本发明属于生物技术领域，具体地涉及一种5'端磷酸化单链dna(5'p-ssdna)的制备方法及其应用。
背景技术：
近年来，以crispr(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)技术为代表的新一代基因编辑技术由于其精准的靶向性和易用性，在生物学基础研究和生物医学应用中已经展现出不可估量的潜力。这类基因编辑系统通常利用了细菌中天然存在的防御机制，实现对入侵dna的靶向剪切。除了crispr系统的cas9系列限制性内切酶(也简称内切酶)之外，一些基于其他内切酶(例如argonaute)的基因编辑系统也受到了广泛的关注。该类内切酶采用5'磷酸化的单链dna作为"引导"(guidedna，gdna)来帮助核酸酶识别目标基因序列并对其进行剪切。与crispr系统相比，这类系统采用短单链dna而非rna作为引导分子，无需构建用于rna表达的质粒，更加易于人工合成和直接转染。目前，商业化的单链dna化学合成技术已经非常成熟且价格低廉，使得利用单链dna(ssdna)作为引导的基因编辑系统在成本上比利用rna的crispr系统更有优势。更重要的是，常规的crispr系统要求目标区域下游具有特定的pam序列，而argonaute系统无类似限制，几乎可用于针对任何目标序列。
但是，与天然的dna末端不同，默认条件合成的单链dna5'端没有引入磷酸基团。为了获得可用于基因编辑系统的引导dna，我们需要对化学合成的单链dna进行合成后的5'端磷酸化修饰。因此，磷酸化的效率就成为了影响基因编辑效率的关键因素之一。目前已有的某些研究表明，由商业化的引物合成服务提供的化学磷酸化修饰方法所获得的5'-pssdna在基因编辑应用当中对目标基因的剪切效率不佳，而用t4核酸激酶催化的磷酸化修饰也存在效率难以优化、修饰产物难以表征和纯化的问题。
此外，基因工程中常用的经典dna限制性内切酶催化的剪切反应通常识别并作用于dna双链，剪切产物也是双链，因此不适合直接用于单链dna的5'磷酸化。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是为克服现有技术中存在的磷酸化效率低、剪切效率不佳等困难提供一种5'端磷酸化单链dna的制备方法及其应用。该制备方法具有操作简便、磷酸化效率高、适用范围广以及应用前景广阔等优点。
本发明解决上述问题的技术方案之一是：一种5'端磷酸化单链dna的制备方法，其包括如下步骤：
(1)在目的dna两端插入限制性内切酶的酶切位点序列，形成茎环结构前体，其中所述目的dna位于茎环结构前体的环状单链区域，所述酶切位点序列位于茎环结构前体的茎部双链区域；
(2)将步骤(1)获得的茎环结构前体溶解于缓冲液中并进行退火处理，获得茎环结构溶液；
(3)将步骤(2)获得的茎环结构溶液加入限制性内切酶处理，处理后使限制性内切酶失活，得酶切产物；
(4)将步骤(3)所得酶切产物回收，即得。
较佳地，步骤(1)中所述酶切位点序列含有限制性内切酶的识别序列及酶切位点，所述的限制性内切酶的酶切位点与识别序列分离；更佳地，酶切位点位于识别序列下游，因此对酶切位点下游的产物5’端序列没有限制，茎环结构在限制性内切酶作用下被切断，释放5'端带有磷酸基团的目的dna，即所述酶切位点序列与相邻的目的dna的碱基具有如下序列：
5'-s1n1n2n3-3'
3'-s2n4n5n6-5'；
所述s1为限制性内切酶的识别序列的正向序列，所述s2为限制性内切酶的识别序列的反向序列，所述n1、n2为目的dna3’末端两个碱基的反向互补序列，n3-n6为目的dna的碱基，所述酶切位点位于n2和n3之间以及s2和n4之间。
较佳地，所述的酶切位点序列还含有保护碱基序列，其中s1的5’端具有保护碱基序列1，s2的3’端具有保护碱基序列2，保护碱基序列1与保护碱基序列2反向互补；较佳地，所述保护碱基序列为含有3-6个碱基的gc含量高的序列，其中gc含量高的保护碱基序列用于确保茎环结构形成，保证剪切效率；进一步较佳地，所述的保护碱基序列1为：gcgc、gggc或者cccg。
所述限制性内切酶为本领域常规的酶切位点与识别序列分离的限制性内切酶。较佳地，所述限制性内切酶为bsegi/bstf5i/btsci、btsαi/btsi、btsimuti或者bse3di/bsemi/bsrdi酶，上述4组酶的识别序列(下划线)以及酶切位点(箭头位置)分别为：
本发明通过选用酶切位点位于识别序列下游的限制性内切酶，使得对酶切位点下游的产物5'端序列没有限制，可用于制备几乎任意序列的5'p-ssdna。
步骤(2)中所述缓冲液为本领域处理核苷酸序列所用常规的缓冲液，通常选用限制性内切酶供应商产品说明书所提供的。
在本发明一较佳实施例中，限制性内切酶选用bsegi，目的dna两端带有限制性内切酶bsegi识别序列的茎环结构前体序列为：5'-gcgcggatg+目的dna3’末端两个碱基的反向互补序列n1n2+目的dna+catccgcgc-3'，其中斜体的gcgc为保护碱基序列。其中，所述缓冲液由bsegi酶供应商产品说明书提供，含有下列成分：mgcl25mm，tris-hcl10mm，dna10μm；ph8.0。所述退火处理为本领域常规；较佳地，所述退火处理为热循环仪95℃处理5分钟，然后迅速降温至4℃，并保持10分钟。步骤(3)中所述限制性内切酶处理以及限制性内切酶失活为本领域常规；较佳地，所述酶活单位为8-15u，所述限制性内切酶处理为33-38℃处理12小时以上；更佳地，所述酶活单位为10u，所述限制性内切酶处理为37℃处理12小时。使限制性内切酶bsegi失活的方法为本领域常规，较佳地，所述的使限制性内切酶失活为60-68℃处理茎环结构溶液15-25分钟；更佳地，所述的使限制性内切酶失活为65℃处理茎环结构溶液20分钟。
步骤(4)中所述回收为本领域常规，较佳地为电泳回收；更佳地，所述电泳为非变性凝胶电泳，最佳地，所述非变性凝胶电泳为8％非变性聚丙烯酰胺凝胶(page)电泳。
本发明解决上述问题的技术方案之二是：一种基于内切酶的基因编辑、靶向定位和/或调控方法，其包括：将用于表达argonaute系统内切酶蛋白的质粒与通过上述制备方法制得的5'端磷酸化单链dna共转染到所要基因编辑、靶向定位和/或调控的细胞当中，进行基因编辑、靶向定位和/或调控操作；较佳地，所述内切酶为ngago。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实施例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
(1)步骤简单，成本低廉：含有酶切位点的dna茎环结构设计简单，无需合成双链dna，在目的序列两段加入固定序列，利用常规的单链引物合成服务即可获得带有茎环结构的前体；同时，切割的产物也是dna单链，无需通过双链变性或非对称pcr获得；
(2)磷酸化效率高：剪切效率等于磷酸化的效率，限制性内切酶剪切后的dna的5'端必然带有磷酸基团，因此可以制备100％磷酸化的单链dna；
(3)易于表征和纯化：限制性内切酶处理后的产物用凝胶电泳即可进行验证和分离；
(4)适用范围广：对目的dna序列无特殊要求，不受限制性内切酶识别序列的限制，可以用于几乎任何序列的磷酸化；
(5)可重复利用，节能环保：剪切后的产物可以通过凝胶电泳回收，操作简单，无需专门的化学合成设备，易于大批量制备5'-pssdna；
(6)应用前景广：5'-pssdna可以作为gdna用于基因编辑系统，提供引导基因靶向剪切的高纯度的5'-pssdna，可以显著提高基因编辑效率。利用该技术还可以显著提高基于基因内切酶的基因靶向定位、基因调控的效率，因此该技术有巨大的应用前景。
附图说明
图1通过限制性内切酶剪切制备5’端磷酸基修饰的单链dna(5'p-ssdna)的示意图。
图2为5'p-ssdna的制备方法及产物检测，其中(a)为利用酶切法制备5'p-ssdna的原理示意图，加粗字体碱基为目的序列，带下划线碱基为限制性内切酶bsegi的识别序列，三角形代表酶切位点；(b)为聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)分析(dnamarker为20bpdnaladder)显示；(c)为未磷酸化修饰的ssdna(左侧线，相对分子质量为7485.7)及bsegi剪切后回收的dna(右侧线，相对分子质量为7565.5)的质谱检测结果。
图3为用酶切法制备的针对egfp质粒的gdna(egfp-gdna)用于ngago系统基因剪切实验的示意图。
图4为gdna(egfp-gdna)在哺乳动物细胞中的效果检测，其中(a)为egfp-gdna及用于分析质粒剪切情况的pcr引物在pegfp-c1质粒上的位置示意图；(b)为试验中用到的各dna及其序列；(c)为用于比较目标基因剪切效果的实验及对照组；(d)为利用荧光显微镜成像观察各组样品处理细胞的egfp的表达情况(白色尺度线长度为1mm)；(e)为各组样品处理后的细胞基因组pcr扩增结果。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1制备5'磷酸化的单链dna(5'p-ssdna)并对其进行表征
通过限制性内切酶bsegi(购自thermofisherscientific)剪切制备5’端磷酸基修饰的单链dna的过程如图1所示(其中，加粗部分为识别位点；两个三角箭头的指向位置为酶切位点)。
1.茎环结构前体设计：本实施例以针对egfp基因编码区的gdna(egfp-gdna，序列为：5'-gtggtcggggtagcggctgaagca-3'(seqidno.1)为目的dna，在其两端增加含有bsegi内切酶识别序列(ggatgnn^，n代表任意碱基，^代表剪切位点)的互补序列，得到的全部序列为：5'-gcgcggatgtggtggtcggggtagcggctgaagcacatccgcgc-3'(请见seqidno.2所示)(斜体部分为目的dna序列，下划线部分为bsegi识别序列，见图2(a))。通过商业化引物合成服务获得高效液相色谱(hplc)纯化后的该序列单链。
2.茎环结构前体制备：将步骤1得到的带有酶切位点的序列溶解于缓冲液中(mgcl225mm，tris-hcl10mm，ph8.0；dna终浓度10μm)(由bsegi供应商产品说明书提供)并进行退火处理(热循环仪95℃处理5分钟，然后迅速降温至4摄氏度，并保持10分钟)，获得茎环结构前体(如图2(a)所示)。
3.限制性内切酶处理：在步骤2得到的茎环结构溶液中加入2μl20000u/mlbsegi(btsci)内切酶，50℃处理12小时，然后置于80℃处理20分钟使限制性内切酶失活。
4.酶切产物通过8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(nativepage，bio-rad垂直电泳系统，100v电压1小时)验证(结果如图2(b)所示)，结果显示：未经限制性内切酶bsegi处理的茎环结构前体在相对于20bp的marker条带靠后的位置呈单一条带；经过bsegi处理12小时后，产物条带相对于20bp的marker条带略靠前，符合目标产物的预期迁移率。之后利用胶回收试剂盒(takara#9762)进行割胶回收，利用紫外分光光度计进行od260测试定量，于-20℃保存备用。
5.质谱检测酶切法制备的egfp-gdna(5'-pssdna)与未磷酸化修饰的相同序列的dna，验证该方法的磷酸化效率。如图2(c)所示，结果表明bsegi剪切后dna相对于未磷酸化的ssdna增加了一个磷酸基团的质量(po4基质量扣除被取代的oh基质量，分子量约79)；同时，根据质谱的强度分布，无明显的杂峰，说明正确磷酸化的gdna产率接近100％。
结论：通过图2(c)的结果可知，利用本发明描述的酶切法可以获得5'端几乎100％磷酸化修饰的egfp-gdna。
实施例2酶切法制备的gdna引导ngago系统对哺乳动物细胞hek293(美国标准培养物收藏中心atcc)中的质粒剪切
1.将nls-ngago-gk质粒(用于表达ngago内切酶蛋白，addgene购买，编号：78253)200ng、pegfp-c1质粒(作为被靶向切割的目标质粒，表达egfp荧光蛋白，购于鼎国生物，编号：mcv046)40ng与通过实施例一制备的egfp-gdna200ng三者通过阳离子脂质体转染试剂lipofectamine2000(thermo，usa)共转染入hek293细胞。细胞培养于24孔板，培养基为含有10％胎牛血清(购自gibco)的dmem培养基(购自gibco)，实验前每孔铺约1×105个细胞培养过夜。具体转染条件为：用25μlopti-mem培养基(购自gibco)稀释1μllipofectaming2000，混匀后室温放置5分钟；另用25μlopti-mem培养基(购自gibco)稀释三种待转染质粒；将上述两种复合溶液混合均匀，室温孵育5分钟，再将其与950μl无血清的dmem培养基混匀并加入到待转染细胞的培养板中；在37℃、含5％co2的培养箱中继续培养4小时后，更换含有10％胎牛血清(购自gibco)的新鲜dmem培养基(添加100μg/ml氨苄青霉素)继续培养。原理如图3：将实施例1制备的egfp-gdna，nls-ngago-gk质粒、pegfp-c1质粒(作为待剪切的目标，表达发绿色荧光的egfp蛋白)共转染至hek293细胞，egfp-gdna可引导ngago蛋白对pegfp-c1质粒进行靶向剪切，下调egfp在细胞中的表达。用于分析质粒剪切情况的pcr引物在pegfp-c1的位置如图4(a)所示，引物序列如图4(b)所示。
2.设立多个对照组(如图4(c)所示)：对照i仅转染pegfp-c1靶向质粒(空白对照)；对照ii转染nls-ngago-gk表达质粒、pegfp-c1质粒及非靶向gdna(nc-gdna)；对照iii转染pegfp-c1质粒及egfp-gdna(酶切法制备)，但不转染ngago质粒；iv～vi为实验组，同时转染了nls-ngago-gk表达质粒、pegfp-c1靶质粒和egfp-gdna，为了比较不同磷酸化方法获得的gdna，对照iv使用的为引物合成服务商(上海杰李生物技术有限公司)磷酸化修饰的gdna，v组为t4磷酸化酶处理得到的gdna。处理方法为：按照供应商使用说明书，每10μg待磷酸化的单链dna加入t4多聚核苷酸激酶(购于neb)1μl、t4连接酶缓冲液(含有atp)5μl；额外添加atp(25mm)1μl；补充去离子水至终体积50μl。混匀后37℃孵育12小时进行磷酸化反应，然后65℃孵育20分钟灭活，最后用水将dna稀释至100ng/μl。vi组为本发明所描述的酶切法制备的gdna，列表中“+”表示转染，“-”表示未转染。
3.第一次转染12小时后通过lipofectamine2000分别补充转染200ngegfp-gdna。
4.第二次转染36小时后，通过荧光显微镜观察细胞内egfp的表达情况(图4(d))。
5.为了避免因为pegfp-c1转染效率降低导致假阳性的可能，提取各组细胞的基因组dna，并利用egfp-gdna靶向酶切位点两侧的引物对(图4(a)，正向引物1+反向引物)和单侧的引物对(正向引物2+反向引物)对其进行pcr扩增验证。“正向引物2+反向引物”的扩增结果可以体现pegfp-c1的转染效率，而“正向引物1+反向引物”的扩增结果可以体现egfp基因的剪切效率。其中，正向引物1序列为：5'-gccaccatggtgagcaagggcgaggagc-3'(seqidno.3)，正向引物2序列为：5'-cgacttcttcaagtccgcc-3'(seqidno.4)，反向引物序列为：ttatctagatccggtggatccc(seqidno.5)。
结论：从荧光成像(图4(d))来看，本发明描述的酶切法获得的gdna(vi组)有效降低了细胞内的荧光强度。pcr扩增结果(图4(e))也显示，酶切法得到的gdna对egfp质粒进行了有效的切割，导致酶切位点两侧的引物无法获得扩增产物。相比之下，其他方法(iv组，引物合成服务商提供的化学修饰；v组，t4磷酸化酶的磷酸化修饰)获得的gdna没有得到有效的荧光抑制和质粒剪切效果。上述结果说明，通过本发明描述的酶切法制备的5'-pgdna可以高效介导ngago基因编辑系统在哺乳动物细胞内切割egfp质粒，导致egfp基因表达下调。
以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。
<110>中国科学院上海应用物理研究所
<120>一种5'端磷酸化单链dna的制备方法及其应用
<130>p1611448c
<160>5
<170>patentinversion3.5
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<213>人工序列
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