本发明提供了特异性结合、并能有效中和猪瘟病毒的抗体hk24及其序列，属于生物技术和分子免疫学领域。
技术背景
抗体（antibody，ab）是介导体液免疫的重要效应分子，在病毒感染过程中主要通过与相应抗原特异性结合阻止病原微生物黏附靶细胞受体，对机体起保护作用。抗体的发现不仅在人类疾病诊断、治疗和有害物质的分析检测等领域做出了巨大贡献，而且是生物医药的重要组成部分，继重组蛋白后引领了第二次生物医药产品浪潮。
近年来，smart-seq2技术的出现，实现了单细胞全长cdna的获得，为抗体基因的获取提供了可能。避免了冗杂的杂交瘤细胞筛选过程，且所产生的抗体不再限制于抗鼠的抗体，为研发抗体药物及疾病的免疫治疗提供了基础。
猪瘟（classicalswinefever,csf）是由猪瘟病毒（classicalswinefevervirus,csfv）感染引起猪的一种烈性传染病，具有急性、热性、高度接触性等特点，被世界动物卫生组织（oie）列为a类传染病，严重威胁养猪业发展。csfv是一种含有囊膜的单股正链rna病毒，属于黄病毒科瘟病毒属成员，基因组长约12.3kb，编码4个结构蛋白c（p14）、e0（gp48）、e1（gp33）、e2（gp53）及7个非结构蛋白p7、ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b。其中，糖蛋白e2是最主要的免疫原性蛋白，可诱导机体产生中和性抗体，保护机体免受病毒的攻击。因此本发明利用合成的e2蛋白中保守表位5-tamra-ctavspttlrtevvk与fitc-anti-pigigg同时标记细胞，高效筛选表位特异性抗体分泌细胞，利用smart-seq2技术获得猪瘟病毒特异性抗体基因的序列，成功表达获取了具有中和活性的猪瘟病毒特异性单克隆抗体，为猪瘟病毒血清学的快速诊断，开发猪瘟新型疫苗及猪瘟的防治提供了候选者。
技术实现要素：
本发明公开了一种猪瘟病毒单克隆抗体hk24，该抗体能够结合猪瘟病毒e2蛋白，并且有效中和猪瘟病毒。
本发明所述的一种猪瘟病毒单克隆抗体hk24，包括轻链和重链，其特征在于：
所述单克隆抗体的重链全长氨基酸序列为seqid1，可变区氨基酸序列为序列表中的seqid3；
所述单克隆抗体的轻链全长氨基酸序列为seqid5，可变区氨基酸序列为序列表中的seqid7；
所述的猪瘟病毒单克隆抗体hk24，其特征在于：
能够编码抗体重链全长核酸序列为seqid2；所述抗体的重链可变区包含核苷酸序列为seqid4；
能够编码抗体轻链全长核酸序列为seqid6；所述抗体的轻链可变区包含核苷酸序列为seqid8。
所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自fab、fab’、f(ab’)2、fd、fv、fc、dab、互补决定区片段、单链抗体。
所述的单克隆抗体包括非cdr区，且所述非cdr区来自不是猪类的物种。
所述的猪瘟病毒单克隆抗体hk24在诊断或检测猪瘟病毒试剂中的用途。
所述的猪瘟病毒单克隆抗体hk24在预防治疗猪瘟生物制剂中的用途。
本发明猪瘟病毒单克隆抗体hk24的制备方法，包括以下步骤：在猪21-30日龄和65日龄时分别注射1次猪瘟疫苗（兔化弱毒株，吉林正业生物制品股份有限公司），间隔一周后加强免疫一次，共免疫三次；
用猪瘟病毒抗体检测试剂盒检测免疫后猪血清中抗体含量，选择抗体含量较高的实验猪，前腔静脉采血获得血样，之后使用淋巴细胞分离液对血样进行密度梯度离心，分离出猪淋巴细胞；
所得淋巴细胞使用fitc标记的抗猪igg和5-tamra标记的特异性表位ctavspttlrtevvk同时标记，利用流式细胞术筛选出抗体分泌细胞群，并使用显微操作技术将所得细胞群分离为单个状态，即为单个抗体分泌细胞。
使用smart-seq2技术获得单个抗体分泌细胞cdna，步骤为：将单个细胞放入含有2μl裂解液（1μlrnase抑制剂和19μl0.2%(vol/vol)tritonx-100）1μloligo-dt和1μldntp的0.2-mlpcr管中进行裂解；
利用superscriptii反转录酶获取单个抗体分泌细胞全长cdna，并使用kapahifihotstartreadymix进行预扩增，之后使用特定引物，以预扩增产物为模版进行巢式pcr，扩增得到抗体重链、轻链基因全长序列，通过表达及鉴定获得了一对能够特异性结合并中和猪瘟病毒的单克隆抗体，命名为hk24。
本发明所述的猪瘟病毒单克隆抗体hk24可在体外高量表达，并有潜力运用于猪瘟病毒的检测，预防及紧急治疗。
本发明的积极效果在于：
提供了一种能够特异性结合并中和猪瘟病毒的猪瘟病毒单克隆抗体hk24，可用于制备诊断或检测猪瘟病毒试剂；也可用于制备预防治疗猪瘟生物制剂；对于减少猪瘟病毒给养猪业造成的经济损失具有重要意义。
附图说明
图1：单克隆抗体hk24表达纯化后sds-page检测（从左至右3个泳道样品及上样量依次为：maker，8µl；猪igg，5µl；猪igg，15µl；hk24，20µl）；
图2：单克隆抗体hk24表达纯化后western-blot检测对猪瘟病毒的结合活性（从左至右样品依次为：感染csfv的pk细胞蛋白样品，正常pk细胞蛋白样品）；
图3：单克隆抗体hk24中和活性检测。
具体实施方式
通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
实施例1
单克隆抗体的轻链和重链序列的获得
具体实施过程如发明内容所述，大致流程为：流式分选后的单个细胞中加入tritonx-100和rna酶抑制剂裂解细胞，获取mrna。按照invitrogensuperscriptii反转录酶说明书合成cdna，并进行巢式pcr扩增，。pcr扩增产物进行plb载体连接，具体操作参考plb零背景快速连接试剂盒（vt205）说明书。挑取单克隆菌落测序，并对抗体序列中的可变区进行预测鉴别，结果如下：
抗体重链全长核苷酸序列如seqidno.2所示；重链全长氨基酸序列如seqidno.1所示；
抗体重链可变区核苷酸序列如seqidno.4所示；重链可变区氨基酸序列如seqidno.3所示；
轻链全长核苷酸序列如seqidno.6所示；轻链全长氨基酸序列如seqidno.5所示；
抗体轻链可变区核酸序列如seqidno.8所示；抗体轻链可变区氨基酸序列如seqidno.7所示。
试验例1
hk24抗体的制备和sds-page电泳检测
将hk24的重链全长序列（seqidno：2）和轻链全长序列（seqidno：6）分别克隆到含有启动子ef1α的表达载体中（酶切位点：ndei和xhoi），共转染293ft细胞。细胞培养4天后，将培养液1000rpm/min离心5min收集上清，0.45µm滤膜过滤后利用proteina磁珠纯化获得重组抗体，进行sds-page电泳检测。结果如图1所示，目标蛋白大约在55kd和24kd处与预期相符。
试验例2
western-blot检测hk24抗体与猪瘟病毒结合活性
1、猪瘟病毒感染pk-15细胞72h后收集胞内蛋白，以未感染病毒的pk-15细胞做阴性对照；
2、吸取等量的病毒组及非病毒组蛋白，加入sds-page蛋白上样缓冲液（1×）补齐至相同体积，100℃水浴5-10分钟，充分变性蛋白。依照试剂盒配制12%的sds-page分离胶和5%的浓缩胶。按照一定顺序上样到sds-page胶加样孔中，浓缩胶以90mv,分离胶以120mv恒压电泳约1个小时，待蓝色染料到达胶的底端处附近停止电泳；
3、电泳后按说明书操作将样品转至nc膜，并用5%脱脂奶粉封闭2h；
4、加入hk24抗体（1：100稀释在封闭液中）4℃孵育过夜；
5、次日，用tbst震荡洗涤3次，每次10分钟，随后加入辣根过氧化酶标记兔抗猪igg的二抗（pbst1：2000稀释），室温摇床中放置1小时，再次充分洗涤；
6、显色；
7、结果如图2所示，病毒组检测到目标蛋白大约在55kd，无病毒组未检测到目标蛋白。
试验例3
病毒中和实验检测hk24抗体的中和活性
1、hk24抗体两倍连续稀释在dmem中，与等体积的tcid50/mlcsfv37℃混合，孵育1小时；
2、100ul的抗体-病毒混合物加入到含有pk15细胞的96孔板中，37℃孵育2小时；
弃去培养液，并用pbs清洗三次，加入新鲜含有5%fbs的完全培养基，37℃孵育72小时；
3、弃去培养液，用pbs清洗3次，每次10分钟，逐孔加入100µl预冷的80%丙酮，-20℃固定过夜；
4、吸出个各培养孔中的固定液，各孔加入100µlpbst，放到摇床上，清洗10min，重复2~3次；
5、用抗体稀释液按1:100的比例稀释一抗，加入到各细胞培养孔中，37℃，孵育1~2小时；
6、各孔加入100µlpbst，放到摇床上，清洗10min，重复2~3次；
7、用抗体稀释液按1:100的比例稀释荧光二抗，加入到各细胞培养孔中，37℃孵育30分钟；
8、各孔加入100µlpbst，放到摇床上，清洗10min，重复2~3次；
9、各孔加入100µlpbst，在倒置荧光显微镜显微镜下进行分析；
10、结果如图3所示。
序列表
<110>吉林大学
<120>猪瘟病毒单克隆抗体hk24及医用用途
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