本发明属于环境微生物领域，具体涉及一种具有重金属抗性的根际细菌的筛选方法。
背景技术：
采矿和冶炼等工业过程使得重金属浸入到土壤内，引起严重的土壤污染。与有机物污染物不同，重金属不能被微生物降解。目前，修复重金属污染土壤最有效且最环保的途径是通过超富集植物吸附吸收，从而达到降低土壤中重金属含量的目的。苎麻为多年生宿根型植物，具有庞大的根系结构，能形成稳定的根际环境，对重金属镉、砷、铅等重金属污染土壤具有较强的适应性，是一种修复重金属污染土壤的理想作物。
土壤细菌尤其是根际细菌能吸附、转化和转运重金属离子，在植物修复土壤过程中发挥着重要作用。目前，关于从土壤中分离筛选具有重金属抗性细菌的方法主要是通过采用单一的、高浓度的重金属盐培养基进行筛分，从而得到具有重金属抗性的细菌。这种方法筛分得到的细菌菌株功能单一，只对某种特定的重金属有比较好的吸附、转化或者转运作用，但是重金属污染的土壤中往往含有多种重金属，因而这种功能单一的细菌菌株根际功能有限，土壤修复效率不高。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种具有多种重金属抗性的根际细菌的筛选方法，解决单一重金属抗性细菌菌株根际功能有限，土壤修复效率不高的问题。
本发明这种有重金属抗性的根际细菌的筛选方法，包括以下步骤：
1)样品采集：收集苎麻根系表面附着土壤作为分离源；
2)初筛：将步骤1)获得的分离源置于镉抗性液体培养基中进行富集培养，得到富集培养液，取富集培养液涂布于镉抗性固体培养基进行初筛，获得多种初筛根际细菌单菌落；
3)复筛：将步骤2)中获得的多种初筛根际细菌菌落分别置于镉抗性液体培养基进行活化，然后涂布于重金属复合抗性固体培养基中进行复筛，获得复筛根际细菌单菌落；
4)驯化：将步骤3)中获得的复筛根际细菌菌落进行驯化转接，获得具有多种重金属复合抗性的根际细菌。
所述步骤1)中，苎麻为在重金属污染土壤环境中生长2年以上的苎麻。
所述步骤2)中，镉抗性液体培养基为：蔗糖10.0g、硫酸铵1.0g、磷酸氢二钾2.0g、七水硫酸镁0.5g、氯化钠0.1g、酵母粉0.5g、氯化镉0.05g、无菌水1l、ph7.2～7.5；
镉抗性固体培养基：蔗糖10.0g、硫酸铵1.0g、磷酸氢二钾2.0g、七水硫酸镁0.5g、氯化钠0.1g、酵母粉0.5g、氯化镉0.05g、无菌水1l、ph7.2～7.5。
所述步骤2)中，初筛的具体步骤为：将分离源放入装有镉抗性液体培养基的三角瓶中摇床富集培养24～48h，接着吸取培养液转接入装有镉抗性液体培养基的三角瓶中，继续摇床富集培养1～2次，每次24～48h，得到富集培养液；将富集培养液用无菌水进行梯度稀释，然后取不同梯度的富集培养液分别涂布于镉抗性固体培养基平板上，恒温培养24～48h，生长出多种菌落，将菌落纯化后，得到多种初筛根际细菌单菌落。
所述步骤3)中，重金属复合抗性固体培养基的重金属的种类与浓度与分离源中重金属种类与浓度一致。
所述重金属复合抗性固体培养基为：多种重金属盐、蔗糖10.0g、硫酸铵1.0g、磷酸氢二钾0.1g、七水硫酸镁0.25g、氯化钠0.1g、酵母粉0.25g、琼脂粉20g、无菌水1l、ph7.2～7.5。
所述步骤3)中，复筛的具体步骤为：挑取步骤2)中的多种初筛根际细菌单菌落分别接种于镉抗性细菌液体培养基中，30～35℃培养箱中培养8～10h后，取培养液用无菌水进行逐级稀释，取各稀释数量级的培养液分别涂布于重金属复合抗性根际细菌固体培养基上，30～35℃培养箱倒置培养24～48h，生长出的菌落即为复筛根际细菌菌落。
所述步骤4)中，驯化的具体步骤为：取步骤3)中的复筛根际细菌菌落划线接种于重金属复合抗性根际细菌固体培养基上，驯化转接3～5次，生长保持良好的菌落则为具有重金属复合抗性的菌株。
本发明的有益效果：1)本发明利用苎麻对多种重金属的耐受性，挑选其根系土壤为分离源，能够有效的筛选到目的细菌，提高了筛菌的效率。2)本发明利用大多根际细菌对镉金属离子的低耐受性，采用了低浓度的镉抗性培养基进行初筛，既保留土壤分离源中大多数重金属抗性根际细菌的活性，也可有效去除大部分不具备重金属抗性的微生物，提高筛菌的效率，同时也可减少其他重金属盐的使用，节约试剂，降低污染。3)本发明根据土壤分离源的特性，针对性的配置了含有多种重金属的培养基进行复筛，使得获得的菌落具有多种重金属抗性，而且通过进一步的驯化使得菌株功能稳定，变异退化率低，增强根际细菌的定殖能力。4)本发明通过初步分离出镉抗性根际细菌，再通过复合重金属压力培养和驯化培养，筛选出具有重金属复合抗性的根际细菌，采用方法原理简单，目标明确，筛选效率高。
具体实施方式
实施例1
以湖南株洲某化工厂重金属污染土壤复垦试验地种植3年以上的苎麻根系附着土为实例研究对象。土壤分离源中重金属种类有镉、铅、铬、锌和铜，综合污染级别达到中度污染。其中土壤中重金属浓度分别为cd/15.7mg.kg-1、pb/765.1mg.kg-1、cr/81.4mg.kg-1、zn/126.2mg.kg-1和cu/31.3mg.kg-1。
镉抗性液体培养基的配制：称取蔗糖10.0g、硫酸铵1.0g、磷酸氢二钾2.0g、七水硫酸镁0.5g、氯化钠0.1g、酵母粉0.5g和氯化镉0.05g溶解于1l蒸馏水中，调节ph至7.2，并于115℃蒸汽灭菌20min，得到镉抗性液体培养基。
镉抗性固体培养基的配制：称取蔗糖10.0g、硫酸铵1.0g、磷酸氢二钾2.0g、七水硫酸镁0.5g、氯化钠0.1g、酵母粉0.5g、氯化镉0.05g和琼脂20.0g溶解于1l蒸馏水中，调节ph至7.2，并于115℃蒸汽灭菌20min，得到镉抗性固体培养基。
重金属抗性固体培养基的配制：①称取蔗糖20.0g、硫酸铵2.0g、磷酸氢二钾0.2g、七水硫酸镁0.5g、氯化钠0.2g、酵母粉0.5g和琼脂粉40.0g溶解于1l蒸馏水中，调节ph至7.2，并于115℃蒸汽灭菌20min。②称取氯化镉0.05g、硝酸铅2.45g、重铬酸钾0.46g、硫酸锌0.62g和硫酸铜0.16g溶解于1l蒸馏水中，调节ph至7.2，并于115℃蒸汽灭菌20min。③量取等体积溶液①和溶液②，混匀，倒平板得到重金属抗性固体培养基。
取土深15cm处的苎麻宿根，收集根系表面附着土粒3g，放入装有100ml镉抗性液体培养基的三角瓶中，35℃下摇床培养48h(摇床转速为150r/min)；接着吸取1ml培养液转接入100ml镉抗性液体培养基的三角瓶中，继续在35℃下摇床培养24h(摇床转速为150r/min)，再接着吸取1ml培养液转接入100ml镉抗性液体培养基的三角瓶中，继续在35℃下摇床培养24h(摇床转速为150r/min)，得到富集培养液。
吸取1ml富集培养液用无菌水逐级稀释至10-3、10-4和10-5倍，然后分别取稀释后的富集培养液0.1ml涂布于镉抗性细菌固体培养基平板，生长出5种菌落，将菌落纯化后，得到5种镉抗性单菌落。
分别取每种镉抗性单菌落1环接种于5ml镉抗性细菌液体培养基中，35℃下，培养箱中培养10h，接着取1ml培养液用无菌水逐级稀释至10-3、10-4和10-5倍，然后分别取0.1ml涂布于重金属复合抗性根际细菌固体培养基上，35℃下，培养箱倒置培养48h，得到5种复筛菌株。
将得到的复筛菌株接种于重金属复合抗性固体培养基上，驯化转接3次，共有4株生长保持良好的菌落，即为重金属复合抗性的菌株，通过鉴定，上述4种菌株分别为：芽孢杆菌bacillussp.(1株)；鞘氨醇杆菌sphingobacteriumsp.(1株)；金黄杆菌属chryseobacteriumsp.(1株)；伯克霍尔德氏菌属burkholderiasp.(1株)。
实施例2
湘潭锰矿某分矿开采区附近野生苎麻根系表面附着土壤为实例研究对象，土壤分离源中重金属种类为镉、锰、铅和锌，综合污染程度为重度污染，其中土壤中重金属浓度分别为：cd/56.7mg.kg-1、mn/2033.5mg.kg-1、pb/1013.4mg.kg-1和zn/353.5mg.kg-1。
镉抗性液体培养基的配制：称取蔗糖10.0g、硫酸铵1.0g、磷酸氢二钾2.0g、七水硫酸镁0.5g、氯化钠0.1g、酵母粉0.5g和氯化镉0.05g溶解于1l蒸馏水中，调节ph至7.2，并于115℃蒸汽灭菌20min，得到镉抗性液体培养基。
镉抗性固体培养基的配制：称取蔗糖10.0g、硫酸铵1.0g、磷酸氢二钾2.0g、七水硫酸镁0.5g、氯化钠0.1g、酵母粉0.5g、氯化镉0.05g和琼脂20.0g溶解于1l蒸馏水中，调节ph至7.2，并于115℃蒸汽灭菌20min，得到镉抗性固体培养基。
重金属抗性固体培养基：①称取蔗糖20.0g、硫酸铵2.0g、磷酸氢二钾0.2g、七水硫酸镁0.5g、氯化钠0.2g、酵母粉0.5g和琼脂粉40.0g溶解于1l蒸馏水中，调节ph至7.2，并于115℃蒸汽灭菌20min。②称取氯化镉(cdcl2)0.19g、氯化锰(mncl2)9.32g、硝酸铅(pb(no3)2)3.24g和硫酸锌(znso4)1.75g溶解于1l蒸馏水中，调节ph至7.2，并于115℃蒸汽灭菌20min。③量取等体积溶液①和溶液②，混匀，倒平板得到重金属抗性固体培养基。
取土深15cm处的苎麻宿根，收集根系表面附着土粒3g，放入装有100ml镉抗性液体培养基的三角瓶中，35℃下摇床培养48h(摇床转速为150r/min)，接着吸取1ml培养液转接入100ml镉抗性液体培养基的三角瓶中，继续在35℃下摇床培养24h(摇床转速为150r/min)，再接着吸取1ml培养液转接入100ml镉抗性液体培养基的三角瓶中，继续在35℃下摇床培养24h(摇床转速为150r/min)，得到富集培养液。
吸取1ml富集培养液用无菌水逐级稀释至10-3、10-4和10-5倍，然后分别取稀释后的富集培养液0.1ml涂布于镉抗性细菌固体培养基平板，生长出4种菌落，将菌落纯化后，得到4种镉抗性单菌落。
分别取每种镉抗性单菌落1环接种于5ml镉抗性细菌液体培养基中，35℃下，培养箱中倒置培养10h，接着取1ml培养液用无菌水逐级稀释至10-3、10-4和10-5倍，然后分别取0.1ml涂布于重金属复合抗性根际细菌固体培养基上，35℃下，培养箱倒置培养48h，得到3种复筛菌株。
将得到的复筛菌株接种于重金属复合抗性固体培养基上，驯化转接4次，共有3株生长保持良好的菌落，即为重金属复合抗性的菌株，通过鉴定，上述3种菌株分别为：副球菌属paracoccussp.(1株)；假单胞菌属pseudomonassp.(1株)；分支杆菌mycobacteriumsp.(1株)。
实施例3
以湖南株洲某矿冶厂附近重金属污染土壤3年以上野生苎麻根系附着土壤为实例研究对象，土壤分离源中重金属种类主要为镉、铅、锌和铜，综合污染级别为重度污染。其中土壤中重金属浓度分别为：cd/87.9mg.kg-1、pb/1243mg.kg-1、zn/719mg.kg-1和cu/57.4mg.kg-1。
镉抗性液体培养基的配制：称取蔗糖10.0g、硫酸铵1.0g、磷酸氢二钾2.0g、七水硫酸镁0.5g、氯化钠0.1g、酵母粉0.5g和氯化镉0.05g溶解于1l蒸馏水中，调节ph至7.2，并于115℃蒸汽灭菌20min，得到镉抗性液体培养基。
镉抗性固体培养基的配制：称取蔗糖10.0g、硫酸铵1.0g、磷酸氢二钾2.0g、七水硫酸镁0.5g、氯化钠0.1g、酵母粉0.5g、氯化镉0.05g和琼脂20.0g溶解于1l蒸馏水中，调节ph至7.2，并于115℃蒸汽灭菌20min，得到镉抗性固体培养基。
重金属抗性固体培养基的配制：①称取蔗糖20.0g，硫酸铵2.0g，磷酸氢二钾0.2g，七水硫酸镁0.5g，氯化钠0.2g，酵母粉0.5g、琼脂粉40.0g溶解于1l蒸馏水中，调节ph至7.2，并于115℃蒸汽灭菌20min。②称取氯化镉0.29g，硝酸铅3.97g和硫酸锌3.54g和硫酸铜0.29g溶解于1l蒸馏水中，调节ph至7.2，并于115℃蒸汽灭菌20min。③量取等体积溶液①和溶液②，混匀，倒平板得到重金属抗性固体培养基。
取土深15cm处的苎麻宿根，收集根系表面附着土粒3g，放入装有100ml镉抗性液体培养基的三角瓶中，35℃下摇床培养48h(摇床转速为150r/min)，接着吸取1ml培养液转接入100ml镉抗性液体培养基的三角瓶中，继续在35℃下摇床培养24h(摇床转速为150r/min)，再接着吸取1ml培养液转接入100ml镉抗性液体培养基的三角瓶中，继续在35℃下摇床培养24h(摇床转速为150r/min)，得到富集培养液。
吸取1ml富集培养液用无菌水逐级稀释至10-3、10-4和10-5倍，然后分别取稀释后的富集培养液0.1ml涂布于镉抗性细菌固体培养基平板，生长出4种菌落，将菌落纯化后，得到4种镉抗性单菌落。
分别取每种镉抗性单菌落1环接种于5ml镉抗性细菌液体培养基中，35℃下，培养箱中倒置培养10h，接着取1ml培养液用无菌水逐级稀释至10-3、10-4和10-5倍，然后分别取0.1ml涂布于重金属复合抗性根际细菌固体培养基上，35℃下，培养箱倒置培养48h，得到3种复筛菌株。
将得到的复筛菌株接种于重金属复合抗性固体培养基上，驯化转接5次，共有2株生长保持良好的菌落，即为重金属复合抗性的菌株，通过鉴定，上述2种菌株分别为：金黄杆菌属chryseobacteriumsp.(1株)；假单胞菌属pseudomonassp.(1株)。