耐药基因的肺炎克雷伯氏菌。所述含mcr耐药基因的肺炎克雷伯氏菌具体可为肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)16-63(mcr-1)、肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)4-20(mcr-6)或肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)91(mcr-6)。所述不耐多粘菌素的肺炎克雷伯氏菌可为肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)2。本发明还保护所述寡肽联合抗菌药物在细菌的协同作用中的应用。所述细菌可为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。当所述寡肽联合抗菌药物在革兰氏阳性菌的协同作用中的应用时，抗菌药物可为β-内酰胺类药物。当所述寡肽联合抗菌药物在革兰氏阴性菌的协同作用中的应用时，抗菌药物可为β-内酰胺类药物、四环素类药物、糖肽类药物、喹诺酮类药物、利福霉素类药物或环肽类药物。本发明还保护一种抗细菌制剂，其含有所述寡肽。所述抗细菌制剂还可含有抗菌药物。所述抗菌药物可为四环素类药物、β-内酰胺类药物、糖肽类药物、喹诺酮类药物、利福霉素类药物或环肽类药物。上述任一所述四环素类药物具体可为四环素。上述任一所述糖肽类药物具体可为万古霉素。上述任一所述喹诺酮类药物具体可为氧氟沙星。上述任一所述利福霉素类药物具体可为利福平。上述任一所述环肽类药物具体可为多粘菌素。上述任一所述β-内酰胺类药物可为氨苄西林或亚胺培南。上述任一所述细菌可为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。所述革兰氏阳性菌可为金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)或肠球菌或枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)或其它革兰氏阳性细菌。所述金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)具体可为金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)atccno.29213、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)mrsat144或金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)215(lzdr+cfr)。所述肠球菌可为粪肠球菌(enterococcusfaecalis)。所述粪肠球菌(enterococcusfaecalis)具体可为粪肠球菌(enterococcusfaecalis)vrea4。所述枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)可为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)atccno.6051。所述革兰氏阴性菌可为大肠杆菌(escherichiacoli)、沙门氏菌(salmonellaenterica)、肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)、绿脓杆菌(pseudomonasaeruginosa)、鲍氏不动杆菌(acinetobacterbaumannii)、维氏气单胞菌(aeromonasveronii)、弗氏枸橼酸杆菌(citrobacterfreumdii)、解鸟氨酸乌拉尔菌(raoultellaornithinolytica)、粘质沙雷氏菌(serratiamarcescens)、产碱普罗威登斯菌(providenciaalcalifaciens)、植生乌拉尔菌(raoultellaplanticola)或阴沟肠杆菌(enterobactercloacae)。所述大肠杆菌(escherichiacoli)可为大肠杆菌(escherichiacoli)atccno.25922、大肠杆菌(escherichiacoli)c3(ndm-1)、大肠杆菌(escherichiacoli)g6(ndm-5)、大肠杆菌(escherichiacoli)3cz20e(mcr-1+flor)、大肠杆菌(escherichiacoli)b2(ndm-5+mcr-1)、大肠杆菌(escherichiacoli)i1(cre+mcr-1)、大肠杆菌(escherichiacoli)l14(esbl+mcr-1)、大肠杆菌(escherichiacoli)f9(esbl+mcr-1)、大肠杆菌(escherichiacoli)1-1(mcr-1)、大肠杆菌(escherichiacoli)1-5(mcr-1)、大肠杆菌(escherichiacoli)1-6(mcr-1)、大肠杆菌(escherichiacoli)2-1(mcr-1)、大肠杆菌(escherichiacoli)2-6(mcr-1)或大肠杆菌(escherichiacoli)2-8(mcr-1)。所述沙门氏菌(salmonellaenterica)可为沙门氏菌(salmonellaenterica)atccno.13076、沙门氏菌(salmonellaenterica)sh30(mcr-1)、沙门氏菌(salmonellaenterica)sh170(mcr-1)、沙门氏菌(salmonellaenterica)sh1-3(mcr-1)、沙门氏菌(salmonellaenterica)sh2-8(mcr-1)、沙门氏菌(salmonellaenterica)8h-3(mcr-1)、沙门氏菌(salmonellaenterica)4cz2(mcr-1)或沙门氏菌(salmonellaenterica)4m(ndm-1)。所述肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)可为肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)1、肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)2、肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)3、肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)4、肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)16-80(mcr-1)、肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)16-87(mcr-1)、肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)16-63(mcr-1)、肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)4-20(mcr-6)或肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)91(mcr-6)。所述绿脓杆菌(pseudomonasaeruginosa)可为绿脓杆菌(pseudomonasaeruginosa)pao1atccno.47085或绿脓杆菌(pseudomonasaeruginosa)pa14。所述鲍氏不动杆菌(acinetobacterbaumannii)可为鲍氏不动杆菌(acinetobacterbaumannii)2-38(mcr-1)。所述维氏气单胞菌(acinetobacterbaumannii)可为维氏气单胞菌(aeromonasveronii)172(mcr-3)。所述弗氏枸橼酸杆菌(citrobacterfreumdii)可为弗氏枸橼酸杆菌(citrobacterfreumdii)2-4(mcr-1)。所述解鸟氨酸乌拉尔菌(raoultellaornithinolytica)可为解鸟氨酸乌拉尔菌(raoultellaornithinolytica)16-68(mcr-1)。所述粘质沙雷氏菌(serratiamarcescens)可为粘质沙雷氏菌(serratiamarcescens)16-99(mcr-1)。所述产碱普罗威登斯菌(providenciaalcalifaciens)可为产碱普罗威登斯菌(providenciaalcalifaciens)16-1(mcr-1)。所述植生乌拉尔菌(raoultellaplanticola)可为植生乌拉尔菌(raoultellaplanticola)16-15(mcr-1)。所述阴沟肠杆菌(enterobactercloacae)可为阴沟肠杆菌(enterobactercloacae)16-15(mcr-1)。实验证明，所述寡肽对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有一定的抑菌作用，对革兰氏阳性菌(含耐药菌)的最小抑菌浓度为8-64μg/ml，对革兰氏阴性菌(含耐药菌)的最小抑菌浓度为0.5-32μg/ml；寡肽和抗菌药物(如四环素、万古霉素、氧氟沙星、利福平、多粘菌素、氨苄西林、亚胺培南)均具有良好的协同作用；寡肽可恢复耐多粘菌素的革兰氏阴性菌对多粘菌素的敏感性；寡肽不具有溶血性，具备较好的组织相容性；寡肽不仅可以有效的抑制多粘菌素耐药菌，而且可以治疗菌血症。此外，寡肽分子量小，结构简单，便于大规模合成。本发明具有重大的应用价值。附图说明图1为线性抗菌寡肽slap-s25的溶血性试验。图2为线性抗菌寡肽slap-s25治疗小鼠细菌感染；其中pbs为pbs组，s25为slap-s25治疗组，多粘菌素为多粘菌素治疗组，多粘菌素+s25为协同治疗组。图3为线性抗菌寡肽slap-s25治疗小鼠菌血症；其中pbs为pbs组，s25为slap-s25治疗组，多粘菌素为多粘菌素治疗组，多粘菌素+s25为协同治疗组。图4为线性抗菌寡肽slap-s25治疗大蜡螟幼虫细菌感染；其中pbs为pbs组，s25为slap-s25治疗组，多粘菌素为多粘菌素治疗组，多粘菌素+s25为协同治疗组。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。balb/c雌性小鼠为北京维通利华实验动物技术有限公司产品。mhb肉汤培养基为含牛肉粉1.5g/l、可溶性淀粉1.5g/l和酸水解酪蛋白17.5g/l的水溶液。实施例1、线性抗菌寡肽slap-s25的发现和人工合成一、线性抗菌寡肽slap-s25的发现通过对多种线性抗菌寡肽序列的生物信息学分析、优化肽链结构、构建线性寡肽文库，评价所获得线性寡肽的抗菌效果及其与多种抗菌药物(如β-内酰胺类、四环素类、糖肽类、喹诺酮类、环肽类及利福霉素类)的协同抗菌作用，本发明的发明人获得了线性寡线性抗菌寡肽slap-s25。线性抗菌寡肽slap-s25的结构式如式(i)所示(氮端2，4-二氨基丁酸进行乙酰化修饰，碳端丙氨酸进行酰胺化修饰)，分子量为1229.10。二、线性抗菌寡肽slap-s25的人工合成人工合成式(i)所示的线性抗菌寡肽slap-s25。线性抗菌寡肽slap-s25的氨基酸序列如序列表中序列1所示。线性抗菌寡肽slap-s25在下文中简称s25。实施例2、线性抗菌寡肽slap-s25抑菌活性的测定待测菌株详见表1。表1注：a、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)atccno.29213、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)atccno.6051、大肠杆菌(escherichiacoli)atccno.25922、沙门氏菌(salmonellaenterica)atccno.13076和绿脓杆菌(pseudomonasaeruginosa)pao1atccno.47085均保藏于美国模式培养物集存库(简称atcc，地址：americantypeculturecollection(atcc)10801universityboulevardmanassas,va20110usa)，公众可从美国模式培养物集存库获得。b、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)215(lzdr+cfr)携带有耐药基因cfr且对利奈唑胺耐药。粪肠球菌(enterococcusfaecalis)vrea4为万古霉素的耐药菌株。金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)mrsat144为甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌。名称中含有“esbl”的菌株均为可产超广谱β-内酰胺酶介导β-内酰胺类抗生素耐药的菌株。名称中含有“ndm”的菌株均为产新德里金属β-内酰胺酶介导β-内酰胺类抗生素耐药的菌株。名称中含有“cre”的菌株均为碳青霉烯类抗生素耐药菌株。名称中含flor的菌株表示氟苯尼考耐药的菌株。名称中含有“mcr”的菌株均为携带有多粘菌素耐药基因mcr的菌株。c、文献1为liuy，dings，dietrichr，e，zhuk.abiosurfactantinspiredheptapeptidewithimprovedspecificitytokillmrsa[j].angewandtechemieinternationaledition，2017，56(6)，1486-1490.粪肠球菌(enterococcusfaecalis)vrea4、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)mrsat144、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)215(lzdr+cfr)和绿脓杆菌(pseudomonasaeruginosa)pa14在文献1中的名称依次为enterococcusfaecalisvrea4、mrsat144、staphylococcusaureus215(lzdr+cfr)和pseudomonasaeruginosapa14。d、文献2为yangzq，huangyl，zhouhw，etal.persistentcarbapenem-resistantklebsiellapneumoniae：atrojanhorse[j].lancetinfectiousdiseases，2017，18(1):22.肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)1、肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)2、肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)3和肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)4在文献2中的名称依次为crkp1、crkp2、crkp3和crkp4。e、文献3为lingz，yinw，lih，etal.chromosome-mediatedmcr-3variantsinaeromonasveroniifromchickenmeat[j].antimicrobialagentsandchemotherapy，2017，61(11)：e01272-17.维氏气单胞菌(aeromonasveronii)172(mcr-3)在文献3中的名称为aeromonasveronii172。f、来源中为自行分离的菌株的分离过程如下：(1)分别采集山东、河南、四川等省份的距离较远的不同屠宰场、养殖场内猪鼻拭子，超市内零售鸡肉、猪肉等，将其浸渍于bhi液体培养基中5min，并将其过滤，滤液保存于eswab管中备用；(2)用接种环蘸取不同滤液涂布于含2μg/ml的多粘菌素的科马嘉尿道定位显色培养基上，37℃培养18h，挑选红色(大肠杆菌)、蓝色(肺炎克雷伯菌属、枸橼酸杆菌属、肠杆菌属)或奶油色半透明(假单胞杆菌属)的单克隆菌株转接到bhi平板上，37℃培养18h。用超厚滤纸片从平板上刮取适当细菌转移到2ml无菌试管中，置于-20℃冰箱中保存备用；(3)挑选单克隆菌株接种于bhi液体培养基中增菌，然后提取基因组dna；(4)以步骤(3)提取的基因组dna为模板，采用常规pcr扩增16srrna和测序的方法进一步确证菌属；同时，扩增mcr基因检测。扩增16srrna的引物为5＇-agagtttgatcctggctcag-3＇和5＇-tacggctaccttgttacgactt-3′；反应运行参数为：94℃10min；94℃30s，55℃40s，72℃，2min，30cycles；72℃，10min。扩增mcr-1的引物为5′-cggtcagtccgtttgttc-3′和5′-cttggtcggtctgtaggg-3′；反应运行参数为：94℃10min；94℃30s，55℃30s，72℃，50s，36cycles；72℃，5min。扩增mcr-3的引物为5′-ttggcactgtattttgcattt-3′和5′-ttaacgaaattggctggaaca-3′；反应运行参数为：95℃30s，50℃30s，72℃，45s，30cycles；72℃，7min。扩增mcr-6的引物为5′-aaccgccagagcacagaatt-3′和5′-aaccgccagagcacagaatt-3′；反应运行参数为：94℃10min；94℃30s，60℃30s，72℃，50s，36cycles；72℃，5min。采用肉汤稀释法(clinicalandlaboratorystandardsinstitute，clsi，2017)检测线性抗菌寡肽slap-s25对待测菌株的最小抑菌浓度(mic)。检测线性抗菌寡肽slap-s25对各待测菌株的最小抑菌浓度的步骤如下：1、用mhb肉汤培养基悬浮待测菌株，得到菌浓度为1×108cfu/ml的菌悬液。2、取线性抗菌寡肽slap-s25，用水溶解并用mhb肉汤培养基稀释，得到浓度为512μg/ml的线性抗菌寡肽slap-s25溶液。3、取96孔板，加入mhb肉汤培养基(每孔100μl)，第一列每孔加入步骤2制备的线性抗菌寡肽slap-s25溶液(每孔100μl)，倍比稀释至第十孔，第十孔弃掉100μl液体，之后每孔加入100μl步骤1制备的菌悬液，最终线性抗菌寡肽slap-s25在孔中的浓度为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0μg/ml、64.0μg/ml或128.0μg/ml，37℃静置培养16h-20h，观察孔内抑制细菌生长的最低浓度即为mic。在96孔板中设置阴性对照孔和阳性对照孔。每个阴性对照孔加入200μlmhb肉汤培养基。每个阳性对照孔加入100μlmhb肉汤培养基和100μl步骤1制备的菌悬液。实验结果见表2。结果表明，线性抗菌寡肽slap-s25对革兰氏阳性菌(如金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、绿脓杆菌、鲍氏不动杆菌、维氏气单胞菌、弗氏枸橼酸杆菌、解鸟氨酸乌拉尔菌、粘质沙雷氏菌、产碱普罗威登斯菌、植生乌拉尔菌和阴沟肠杆菌)均具有良好的抗菌活性，对革兰氏阳性菌(含耐药菌)的最小抑菌浓度为8-64μg/ml，对革兰氏阴性菌(含耐药菌)的最小抑菌浓度为0.5-32μg/ml。表2实施例3、线性抗菌寡肽slap-s25和抗菌药物的协同作用四环素属于四环素类药物。万古霉素属于糖肽类药物。氧氟沙星属于喹诺酮类药物。利福平属于利福霉素类药物。多粘菌素属于环肽类药物。氨苄西林和亚胺培南属于β-内酰胺类药物。一、线性抗菌寡肽slap-s25和抗菌药物的协同作用1、线性抗菌寡肽slap-s25和抗菌药物对革兰氏阴性菌的协同作用抗菌药物为四环素、万古霉素、氧氟沙星、利福平、多粘菌素或亚胺培南。采用棋盘分析法检测线性抗菌寡肽slap-s25与不同抗菌药物的协同作用，测试菌株为大肠杆菌(escherichiacoli)b2(ndm-5+mcr-1)，棋盘分析法具体步骤如下：1)用mhb肉汤培养基悬浮测试菌株，得到菌浓度为1×108cfu/ml的菌悬液。2)取线性抗菌寡肽slap-s25，用水溶解并用mhb肉汤培养基稀释，得到浓度为256μg/ml的线性抗菌寡肽slap-s25溶液。3)取抗菌药物，用水溶解并用mhb肉汤培养基稀释，得到浓度为128μg/ml的抗菌药物溶液。4)取96孔板，每孔加入100μlmhb肉汤培养基，最后一行每孔加入100μl步骤2)制备的线性抗菌寡肽slap-s25溶液(第一孔浓度为512μg/ml)，自第八行倍比稀释至第二行；第一列每孔加入加入步骤3)制备的抗菌药物溶液(每孔100μl)，倍比稀释至第十列，之后每孔加入100μl步骤1)制备的菌悬液，37℃静置培养16h-20h，观察线性抗菌寡肽slap-s25与不同抗菌药物联合使用抑制细菌生长时二者的最低浓度组合。设置阳性对照孔，每个阳性对照孔加入100μlmhb肉汤培养基和100μl步骤1)制备的菌悬液。分级抑菌浓度fic指数按照以下公式进行计算：fic＝mic(a联合应用)/mic(a单用)+mic(b联合应用)/mic(b单用)实验结果见表3。结果表明，线性抗菌寡肽slap-s25可将抗菌药物对大肠杆菌(escherichiacoli)b2(ndm-5+mcr-1)的mic降低4-128倍。线性抗菌寡肽slap-s25和抗菌药物(亚胺培南、四环素、万古霉素、氧氟沙星、利福平或多粘菌素)的fic指数均低于0.5，因此线性抗菌寡肽slap-s25和上述六种抗菌药物均具有良好的协同作用。表3fic抗菌药物fics25fic指数四环素0.0310.2500.281万古霉素0.0310.0630.094氧氟沙星0.0310.0630.094利福平0.0310.0010.032多粘菌素0.0160.0310.047亚胺培南0.06250.1250.1872、线性抗菌寡肽slap-s25和抗菌药物对革兰氏阳性菌的协同作用抗菌药物为四环素、万古霉素、氧氟沙星、氨苄西林、利福平或多粘菌素。采用棋盘分析法测定线性抗菌寡肽slap-s25和抗菌药物对革兰氏阳性菌的协同作用，具体实验方法同步骤1，测试菌株为金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)atcc29213、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)mrsat144、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)atcc6051。实验结果见表4。结果表明，对革兰氏阳性菌，线性抗菌寡肽slap-s25与氨苄西林发挥较强的协同作用。对三种革兰氏阳性菌，线性抗菌寡肽slap-s25和氨苄西林的fic指数均低于0.5，因此，线性抗菌寡肽slap-s25和氨苄西林对革兰氏阳性菌具有良好的协同作用。表4二、线性抗菌寡肽slap-s25恢复多粘菌素耐药的革兰氏阴性菌对多粘菌素的敏感性含mcr耐药基因的革兰氏阴性菌详见表5第1列，均为mcr耐药基因阳性的菌株。采用棋盘分析法测定线性抗菌寡肽slap-s25和抗菌药物对mcr阳性革兰氏阴性菌的协同作用，具体实验方法同步骤一中1。实验结果见表5。结果表明，线性抗菌寡肽slap-s25和多粘菌素的fic指数均低于0.375，因此线性抗菌寡肽slap-s25可恢复耐多粘菌素的革兰氏阴性菌(除肺炎克雷伯氏菌外)对多粘菌素的敏感性。表5三、线性抗菌寡肽slap-s25与抗菌药物对肺炎克雷伯氏菌的协同作用抗菌药物为四环素、万古霉素、氧氟沙星、氨苄西林、亚胺培南、利福平或多粘菌素。测定线性抗菌寡肽slap-s25和抗菌药物对多粘菌素耐药及不耐药的肺炎克雷伯氏菌的协同作用，其中多粘菌素耐药肺炎克雷伯氏菌为肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)16-63(mcr-1)、肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)4-20(mcr-6)或肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)91(mcr-6)，多粘菌素不耐药肺炎克雷伯氏菌为肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)2。棋盘分析法测定线性抗菌寡肽slap-s25和抗菌药物的协同作用具体方法同步骤一中1。实验结果见表6：针对多粘菌素耐药及不耐药肺炎克雷伯氏菌，线性抗菌寡肽slap-s25和利福平的fic指数均低于0.065，线性抗菌寡肽slap-s25和氧氟沙星的fic指数均低于0.127，线性抗菌寡肽slap-s25和四环素的fic指数均低于0.129；针对多粘菌素不耐药肺炎克雷伯氏菌，线性抗菌寡肽slap-s25和亚胺培南的fic指数低于0.187。结果表明，线性抗菌寡肽slap-s25可降低抗菌药物利福平、氧氟沙星、四环素及亚胺培南的对肺炎克雷伯氏菌的最小抑菌浓度。对肺炎克雷伯氏菌，线性抗菌寡肽slap-s25与抗菌药物利福平、氧氟沙星、四环素及亚胺培南可发挥较强的协同作用。表6-1表6-2表6-3实施例4、线性抗菌寡肽slap-s25的溶血性试验pbs缓冲液为ph7.4、0.01m的pbs缓冲液。8％红细胞悬浮液的制备方法如下：(1)取脱纤维羊血10ml，3000g离心10min，弃上清，得到沉淀；(2)取步骤(1)得到的沉淀，用pbs缓冲液清洗两次，得到100％红细胞悬浮液；(3)将8ml100％红细胞悬浮液和92mlpbs缓冲液混合，得到8％红细胞悬浮液。取线性抗菌寡肽slap-s25，用水溶解，然后用pbs缓冲液稀释，得到浓度为1024μg/ml的线性抗菌寡肽slap-s25溶液。1、取96孔板，每孔加入100μlpbs缓冲液。2、完成步骤1后，取所述96孔板，第一孔加入100μl线性抗菌寡肽slap-s25溶液，倍比稀释至第八孔；第二孔至第八孔中，线性抗菌寡肽slap-s25的浓度依次为512μg/ml、256μg/ml、128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml和8μg/ml(每个浓度三个复孔)。3、完成步骤2后，取所述96孔板，每孔加入100μl8％红细胞悬浮液，37℃孵育1h，3000g离心10min，吸取100μl上清液。4、测量步骤3得到的上清液的od576nm值，即线性抗菌寡肽slap-s25溶液od576nm值。5、将步骤2替换为步骤a，其它步骤均不变，得到阴性对照od576nm值。步骤a为：取所述96孔板，每孔加入100μlpbs缓冲液。6、将步骤2替换为步骤b，其它步骤均不变，得到阳性对照od576nm值。步骤b为：取所述96孔板，每孔加入100μltritonx-100。根据下述公式计算溶血率：溶血率＝(线性抗菌寡肽slap-s25溶液od576nm值-阴性对照od576nm值)/(阳性对照od576nm值-阴性对照od576nm值)×100％。部分实验结果见图1。结果表明，线性抗菌寡肽slap-s25的浓度为8—256μg/ml时，均不具有溶血性。实施例5、线性抗菌寡肽slap-s25在治疗小鼠细菌感染和菌血症一、线性抗菌寡肽slap-s25治疗小鼠细菌感染pbs缓冲液为ph7.4、0.01m的pbs缓冲液。大肠杆菌悬浮液：用pbs缓冲液重悬大肠杆菌(escherichiacoli)b2(ndm-5+mcr-1)，得到大肠杆菌悬浮液；该大肠杆菌悬浮液中，大肠杆菌(escherichiacoli)b2(ndm-5+mcr-1)的浓度为1.0×109cfus/ml。多粘菌素溶液：将800mg多粘菌素溶于1l无菌水得到。slap-s25溶液：将800mg线性抗菌寡肽slap-s25溶于1l无菌水得到。混合溶液：将800mg多粘菌素和800mg线性抗菌寡肽slap-s25溶于1l无菌水得到。1、小鼠分组处理取24只体重为18—22g的balb/c雌性小鼠，随机分成pbs组、slap-s25治疗组、多粘菌素治疗组和协同治疗组(每组6只)，分别进行如下处理：pbs组：小鼠右侧大腿肌肉注射0.1ml的大肠杆菌悬浮液；1h后腹腔注射0.2mlpbs缓冲液；slap-s25治疗组：小鼠右侧大腿肌肉注射0.1ml的大肠杆菌悬浮液；1h后腹腔注射0.2mlslap-s25溶液；多粘菌素治疗组：小鼠右侧大腿肌肉注射0.1ml的大肠杆菌悬浮液；1h后腹腔注射0.2ml多粘菌素溶液；协同治疗组：小鼠右侧大腿肌肉注射0.1ml的大肠杆菌悬浮液；1h后腹腔注射0.2ml混合溶液。2、测定小鼠大腿感染的菌落数将完成步骤1后第48h的小鼠安乐死，取右侧大腿肌肉，将肉块匀浆、混匀，然后取适量涂布于tsa培养基上，测定菌落数。实验结果见图2。结果表明，与多粘菌素治疗组相比，协同治疗组能有效的降低小鼠大腿感染的菌落数。二、线性抗菌寡肽slap-s25治疗小鼠菌血症pbs缓冲液为ph7.4、0.01m的pbs缓冲液。大肠杆菌悬浮液：用pbs缓冲液重悬大肠杆菌(escherichiacoli)b2(ndm-5+mcr-1)，得到大肠杆菌悬浮液；该大肠杆菌悬浮液中，大肠杆菌(escherichiacoli)b2(ndm-5+mcr-1)的浓度为1.5×1010cfus/ml。多粘菌素溶液：将800mg多粘菌素溶于1l无菌水得到。slap-s25溶液：将800mg线性抗菌寡肽slap-s25溶于1l无菌水得到。混合溶液：将800mg多粘菌素和800mg线性抗菌寡肽slap-s25溶于1l无菌水得到。1、小鼠分组处理取24只体重为18—22g的balb/c雌性小鼠，随机分成pbs组、slap-s25治疗组、多粘菌素治疗组和协同治疗组(每组6只)，分别进行如下处理：pbs组：小鼠腹腔注射0.2ml的大肠杆菌悬浮液；1h后腹腔注射0.2mlpbs缓冲液；slap-s25治疗组：小鼠腹腔注射0.2ml的大肠杆菌悬浮液；1h后腹腔注射0.2mlslap-s25溶液；多粘菌素治疗组：小鼠腹腔注射0.2ml的大肠杆菌悬浮液；1h后腹腔注射0.2ml多粘菌素溶液；协同治疗组：小鼠腹腔注射0.2ml的大肠杆菌悬浮液；1h后腹腔注射0.2ml混合溶液。2、统计存活率对完成步骤1后第48h的小鼠，统计存活率。实验结果见图3中a。结果表明，与多粘菌素治疗组相比，协同治疗组的小鼠存活率显著提高。3、测定小鼠器官中的菌落数取完成步骤1后第48h的小鼠，分离器官(如心、肝、脾、肺和肾)，然后测定各个器官内的菌落数。实验结果见图3中b。结果表明，与多粘菌素治疗组相比，协同治疗组的小鼠心、肝、脾、肺或肾中的菌落数也显著降低。上述结果表明，线性抗菌寡肽slap-s25可以用于治疗小鼠细菌感染和菌血症。实施例6、线性抗菌寡肽slap-s25治疗大蜡螟幼虫细菌感染pbs缓冲液为ph7.4、0.01m的pbs缓冲液。大肠杆菌悬浮液：用pbs缓冲液重悬大肠杆菌(escherichiacoli)b2(ndm-5+mcr-1)，得到大肠杆菌悬浮液；该大肠杆菌悬浮液中，大肠杆菌(escherichiacoli)b2(ndm-5+mcr-1)的浓度为1.0×107cfus/ml。多粘菌素溶液：将160mg多粘菌素溶于1l无菌水得到。slap-s25溶液：将160mg线性抗菌寡肽slap-s25溶于1l无菌水得到。混合溶液：将160mg多粘菌素和160mg线性抗菌寡肽slap-s25溶于1l无菌水得到。1、大蜡螟幼虫分组处理取32只体重为190—210mg的大蜡螟幼虫，随机分成pbs组、slap-s25治疗组、多粘菌素治疗组和协同治疗组(每组8只)，分别进行如下处理：pbs组：大蜡螟幼虫左下第二腹足注射0.01ml大肠杆菌悬浮液；1h后右下第二腹足注射0.01mlpbs缓冲液；slap-s25治疗组：大蜡螟幼虫左下第二腹足注射0.01ml大肠杆菌悬浮液；1h后右下第二腹足注射0.01mlslap-s25溶液；多粘菌素治疗组：大蜡螟幼虫左下第二腹足注射0.01ml大肠杆菌悬浮液；1h后右下第二腹足注射0.01ml多粘菌素溶液；协同治疗组：大蜡螟幼虫左下第二腹足注射0.01ml大肠杆菌悬浮液；1h后右下第二腹足注射0.01ml混合溶液。2、统计存活率分别于完成步骤1后第1天、第2天、第3天、第4天和第5天，统计大蜡螟幼虫的存活率。实验结果见图4。结果表明，与多粘菌素治疗组相比，协同治疗组的大蜡螟幼虫存活率显著提高。实施例7、线性抗菌寡肽slap-s25的衍生物及其应用1、将线性抗菌寡肽slap-s25的氨基酸序列经过四个以下氨基酸残基的取代，得到表7中第2至15行所示的寡肽(取代的氨基酸字母加粗显示，所有寡肽氮端的氨基酸进行乙酰化修饰，碳端的氨基酸进行酰胺化修饰)。将线性抗菌寡肽slap-s25的氨基酸序列经过四个以下氨基酸残基的缺失，得到表7中第16至18行所示的寡肽。改变线性抗菌寡肽slap-s25中至少一个氨基酸的手性，得到表7中第19至21行所示的寡肽(val由d改变为l，phe由d改变为l)。人工合成表7所示的各个寡肽。按照实施例2的方法，测定表7所示寡肽的抑菌活性。待测菌株为大肠杆菌(escherichiacoli)atccno.25922、大肠杆菌(escherichiacoli)b2(ndm-5+mcr-1)或金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)atcc29213。实验结果见表7中第4列。表72、表7所示的寡肽和抗菌药物对革兰氏阴性菌的协同作用测试菌株为大肠杆菌(escherichiacoli)b2(ndm-5+mcr-1)。棋盘分析法测定表7所示的各个寡肽和多粘菌素的协同作用，具体方法同实施例3步骤一中1。部分实验结果见表8。结果表明，表7所示的各个寡肽和多粘菌素的fic指数均低于0.5。因此表7所示的各个寡肽和多粘菌素均具有良好的协同作用。表8寡肽名称ficslaps25-10.375slaps25-2≤0.15625slaps25-30.0468slaps25-40.375slaps25-5≤0.3125slaps25-60.0468slaps25-70.078slaps25-80.078slaps25-90.093slaps25-100.09375slaps25-110.031slaps25-130.125slaps25-150.094slaps25-160.078slaps25-170.156slaps25-180.25slaps25-190.25slaps25-200.156<110>中国农业大学<120>线性抗菌寡肽slap-s25及其应用<160>21<170>patentinversion3.5<210>1<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223><400>1dabiledabiledabpheleudabvalleuala1510<210>2<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223><400>2alailedabiledabpheleudabvalleuser1510<210>3<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223><400>3dabaladabiledabpheleudabvalleuser1510<210>4<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223><400>4dabilealailedabpheleudabvalleuser1510<210>5<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223><400>5dabiledabaladabpheleudabvalleuser1510<210>6<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223><400>6dabiledabilealapheleudabvalleuser1510<210>7<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223><400>7dabiledabiledabalaleudabvalleuser1510<210>8<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223><400>8dabiledabiledabphealadabvalleuser1510<210>9<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223><400>9dabiledabiledabpheleualavalleuser1510<210>10<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223><400>10dabiledabiledabpheleudabalaleuser1510<210>11<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223><400>11dabiledabiledabpheleudabvalalaser1510<210>12<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223><400>12dabiledabiledabpheleudabvalleuser1510<210>13<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223><400>13alailealailealapheleualavalleuser1510<210>14<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223><400>14lysilelysilelyspheleulysvalleuser1510<210>15<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223><400>15argileargileargpheleuargvalleuser1510<210>16<211>10<212>prt<213>人工序列<220><223><400>16dabiledabiledabpheleudabvalleu1510<210>17<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223><400>17dabiledabiledabpheleudabval15<210>18<211>8<212>prt<213>人工序列<220><223><400>18dabiledabiledabpheleudab15<210>19<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223><400>19dabiledabiledabpheleudabvalleuser1510<210>20<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223><400>20dabiledabiledabpheleudabvalleuser1510<210>21<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223><400>21dabiledabiledabpheleudabvalleuser1510当前第1页12