本发明属于分子生物学领域，涉及一种用于torch检测的探针、基因芯片、试剂盒及检测方法。
背景技术：
torch是围产期感染的一组疾病的病原体缩写。andresnahmias等首次用torch来表示4种影响胎儿和新生儿的先天性感染疾病，即弓形虫(toxoplasma，tox)、风疹病毒(rubellavirus，rv)、巨细胞病毒(cytomegalovirus，cmv)和单纯疱疹病毒(herpessimplexvirusi/ii,hsvi/ii)。随着时间的变化，这个缩写也逐渐的扩大。其中的o，代表其他，主要包括梅毒、细小病毒b19、肠道病毒、乙肝和人类免疫缺陷病毒(hiv)等。
torch病原体可以导致多种临床症状，孕妇初次感染，这些病原体可以通过胎盘垂直地传播给婴儿，从而导致习惯性流产、早产、新生儿缺陷或发育异常，其中：弓形虫病原体会造成胎儿畸形、神经系统发育障碍(如脑积水，脑钙化，脉络膜视网膜炎等)，免疫受损者，特别是hiv患者感染弓形虫病毒后；风疹病毒感染可严重损害胎儿，病毒可随血流通过胎盘屏障感染胎儿各个脏器，引起白内障，心脏缺陷、听力障碍、流产或死胎；巨细胞病毒感染引起的症状包括低出生体重、中枢神经系统(cns)损伤、内耳及眼脉络膜感染，虽然约90%的新生儿是无症状的，但其中约13.5%的新生儿会发展为长期神经后遗症，主要是听觉障碍；新生儿感染hsvi/ii后症状分为局部症状、中枢神经系统疾病及传播疾病，局部感染一般仅限于肤，眼睛或口，而中枢神经系统疾病会导致脑炎，传播疾病会导致多器官受损。因此，预防和早期诊断torch感染对孕妇和胎儿都具有积极意义。
目前常用的torch检测方法有酶联免疫法和pcr诊断方法。其中酶联免疫法可用于定量检测，但是需要时间长，而且操作复杂，不是直接对病原体进行检测，并存在一定的窗口期，可能导致假阴性。采用pcr检测脐血或者羊水中cmv,tox,hsvi/ii的dna，可显著提高宫内感染检出率，但是对于四种病原体需要多管体系相对应，且pcr鉴定需要测序和比对，一般要5天左右，存在操作不便、耗时较长、对操作要求高等特点。
基因芯片技术是同时将大量的探针分子固定到固相支持物上,借助核酸分子杂交配对的特性对dna样品的序列信息进行高效的解读和分析。采用基因芯片进行检测，其检测通量大，在一张芯片上可以同时对一种病原物的多个基因进行检测或者一次性完成几种病原体检测，直接针对病原体基因进行，结果更准确，具有检测灵敏度高、特异性好，所需样本量少等优点。
传统的基因芯片技术的检测，是基于荧光标记探针的荧光发光来进行检测的。其信号弱，必须经过激发，才能发光，需要昂贵的激光扫描设备。本发明基因芯片利用化学发光检测杂交信号，在常温下即可完成杂交过程，不需要大型仪器设备，降低了检测的投资成本和应用成本。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种快速检测、特异性好、结果直观准确的torch检测探针、基因芯片、试剂盒及检测方法，提高检测速度，降低检测成本和应用成本，并且提高检测灵敏度，满足现场快速检测的需要。
本发明实现其目的的技术方案如下：
用于torch检测的探针，包括弓形虫tox探针1、2，风疹病毒rv探针1、2，巨细胞病毒cmv探针1、2单纯疱疹病毒i型hsvi探针1、2和单纯疱疹病毒ii型hsvii探针1、2；所述探针序列为：
弓形虫tox探针1、2序列分别为seqidno.1～2；
风疹病毒rv探针1、2序列分别为seqidno.3～4；
巨细胞病毒cmv探针1、2序列分别为seqidno.5～6；
单纯疱疹病毒i型hsvi探针1、2序列分别为seqidno.7～8；
单纯疱疹病毒ii型hsvii探针1、2序列分别为seqidno.9～10。
进一步地，本发明内容还包括一种用于torch检测的基因芯片，包括固体相和前述探针。
进一步地，本发明的内容还包括一种用于torch检测的基因芯片试剂盒，包括前述基因芯片。
进一步地，所述的torch检测检测的基因芯片试剂盒，还包括以下引物对：弓形虫tox靶序列扩增引物对，序列分别为seqidno.11～12；风疹病毒rv靶序列扩增引物对，序列分别为seqidno.13～14；巨细胞病毒cmv靶序列扩增引物对，序列分别为seqidno.15～16；单纯疱疹病毒i型hsvi靶序列扩增引物对，序列分别为seqidno.17～18；单纯疱疹病毒ii型hsvii靶序列扩增引物对，序列分别为seqidno.19～20。
进一步地，所述引物对上游引物5’端含有生物素标记。
进一步地，所述的torch检测试剂盒还包括多重pcr反应体系、阴性对照品、阳性对照品、杂交缓冲液、亲和素（辣根过氧化物酶标记）、清洗液、ecl显色液。
进一步地，所述的阴性对照品为生理盐水，所述阳性对照品为含有包括弓形虫tox靶序列，风疹病毒rv靶序列，巨细胞病毒靶序列，单纯疱疹病毒i型hsvi靶序列和单纯疱疹病毒ii型hsvii靶序列质粒的混合液，所述目的基因序列分别为seqidno.21～25。
进一步地，所述杂交缓冲液为quickreactionbuffer(重庆威斯腾生物有限公司提供)，所述清洗液配方为用800ml蒸馏水溶解8gnacl，0.2gkcl和3gtris-base。用hcl调至ph7.4，用蒸馏水定容到1l。
进一步地，所述亲和素（辣根过氧化物酶标记）使用时需要用杂交缓冲液稀释到合适浓度。
进一步地，所述的torch检测试剂盒进行检测，当检测对象的两个探针显示的检测结果一致时可以判断样品是否感染病原体；当检测对象的两个探针显示的检测结果不一致时，不能判断该待测样品为阳性或阴性，使用该检测试剂盒重新检测或者使用现有其它检测方法进行进一步验证。
本发明的有益效果是：通过特异性引物和探针的选择，利用了多重pcr技术与基因芯片技术相结合的方法，利用化学发光检测基因芯片杂交信号，超越传统的理化检测方法，不需要大型仪器设备，不仅简化检验步骤，缩短检验周期，降低了检测的投资成本和应用成本，并且提高检测灵敏度和特异性，满足医院等的现场检测的需求，具有广阔的临床应用市场潜力。
附图说明
附图1中a为弓形虫tox，巨细胞病毒cmv，单纯疱疹病毒i型hsvi和单纯疱疹病毒ii型多重pcr扩增后的产物凝胶电泳图；b为风疹病毒rvrt-pcr扩增后的产物凝胶电泳图（m：dl500dnamarker；ck-：阴性对照样本扩增结果；ck+：阳性对照样本扩增结果）。
附图2中a为阳性对照样本扩增杂交结果；b为阴性对照样本扩增杂交结果。
具体实施方式：
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
【实施例1】目标片段、引物和探针的设计
通过ncbi数据库查找包括弓形虫tox，风疹病毒rv，巨细胞病毒cmv，单纯疱疹病毒i型和单纯疱疹病毒ii型基因序列，选择保守序列作为靶标（genebankid分别为af179871、m15240、kx544834、mf156584和ky363356），根据引物与探针设计原则，设计各病原体基因的扩增引物与探针，为了使芯片结果用显色液显色后可直接判读，在各病原体靶基因的上下游引物5’端用生物素进行标记，具体序列如下：
弓形虫tox
靶序列扩增引物对，序列分别为：
tox-f：seqidno.11
tox-r：seqidno.12；
风疹病毒rv
靶序列扩增引物对，序列分别为：
rv-f：seqidno.13
rv-r：seqidno.14；
巨细胞病毒cmv
靶序列扩增引物对，序列分别为：
cmv-f：seqidno.15
cmv-r：seqidno.16；
单纯疱疹病毒i型hsvi
靶序列扩增引物对，序列分别为：
hsvi-f：seqidno.17
hsvi-r：seqidno.18；
单纯疱疹病毒ii型hsvii
靶序列扩增引物对，序列分别为：
hsvii-f：seqidno.19
hsvii-r：seqidno.20。
【实施例2】芯片的制备
将氨基修饰的探针及对照物探针，按照表1排列分别将探针点样到nc上，每组设两个平行点样点，紫外交联20min固定探针。
对照物probet探针序列seqidno.26。
表1torch检测芯片矩阵
【实施例3】检测方法
1、基因组提取：使用天根生化科技(北京)有限公司的dna/rna共提取试剂盒，货号dp422。
2、pcr扩增：体系组分见表2、3。
其中tox、cmv、hsvi和hsvii多重pcr扩增体系组成如下表2所示：
表2tox、cmv、hsvi和hsvii多重pcr扩增体系组成
pcr反应程序为：95℃5min；95℃10s、58℃30s、72℃30s、32个循环；72℃10min。
风疹病毒rv为反转录病毒，体系配比如下表3所示：
表3rv扩增体系
pcr反应程序为：45℃10～30min；95℃5min；95℃10s、58℃30s、72℃30s、32个循环；72℃10min。
使用的是生工生物工程(上海)股份有限公司的一步法rt-pcr扩增试剂盒（amv），货号b532441。
3、杂交
材料：阴性对照品为双蒸水；阳性对照品为含有包括弓形虫tox靶序列，风疹病毒rv靶序列，巨细胞病毒靶序列，单纯疱疹病毒i型hsvi靶序列和单纯疱疹病毒ii型靶序列质粒的混合液；杂交缓冲液为quickreactionbuffer(重庆威斯腾生物有限公司提供)，清洗液配方为用800ml蒸馏水溶解8gnacl，0.2gkcl和3gtris-base。用hcl调至ph7.4，用蒸馏水定容到1l，加1ml吐温20；亲和素（辣根过氧化物酶标记）使用时需要用杂交缓冲液稀释到合适浓度；ecl显色液购置于赛默飞世尔科技公司，货号32106；按照实施例2制作基因芯片。
杂交步骤如下：
a.将pcr扩增产物95℃加热3分钟，迅速置于冰上；
b.取10μlpcr产物与2ml杂交缓冲液混合，与芯片一起放入杂交盒中，在常温下，于水平摇床上孵育60min。
c.使用杂交缓冲液清洗2次，每次5min。
d.清洗后，将亲和素（辣根过氧化物酶标记）加入到杂交盒中，孵育10min。
e.用清洗液清洗3次，每次5min
f.在晾干的基因芯片上点样ecl显色液，使用上海天能科技有限公司生产的tanon4600全自动化学发光图像分析系统显色。
本发明通过特异性的引物和探针的选择，利用了多重pcr技术与基因芯片技术相结合的方法，不仅提高了检测的准确度和特异性，并且在常温下即可完成杂交过程，利用化学发光检测基因芯片杂交信号，不需要大型仪器设备，降低了检测的投资成本和应用成本，满足医院等的现场检测的需求。
序列表
<110>重庆高圣生物医药有限责任公司
<120>一种用于torch检测的探针、基因芯片、试剂盒及检测方法
<160>26
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>35
<212>dna
<213>1
<400>1
tcgatagttgaccacgaacgctttaaagaacagga35
<210>2
<211>35
<212>dna
<213>2
<400>2
aacgctttaaagaacaggagaagaagatcgtgaaa35
<210>3
<211>35
<212>dna
<213>3
<400>3
cgtgcaacgtcaccactgaacacccgttctgcaac35
<210>4
<211>35
<212>dna
<213>4
<400>4
ctcgaggtccaggtcccgcccgaccccggggacct35
<210>5
<211>35
<212>dna
<213>5
<400>5
ccacaatcactgaggacagagggatagtcgcgggt35
<210>6
<211>35
<212>dna
<213>6
<400>6
ctgggcaaagaccttcatgcagatctcctcaatgc35
<210>7
<211>35
<212>dna
<213>7
<400>7
gtccggccgcagcccgggaggacgaggagcggcca35
<210>8
<211>35
<212>dna
<213>8
<400>8
agggtccttgaccccacttccgggtttcacgtgaa35
<210>9
<211>35
<212>dna
<213>9
<400>9
agcatcatccaggcccacaacctgtgcttcagtac35
<210>10
<211>35
<212>dna
<213>10
<400>10
gaggccgtcgcgcacctggaggcggaccgggacta35
<210>11
<211>26
<212>dna
<213>11
<400>11
ctttggtgtattcgcagattggtcgc26
<210>12
<211>25
<212>dna
<213>12
<400>12
ctccgcagcgacttctatctctgtg25
<210>13
<211>28
<212>dna
<213>13
<400>13
gggtcaagttccatacagagaccaggac28
<210>14
<211>28
<212>dna
<213>14
<400>14
gggactgctgattgccggtgtaattcat28
<210>15
<211>28
<212>dna
<213>15
<400>15
cctcatcactctgctcactttcttcctg28
<210>16
<211>28
<212>dna
<213>16
<400>16
gctcttagaggagactagtgtgatgctg28
<210>17
<211>25
<212>dna
<213>17
<400>17
agaagggctttattctgccggacac25
<210>18
<211>25
<212>dna
<213>18
<400>18
gtacaggctggcaaagtcgaacacc25
<210>19
<211>26
<212>dna
<213>19
<400>19
gtggtgtttgactttgccagcctgta26
<210>20
<211>25
<212>dna
<213>20
<400>20
gtacgtgggccttcacgaagaacag25
<210>21
<211>420
<212>dna
<213>21
<400>21
gcaaatgaaaaggattcattttcgcagtacaccaggagttggattttgtagagcgtctct60
cttcaagcagcgtattgtcgagtagatcagaaaggaactgcatccgttcatgagtataag120
aaaaaaatgtgggaatgaaagagacgctaatgtgtttgcataggttgcagtcactgacga180
gctcccctctgctggcgaaaagtgaaattcatgagtatctgtgcaactttggtgtattcg240
cagattggtcgcctgcaatcgatagttgaccacgaacgctttaaagaacaggagaagaag300
atcgtgaaagaatacgagaagaggtacacagagatagaagtcgctgcggagacagcgaag360
actgcggatgacttcactcccgtcgcaccagcagcagaggagtgccgggcaagaaaatga420
<210>22
<211>400
<212>dna
<213>22
<400>22
ccagcaccctcacaagaccgtccgggtcaagttccatacagagaccaggaccgtctggca60
actctccgttgccggcgtgtcgtgcaacgtcaccactgaacacccgttctgcaacacgcc120
gcacggacaactcgaggtccaggtcccgcccgaccccggggacctggttgagtacattat180
gaattacaccggcaatcagcagtcccggtggggcctcgggagcccgaattgccacggccc240
cgattgggcctccccggtttgccaacgccattcccctgactgctcgcggcttgtgggggc300
cacgccagagcgcccccggctgcgcctggtcgacgccgacgaccccctgctgcgcactgc360
ccctggacccggcgaggtgtgggtcacgcctgtcataggc400
<210>23
<211>339
<212>dna
<213>23
<400>23
aggacagagggatagtcgcgggtacaggggactctggaggtgacaccagagaatcagagg60
agctggcaccagcggtggccaaagtgtaggctacaatagcctcttcctcatctgactcct120
cggcgatggcccgtaggtcatccacactaggagagcagactctcagaggatcggccccca180
gaatgtactgggcaaagaccttcatgcagatctcctcaatgcggcgcttcattacactga240
taacctcaggcttggttatcagaggccgcttggccagcatcacactagtctcctctaaga300
catagcagcacagcacccgacagaactcacttaagagag339
<210>24
<211>396
<212>dna
<213>24
<400>24
gccgtcgcgcgcttggcgggtattaacatcacccgcaccatctacgacggccagcagatc60
cgcgtctttacgtgcctgctgcgcctggccgaccagaagggctttattctgccggacacc120
caggggcgatttaggggcgccgggggggaggcgcccaagcgtccggccgcagcccgggag180
gacgaggagcggccagaggaggagggggaggacgaggacgaacgcgaggagggcgggggc240
gagcgggagccggagggcgcgcgggagaccgccggccggcacgtggggtaccagggggcc300
agggtccttgaccccacttccgggtttcacgtgaaccccgtggtggtgttcgactttgcc360
agcctgtaccccagcatcatccaggcccacaacctg396
<210>25
<211>417
<212>dna
<213>25
<400>25
caggggcggtttcggagcctcgacaaggaggcggcgcccaagcgcccggccgtgcctcgg60
ggggaaggggagcggccggggggcgggaacggggacgaggatagggacgacgacgaggcc120
gaggacggggccgaggacggggacgagcgcgaggaggtcgcgcgcgagaccgggggccgg180
cacgttgggtaccagggggcccgggtcctcgaccccacctccgggtttcacgtcgacccc240
gtggtggtgtttgactttgccagcctgtaccccagcatcatccaggcccacaacctgtgc300
ttcagtacgctctccctgcggcccgaggccgtcgcgcacctggaggcggaccgggactac360
ctggagatcgaggtggggggccgacggctgttcttcgtgaaggcccacgtacgcgag417
<210>26
<211>28
<212>dna
<213>26
<400>26
tttttttttttttttttttttttttttt28