本发明属于生物领域，涉及多糖的制备和应用，具体涉及一种多糖及用作bcat1基因沉默剂治疗肺癌的用途。
背景技术：
细胞的增殖需要获得氨基酸来合成蛋白质或者以此作为氮源合成核苷酸和非必需氨基酸。研究表明非小细胞肺癌相较于正常组织更多依赖于支链氨基酸获得氮源。支链氨基酸转氨酶1(bcat1)是支链氨基酸代谢的启动因素，也是三羧酸循环和氧化磷酸化的重要调节因子，其对于细胞的生长和能量生成至关重要。
研究显示沉默bcat1降低细胞的氧摄入量并影响糖酵解途径，减少细胞能量的产生。越来越多证据表明bcat1对于多种组织来源的肿瘤细胞的生长、迁移及侵袭起着重要作用。在非小细胞肺癌中，bcat1的表达比周围正常组织明显增高且沉默bcat1可明显降低肿瘤形成能力(文献:ovariancancertreatmentbysuicidegenetherapy:beautyofnanotechnologyinmedicine.nanoresearch,2016)。在肺癌中，沉默bcat1可以抑制a549肺癌细胞的迁移和侵袭能力，虽然对其增殖能力没有影响(文献:沉默bcat1对肺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响，现代生物医学进展，2017年17卷34期)。
草果为姜科植物草果amomumtsao-kocrevostetlemaire的干燥成熟果实，秋季果实成熟时采收，除去杂质，晒干或低温干燥(文献:中国药典2015版1部239页)。草果具有燥湿温中、截虐除痰的功效，用于寒湿内阻、痞满呕吐、疟疾寒热、瘟疫发热等证。在民间，草果主要用于疟疾、咽喉感染、腹痛、胃功能失调、消化不良、恶心呕吐和腹泻等。
草果含有较高含量的多糖，但是现有技术没有记载草果多糖在肿瘤治疗方面的应用。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种多糖及用作bcat1基因沉默剂治疗肺癌的用途。
本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的:
一种精制多糖c，通过如下步骤制备而成：
步骤s1，草果粗多糖的提取：将草果粉碎，先用超声提取，再用沸水回流提取，冷却，离心，取上清液浓缩，sevag法脱蛋白，加入无水乙醇，静置过夜，再经离心后取沉淀，用无水乙醇洗涤，冷冻干燥即得草果粗多糖；
步骤s2，氯化钠分级洗脱物的制备：将deae-52纤维素填料装入层析柱平衡，配置草果粗多糖溶液上样；依次采用蒸馏水、0.1、0.3、0.5mol/lnacl溶液进行梯度洗脱，分别洗脱15个柱体积；0.5mol/lnacl溶液收集为一个组分，注入透析袋进行透析，以蒸馏水作为外部渗透液，透析去除氯离子；将0.5mol/lnacl溶液洗脱物浓缩干燥；
步骤s3，精制多糖c的纯化制备：将sephacryls400型凝胶填料纯水浸泡过夜充分溶胀后装柱，配置0.5mol/lnacl溶液洗脱物溶液上样；以0.1mol/l碳酸氢铵溶液为洗脱液，流速为0.3ml/min，每6ml收集一管；以硫酸-苯酚法追踪检测多糖的流出，以管数为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制多糖的出峰图谱，根据图谱合并目标色谱峰对应的流份，浓缩干燥得到精制多糖c。
优选地，步骤s1于4000r/min离心10min。
优选地，步骤s1加入四倍体积无水乙醇。
优选地，步骤s2粗多糖溶液浓度为10mg/ml。
优选地，步骤s2nacl溶液流速为2ml/min。
优选地，步骤s2透析袋为3500da透析袋。
优选地，步骤s2透析48h。
优选地，步骤s3中，0.5mol/lnacl溶液洗脱物溶液的浓度为20mg/ml。
上述精制多糖c用作bcat1蛋白抑制剂的用途。
上述精制多糖c用于抑制肺癌侵袭转移的用途。
有益效果:
本发明提供的精制多糖c可以显著抑制肺癌细胞中bcat1蛋白的表达水平，精制多糖c通过抑制bcat1蛋白表达显著抑制了肺癌细胞的侵袭能。
附图说明
图1为凝胶柱层析法分离纯化0.1mol/lnacl溶液洗脱物制备精制多糖a的出峰图谱；
图2为凝胶柱层析法分离纯化0.3mol/lnacl溶液洗脱物制备精制多糖b的出峰图谱；
图3为凝胶柱层析法分离纯化0.4mol/lnacl溶液洗脱物制备精制多糖c的出峰图谱；
图4为凝胶柱层析法分离纯化0.7mol/lnacl溶液洗脱物制备精制多糖d的出峰图谱；
图5为凝胶柱层析法分离纯化0.9mol/lnacl溶液洗脱物制备精制多糖e的出峰图谱；
图6为精制多糖a～e对bcat1蛋白表达水平的影响。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
实施例1:草果多糖的制备
一、实验材料
草果购于亳州中药材市场，符合《中国药典》2015版要求。
deae-52纤维素购于英国whatman公司；sephacryls400购于美国ge公司。
二、实验方法和结果
1、草果粗多糖的提取
将草果粉碎，取80g加入1l蒸馏水，超声提取30min，然后沸水回流提取3h，冷却，4000r/min离心10min，取上清液浓缩，sevag法脱蛋白，加入四倍体积无水乙醇，静置过夜，再经4000r/min离心10min后取沉淀，用无水乙醇洗涤，冷冻干燥即得草果粗多糖。
2、精制多糖的分离制备
2.1deae-52纤维素柱层析法制备氯化钠分级洗脱物
将deae-52纤维素填料装入层析柱(4.5cm×50cm)平衡6h。配置浓度为10mg/ml的草果粗多糖溶液10ml上样。依次采用蒸馏水、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mol/lnacl溶液进行梯度洗脱，分别洗脱15个柱体积，流速为2ml/min。0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mol/lnacl溶液分别收集为一个组分，每个组分注入3500da透析袋进行透析，以蒸馏水作为外部渗透液，透析48h去除氯离子；分别将0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mol/lnacl溶液洗脱物浓缩干燥。
2.2sephacryls400凝胶柱层析法分离纯化0.1mol/lnacl溶液洗脱物制备精制多糖a
将sephacryls400型凝胶填料纯水浸泡过夜充分溶胀后装柱(3.0cm×70cm)。配置浓度为20mg/ml的0.1mol/lnacl溶液洗脱物溶液5ml上样。以0.1mol/l碳酸氢铵溶液为洗脱液，流速为0.3ml/min，每6ml收集一管。以硫酸-苯酚法追踪检测多糖的流出，以管数为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制多糖的出峰图谱(图1)，合并图谱中吸光值最高的色谱峰对应的流份，浓缩干燥得到精制多糖a。
2.3sephacryls400凝胶柱层析法分离纯化0.3mol/lnacl溶液洗脱物制备精制多糖b
将sephacryls400型凝胶填料纯水浸泡过夜充分溶胀后装柱(3.0cm×70cm)。配置浓度为20mg/ml的0.3mol/lnacl溶液洗脱物溶液5ml上样。以0.1mol/l碳酸氢铵溶液为洗脱液，流速为0.3ml/min，每6ml收集一管。以硫酸-苯酚法追踪检测多糖的流出，以管数为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制多糖的出峰图谱(图2)，合并图谱中吸光值最高的色谱峰对应的流份，浓缩干燥得到精制多糖b。
2.4sephacryls400凝胶柱层析法分离纯化0.5mol/lnacl溶液洗脱物制备精制多糖c
将sephacryls400型凝胶填料纯水浸泡过夜充分溶胀后装柱(3.0cm×70cm)。配置浓度为20mg/ml的0.5mol/lnacl溶液洗脱物溶液5ml上样。以0.1mol/l碳酸氢铵溶液为洗脱液，流速为0.3ml/min，每6ml收集一管。以硫酸-苯酚法追踪检测多糖的流出，以管数为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制多糖的出峰图谱(图3)，合并图谱中吸光值最高的色谱峰对应的流份，浓缩干燥得到精制多糖c。
2.5sephacryls400凝胶柱层析法分离纯化0.7mol/lnacl溶液洗脱物制备精制多糖d
将sephacryls400型凝胶填料纯水浸泡过夜充分溶胀后装柱(3.0cm×70cm)。配置浓度为20mg/ml的0.7mol/lnacl溶液洗脱物溶液5ml上样。以0.1mol/l碳酸氢铵溶液为洗脱液，流速为0.3ml/min，每6ml收集一管。以硫酸-苯酚法追踪检测多糖的流出，以管数为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制多糖的出峰图谱(图4)，合并图谱中吸光值最高的色谱峰对应的流份，浓缩干燥得到精制多糖d。
2.6sephacryls400凝胶柱层析法分离纯化0.9mol/lnacl溶液洗脱物制备精制多糖e
将sephacryls400型凝胶填料纯水浸泡过夜充分溶胀后装柱(3.0cm×70cm)。配置浓度为20mg/ml的0.9mol/lnacl溶液洗脱物溶液5ml上样。以0.1mol/l碳酸氢铵溶液为洗脱液，流速为0.3ml/min，每6ml收集一管。以硫酸-苯酚法追踪检测多糖的流出，以管数为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制多糖的出峰图谱(图5)，合并图谱中吸光值最高的色谱峰对应的流份，浓缩干燥得到精制多糖e。
实施例2:草果多糖的生物活性
一、实验材料
a549细胞系为公司冻存；dmem高糖培养基、fbs购于美国hyclone；bcat1多克隆抗体、β-actin多克隆抗体、bca蛋白定量试剂盒购于美国thermo；辣根过氧化物酶标山羊抗兔二抗购于abcam；ecl发光试剂盒购于美国millipor；transwell小室购于美国corning。
二、实验方法
1、细胞培养
按照每个培养瓶5×105的密度将人肺癌细胞a549接种在25cm2培养瓶中，用含10％胎牛血清的dmem高糖培养基在37℃、5％co2饱和湿度的孵箱中培养，细胞生长融合至85％时传代，取对数生长期的细胞用于后续实验。
2、分组培养
试验组别包括：空白对照组、精制多糖a～e组。
精制多糖a～e组：取对数生长期的a549细胞，调整细胞密度为1×106/ml，接种24孔板中，1.0ml/孔；分别加入精制多糖a、b、c、d、e至终浓度为10μg/ml；
空白对照组：与精制多糖a～e组相比不添加精制多糖a～e。
3、westernblot
收集精制多糖a～e组、空白对照组培养24h的细胞，用ripa裂解液裂解细胞后提取总蛋白，bca法进行蛋白定量。在12％的sds-page凝胶中电泳后通过湿转的方法转移至pvdf膜上，5％脱脂牛奶室温封闭2h后加入bcat1抗体(1:1000)和β-actin抗体(1:1000)，4℃孵育过夜。tbst缓冲液洗膜后用辣根过氧化物酶标记的二抗(1:5000)室温封闭1h。tbst缓冲液洗膜后采用ecl化学发光法进行发光。
4、transwell小室侵袭实验
将transwell小室放入24孔板的孔中，将100μlmatrigel胶与事先预冷的不含血清的dmem高糖培养基以1:8混合后以每个transwell小室600μl的体积从底部一侧缓慢注入，注入时注意不能有气泡，然后放入37℃细胞培养箱中放置1h。将精制多糖a～e组、空白对照组培养24h的细胞调整成密度为2×105/ml的细胞悬液，每个小室注入150μl细胞悬液。小室下层加入600μl含10％胎牛血清的dmem高糖培养基，放入37℃细胞培养箱中培养24h。将小室取出，用棉签轻轻擦去小室底部内面的matrigel胶和细胞。4％多聚甲醛固定15min，0.1％结晶紫中染色30min，pbs漂洗3遍，晾干。在显微镜下观察迁移至小室底部外表面的细胞数目。随机选取5个视野，计算平均数。
5、数据处理
采用spss19.0软件统计分析，数据以均值±偏差表示，组间比较采用单因素方差分析。
三、实验结果
1、精制多糖a～e对bcat1蛋白表达水平的影响
与空白对照组相比，精制多糖a、b、c、e能显著抑制a549肺癌细胞中bcat1蛋白表达水平，差异显著(p＜0.05)；与空白对照组相比，精制多糖d不能明显抑制a549肺癌细胞中bcat1蛋白表达水平，差异无统计学意义(p＞0.05)。结果见表1和图6。
表1精制多糖a～e对bcat1蛋白表达水平的影响
2、精制多糖a～e对a549肺癌细胞侵袭能力的影响
与空白对照组相比，精制多糖a、b、c、e侵袭细胞数显著减少，差异显著(p＜0.05)；与空白对照组相比，精制多糖d不能明显抑制a549肺癌细胞的侵袭，侵袭细胞数差异无统计学意义(p＞0.05)。结果见表2。
表2精制多糖a～e对a549肺癌细胞侵袭能力的影响
结果表明，bcat1表达被抑制的a549肺癌细胞的侵袭能力显著降低。
本发明提供的精制多糖a、b、c、e可以显著抑制肺癌细胞中bcat1蛋白的表达水平，精制多糖a、b、c、e通过抑制bcat1蛋白表达显著抑制了肺癌细胞的侵袭能。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。