本发明涉及一种鹿筋蛋白低聚肽的工业化生产工艺，属于医药工业、中成药、功能保健品及化妆品添加剂领域。
背景技术：
我国是世界上养鹿和使用鹿产品最早的国家，已有260多年的养鹿历史和1300多年的鹿产品药用史。我国鹿产品多为原料粗加工产品,极大地浪费了珍贵的鹿资源。缺少以鹿产品为主要原料的保健品、食品和化妆品等精深加工产品。鹿筋为鹿科动物梅花鹿或马鹿四肢的筋。性温，味淡微咸，有补肾阳、壮筋骨之功效。鹿筋胶原蛋白能有效控制骨质丢失,促进骨形成,改善骨代谢的负平衡状态,对维甲酸导致的骨质疏松症具有良好的防治作用。随着蛋白低聚肽市场需求的日益扩大，开发具有生物保健活性的高效安全环保的鹿筋蛋白低聚肽生产工艺，对科学研究及实际应用均具有重要意义。
技术实现要素：
本发明是在上述背景下而提供一种产出率高、纯度高的鹿筋蛋白低聚肽的工业化生产工艺。
本发明包括以下步骤：1、原料、2、浸泡软化、3、绞碎、4、脱脂、5、磨浆、6、盐析、7、压滤、8、酶解、9、超滤低聚肽、10、纳滤截留浓缩、脱盐、脱杂质、11、除菌、12、灌装、13、冷冻干燥、14、压瓶盖塞、贴标签。采用酶技术进行酶解，收集合适分子量的肽片段，采用超滤膜技术，经过浓缩、冷冻真空干燥制备出具备多种生理活性功能的鹿筋蛋白低聚肽。
一种鹿筋蛋白低聚肽的工业化生产工艺，具步骤如下：
1、原料
原料选用经过刮洗与浸泡，剥离筋膜，刮去残肉，的干鹿筋。
2、浸泡软化
将干鹿筋放入不锈钢清洗槽中，注入纯净水，浸泡48h-72h，直至鹿筋完全复水，成为松软状态。
3、绞碎
将泡松软的鹿筋捞出淋水后，放入绞肉机中,将其绞碎成粒度为0.1-0.2cm的碎块。
4、脱脂
将绞碎鹿筋用1.0-2.0%醋酸溶液的脱脂液浸泡脱脂1-2d（天）,最后用30-50℃温水漂洗2次,,获得脱脂浸泡的鹿筋。
5、磨浆
将脱脂后的鹿筋用骨泥磨研磨成浆液，使成为颗粒在20～50μm大小精磨浆液。
6、盐析
将制得的精磨浆液调节ph值4.0～4.5，加入nacl粉末进行盐析，边加边搅拌，使胶原蛋白完全析出后，静置12～24h，获得胶原混合液。
7、压滤
将混合液均匀铺设到板框滤布上，输送混合液开始压滤1～6h，通过出口阀的开度调节控制压滤进度，弃去滤饼，得到透明的滤液。
8、酶解
将压滤后的浆液调节ph值为9.0～9.5，在50℃～60℃条件下，加入1-3％胰蛋白酶，使鹿筋蛋白酶解反应8h～10h，在酶解过程中以30转/min不断搅拌后得到含有低聚肽混合液。
9、超滤低聚肽
将酶解液经反渗透超滤机组进行分级超滤，先经过分子量75kda的超滤器，再经过分子量3kda的超滤器过滤。合适分子量片段的肽透过膜进入收集器，大片段的肽继续和酶作用再酶解，再超滤获得低聚肽过滤液。超滤后将其温度升温至80～95℃进行高温灭酶。
10、纳滤截留浓缩、脱盐、脱杂质
将蛋白低聚肽滤液泵入反渗透纳滤机组的分子量为500da的纳滤器中进行浓缩。再将浓缩液加同样的体积水洗脱3-5次，获得浓缩至含水量仅有3-5%左右的最小体积的纳滤截留液。将收集含有原料中的其他物质及无机盐等纳滤过滤液，进行净化处理,收集的纳滤截留液为低聚肽浓缩液。
11、除菌
将浓缩液采用分子量60-80kda中空纤维超滤器过滤后，再进入0.22μm微孔滤芯进行过滤，通过截留的方式进行除菌。
12、灌装
除菌后的低聚肽浓缩液用自动灌装机进行灌装，装入清洁无菌的10ml西林瓶中，剂量控制在5ml以内，保证净含量的稳定，每瓶装量200mg，并加压将橡胶塞塞至半加塞状态，得到灌装好的产品。
13、冷冻干燥
（1）预冻固化
将罐装浓缩液西林瓶，摆放在真空冷冻干燥机冻干仓内的隔板上，预冻固化温度-30～-45℃，并保持5～8h，使浓缩液中水分充分冻结，确保无液体存在。
（2）升华干燥：冻干机启动真空系统，将仓内压力抽至30～50pa，采取缓慢升温,以每小时1℃的升温速率,缓慢升温到-20～-25℃,保温6～8h,再以每小时2℃的升温速率,缓慢升温到-10℃～-12℃,保温3～6h，进行升华干燥。
（3）解析干燥：升华干燥后，再以每小时3℃的升温速率,缓慢升温到40～50℃,压力为10～20pa。保温6～8h,完成解析干燥冻干，加压塑料盖后取出。
14、压瓶盖塞、贴标签
冷冻干燥后在无菌条件下机械压瓶盖塞，进入贴标机使其贴好标签。制成蛋白纯度高达99.5%、相对分子质量小于1000da的低聚肽成份含量平均大于92%的鹿筋低聚肽成品粉。
与现有技术相比，本发明的主要优点在于：
1、作为本发明的进一步改进，本发明充分利用加工废弃物鹿筋为原料、容易得到、成本低、解决现有资源存在的利用率及附加值低的问题。干鹿筋经过浸泡软化，绞碎、再经骨泥磨研磨后使原料更细腻均匀，破碎效果好，提高提取的低聚肽含量创造了有利条件。
2、作为本发明的进一步改进，本发明在蛋白低聚肽提取上采用nacl粉末进行盐析的方法先将胶原蛋白置换出来，并在盐析后进行板框压滤机压滤，然后对压滤得浆液进行酶解。在酶解前对鹿筋胶原蛋白所用的酶进行了单酶及复合蛋白酶筛选验证，通过验证选用了具有复合酶功能的胰蛋白酶，并采取适度的酶解后、超滤、再酶解的反复酶解提取方法，破坏了部分肽键形成分子量小于1000da的蛋白低聚肽，对没有达到小分子肽的提取液实现了进一步酶解，最后采取高温灭酶，该酶解工艺设计使鹿筋胶原蛋白分解成小于1000da分子量的蛋白低聚肽的成份含量平均高达92%。因而提高了鹿筋蛋白活性和利用率。
3、作为本发明的进一步改进，本发明采用了反渗透超滤机组的超过滤方法，通过反复截留大分子物质，透过小分子物质而达到过滤、分离的目的。先经过分子量75kda的超滤器过滤，再经过分子量3kda的超滤器过滤，截留分子量在2000-100000da蛋白肽，将1000da以下的小分子量片段低聚肽透过膜进入收集器，大片段的肽继续和酶作用，再行超滤。保证了低聚肽产品的集中产出和原料的充分利用。
4、作为本发明的进一步改进，本发明采用分子量为500da反渗透纳滤机的纳滤器，通过纳滤获得了低聚肽截留浓缩液，同时使得盐、杂质随着纳滤过滤液被脱出。大大提高了蛋白低聚肽的纯度，使得蛋白低聚肽纯度高达99.5%。同时将收集的含有盐、杂质的纳滤过滤液,泵入生化处理池，进行净化处理,达标后排放，使得生产工艺达到了绿色环保标准。
5、作为本发明的进一步改进，本发明采用物理除菌的方法，根据蛋白低聚肽的分子量及细菌分子量选用了分子量60-80kda中空纤维超滤器再过滤，过滤后，进入0.22微米除菌小滤器进行除菌。该除菌的方法具有不破坏有效成分，不增加其他污染，效率高，除菌效果好，有效提高了蛋白低聚肽产品的保质期。
6、作为本发明的进一步改进，本发明蛋白低聚肽的生产是在高效连续自动化生产系统下生产，整个工艺流程多为封闭条件下生产，如采用自动灌装机进行灌装，尤其是本发明冷冻干燥采取了缓慢升温技术，使整个升华过程中温度不超过共熔点，不会造成冰晶融化而影响低聚肽粉的品质，保证了蛋白低聚肽产品的高活性。本发明环保优势突出，不使用有毒试剂、无污染物排放,达到清洁生产、绿色环保，产品安全卫生，具有较好的工业化生产先进性和实用性。为鹿筋合理利用开辟了新的途径，为鹿筋蛋白低聚肽产业化和规模化生产提供了有效的工艺方法。
具体实施方式
实施例1
一种鹿筋蛋白低聚肽的工业化生产工艺，其步骤如下：
1、原料
原料选用经过刮洗与浸泡，剥离筋膜，刮去残肉，冷水清洗除去残血，风干或烘干的干鹿筋。
2、浸泡软化
将干鹿筋放入不锈钢清洗槽中，注入纯净水，水位高度要超过鹿筋10-15cm，搅拌均匀，浸泡48h-72h，浸泡期间要换水2～4次，直至鹿筋完全复水，成为松软状态，同时浸泡除去血液成分。
3、绞碎
将泡松软的鹿筋捞出淋水后，放入绞肉机中,进行绞碎，将其绞碎成粒度为0.1-0.2cm的碎块。
4、脱脂
将绞碎鹿筋用1.0-2.0%醋酸溶液脱脂液浸泡脱脂1-2d,温度在25-30℃，每2h-3h充分搅拌1次，滤去上层液体,按上述方法再重复脱脂一次,最后用30-50℃温水漂洗2次,获得脱脂浸泡的鹿筋。
5、磨浆
将脱脂后的鹿筋反复通过骨泥磨2-3次，使成为颗粒在20～50μm大小精磨浆液。加水到500-1000l水位线，浸泡1～2d，去掉浸泡水，将浸泡好的鹿筋在骨泥磨再次磨浆1次，获得精磨浆。
6、盐析
将制得的精磨浆液投入3000l提取大罐，100kg浆液加水3000l，用0.5mol/lhcl溶液调节ph值4.0～4.5，搅拌均匀，然后加入nacl粉末进行盐析，边加边搅拌，保持30r/min搅拌浆液，一个小时左右加完100kg氯化钠。待胶原蛋白完全析出后，静置12～24h，获得胶原蛋白混合浆液。
7、压滤
将板框压滤机的板框铺设好3927号滤布，将0.5%硅藻土助滤剂加入盛有酶解液的罐中，然后充分搅拌均匀，配制成加有助滤剂的酶解液混合液的待滤液料，之后将混合液均匀铺设到板框滤布上，缓慢打开压滤泵的进口阀、出口阀，启动压滤中转泵，压强为0.1～1.0mpa，输送混合液开始压滤，通过出口阀的开度调节控制压滤进度，压滤完成后弃去滤饼，得到透明的过滤浆液。
8、酶解
将压滤后的浆液加入到2500l酶解罐中，按照每3l浆液加7l水,600l浆液约加水1400l，再加入氢氧化钠调节浆液的ph值为7.0～9.0，并且加热到50℃～60℃条件下，然后将1-3％胰蛋白酶加入到所述酶解罐中，使鹿筋蛋白与胰蛋白酶解反应8h～10h，在酶解过程中以30转/min不断搅拌，通过酶解得到含有大量低聚肽的混合液。
9、超滤低聚肽
将酶解后的低聚肽混合液经反渗透超滤机组进行分级超滤，先经过分子量75kda的超滤器过滤，再经过分子量3kda的超滤器过滤。超滤过程中保证压强3.0-5.0mpa,流速1000-1200l/h,每次加水800l超滤2-3次，超滤后合适分子量片段的肽透过膜进入收集器，截留的大片段的肽继续和酶作用再酶解，再超滤获得合适分子量片段的肽。如此反复得到蛋白低聚肽过滤液。超滤后将过滤液温度升温至80～95℃进行高温灭酶，10～25min。
10、纳滤截留浓缩、脱盐、脱杂质
将蛋白低聚肽滤液泵入反渗透纳滤机组的分子量为500da的超滤器中，保持压力2.5～3.5mpa,温度为15～45℃的条件下，进行反渗透纳滤浓缩,直至纳滤截留液浓缩至含水量仅有3-5%左右的最小体积，再将浓缩液加同样的体积水洗脱3-5次，同样获得浓缩至含水量仅有3-5%左右的最小体积纳滤截留液。分别进行收集纳滤过滤液及纳滤截留液，将收集含有原料中的其他杂质物质及无机盐等纳滤过滤液，泵入生化处理池进行净化处理,达标后排放，收集的纳滤截留液为鹿筋低聚肽浓缩液，对其进入除菌工序。
11、除菌
采用分子量60-80kda中空纤维超滤器过滤后，再进入0.22μm微孔滤芯进行过滤，在压力2.0-3.0mpa，超滤料液流速1.2-1.8l/min条件下，通过截留的方式对鹿筋低聚肽浓缩液进行除菌，除菌完毕后，用不锈钢密封桶密封好进入灌装。
12、灌装
将除菌后的低聚肽浓缩液用自动灌装机进行灌装，采用清洁无菌的10ml西林瓶中。西林瓶先通过紫外线传递窗进入洗瓶间超声洗瓶机每分钟可洗200瓶洗好的瓶进入烘干机在预热温度280℃、灭菌温度300℃、保温260℃程序下烘干，每小时完成1万瓶西林瓶灭菌烘干。西林瓶进入无菌间开始灌装，剂量控制在5ml以内，保证净含量的稳定，每瓶装量200mg，每分钟灌装200瓶，并加压橡胶塞至半加塞状态后，将灌装好的产品进入真空冷冻干燥机中冻干。
13、冷冻干燥
（1）预冻固化
将罐装浓缩液西林瓶，摆放在真空冷冻干燥机冻干仓内的隔板上，预冻固化温度-30～-45℃，并保持5～8h，使浓缩液中水分充分冻结，确保无液体存在。
（2）升华干燥：冻干机启动真空系统，将仓内压力抽至30～50pa，采取缓慢升温,以每小时1℃的升温速率,缓慢升温到-20～-25℃,保温6～8h,再以每小时2℃的升温速率,缓慢升温到-10℃～-12℃,保温3～6h，进行升华干燥。
（3）解析干燥：升华干燥后，再以每小时3℃的升温速率,缓慢升温到40～50℃,压力为10～20pa。保温6～8h,完成解析干燥冻干，加压塑料盖后取出。
14、压瓶盖塞、贴标签
冷冻干燥后在无菌条件下机械压盖瓶塞，进入贴标机使其贴好标签。制成蛋白纯度高达99.5%、相对分子质量小于1000da的低聚肽成份含量大于92%的鹿筋低聚肽成品粉。
实施例2
称取100kg干鹿筋，浸泡48h-72h，直至鹿筋完成复水成为松软状态。放绞肉机中绞碎成粒度为0.1-0.2cm的碎块。用1.0-2.0%醋酸溶液脱脂1-2d,用30-50℃温水漂洗2次。用骨泥磨研磨成颗粒在20～50μm大小精磨浆液。调节ph值4.0～4.5，加入nacl粉末进行盐析，用板框压滤机压滤，将得到透明的滤液调节ph值为9.0～9.5，在50℃～60℃条件下，加入1-3％胰蛋白酶酶解反应8h～10h。将酶解液分级超滤，先经过分子量75kda的超滤器，再经过分子量3kda的超滤器过滤。超滤后将其温度升温至80～95℃进行高温灭酶。再经分子量为500da的纳滤器中进行浓缩。洗脱3-5次，使浓缩至含水量仅有3-5%左右的最小体积。将含杂质及无机盐等的纳滤过滤液进行净化处理。将低聚肽浓缩液采用分子量60-80kda中空纤维超滤器过滤后，再进入0.22μm滤芯过滤除菌。用自动灌装机进行灌装，10ml西林瓶剂量控制在5ml以内，每瓶装量200mg。真空冷冻干燥机冷冻干燥。制成蛋白纯度高达99.5%、相对分子质量小于1000da的低聚肽成份含量平均高达92%的鹿筋低聚肽成品粉。100kg干鹿筋原料平均可生产22.5kg低聚肽粉。