本发明涉及微生物发酵及植物提取物技术领域，尤其涉及一种从油茶籽中制备黄酮苷的方法。
背景技术：
油茶树是我国特有的木本油料树种，属山茶科山茶属，从南宋年间开始种植至今已有2300多年的历史，并且分布广、产量大，药用收载部位多。素有“东方橄榄油”、“油中珍品”、“绿色油库”、“绿色金库”之美誉，与油橄榄、油棕、椰子并称“世界四大木本油料树种”。
油茶籽主要用于生产茶油和茶皂素，并有大量研究表明其具有一定的生物活性和药理作用。近年来，国内外对油茶籽进行了一系列的研究，发现其中还含有黄酮类成分，主要是由山萘酚、黄烷酮及其糖苷组成，含量一般为0.1％～0.2％。黄酮苷是油茶籽中重要的活性成分，具有良好的清除自由基的作用，可以通过抑制一些细胞中的促炎因子如inos和cox-2的表达而起到优良的抗炎效果，有潜力开发为治疗炎症的临床药品，作为天然植物源药品，可以避免甾族和非甾族抗炎药的副作用。
申请号为cn201510345178.4的专利文献公开了“高速逆流色谱制备油茶籽壳中黄酮类化合物的方法”，该方法以油茶籽壳为原料制得2个黄酮类化合物，该专利中使用多种有机溶剂。申请号为cn201310297274.7的专利文献公开了“一种降血糖油茶黄酮的制备方法及其应用”，利用油茶籽榨油后的饼粕，进行降血糖活性成分的制备分离，不足之处在于该方法利用传统树脂进行分离纯化，耗时长。申请号为cn201010229218.6的专利文献公开了“一种中压柱快速分离油茶饼粕中黄酮苷的制备方法”，得到95％以上的黄酮苷单体，但该工艺步骤繁琐，操作不简便。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种从油茶籽中制备黄酮苷的方法，利用微生物发酵法和有机溶剂萃取技术，使油茶籽中的活性成分黄酮苷被充分提取出来。
为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种从油茶籽中制备黄酮苷的方法，包括：
(1)将油茶籽脱脂后制成液体培养基，然后接入黑曲霉菌进行发酵；
(2)发酵结束，将发酵料灭菌过滤，滤渣干燥粉碎后用醇-水溶液进行提取；
(3)提取完成后过滤，滤液浓缩至无醇再加入极性溶剂萃取，收集水液层；
(4)水液层用乙酸乙酯进行萃取，收集乙酸乙酯层，浓缩，干燥，得到黄酮苷提取物。
步骤(1)中，油茶籽可采用石油醚于30～80℃进一步为40～80℃回流进行脱脂。所述石油醚与油茶籽的体积比为(2～3):1。
所述液态培养基由血粉、磷酸氢二钾、硫酸镁和水组成。以重量份计，组成为：油茶籽粕9～11份，血粉1～3份，磷酸氢二钾0.01～0.03份，硫酸镁0.008～0.009份，水15～18份；进一步组成为：油茶籽粕10份，血粉2份，磷酸氢二钾0.016份，硫酸镁0.008份，水16份。
所述发酵包括：将黑曲霉菌活化后制成种子液，然后接入液态培养基中进行发酵。
所述发酵时的接种量为5-8％。
发酵的温度、转速、时间会影响产物的产率和纯度，所述发酵的温度为20～40℃，摇床转速为100～250rpm，发酵时间为3～8d；进一步优选的，所述发酵的温度为30～35℃，摇床转速为150～200rpm，发酵时间为4～6d；更优选的，所述发酵的温度为30℃，摇床转速为180rpm，发酵时间为4d。
步骤(2)中，醇-水溶液为质量分数为50％～70％乙醇水溶液，醇-水溶液与滤渣的体积比为(8～12):1；所述提取的温度为60～80℃，提取的次数为1～4次，每次提取的时间为1～3h；优选的，醇-水溶液为质量分数为50％～60％乙醇水溶液，醇-水溶液与滤渣的体积比为(8～10):1；所述提取的温度为70～75℃，提取的次数为3～4次。
步骤(3)中，所述极性溶剂为正丁醇、正己烷、石油醚中的任意一种；所述极性溶剂与滤液的体积比为(0.5～1):1；萃取次数为1～3次；优选的，所述极性溶剂与滤液的体积比为0.5:1；萃取次数为2次。
步骤(4)中，乙酸乙酯与水液层的体积比为(1～2):1；萃取次数为2～4次，进一步为3次。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本工艺利用微生物发酵，充分提高油茶籽中黄酮苷的提取率，后期先使用低极性溶剂萃取，再用乙酸乙酯萃取，使得得到的黄酮苷中杂质更少，纯度更高，使其利用价值充分提高，条件易于控制，生产成本低，所得黄酮苷含量在最高可高达95％以上。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
本发明中，血粉为猪血血粉，购买自安丘市万维饲料添加剂有限公司；
黑曲霉：采用工业发酵常用的黑曲霉菌株，可购自北纳生物，编号bncc336168。
液体培养基：油茶籽粕(脱脂后的油茶籽)10g，血粉2g；磷酸氢二钾0.016g；硫酸镁0.008g混匀置于50ml锥形瓶中，加水16ml，搅拌均匀，制成液体培养基。
实施例1：
(1)取10g油茶籽，粉碎，用2倍体积石油醚于40℃加热回流脱脂；
(2)将步骤(1)处理好的油茶籽干燥，粉碎，加入10倍体积60％乙醇(质量分数)，于70℃提取3次，每次1h，过滤，滤液合并浓缩至无醇；
(3)将步骤(2)得到的滤液用0.5倍体积石油醚萃取1次，收集水液层；
(4)将步骤(3)中得到的水液层用等体积量乙酸乙酯萃取2次，收集乙酸乙酯层，浓缩，烘干，得到黄酮苷0.021g，得率为0.21％。
经高效液相检测，样品中黄酮苷的含量为85％。
实施例2：
(1)取10g油茶籽，粉碎，用2倍体积石油醚于80℃加热回流脱脂；
(2)向步骤(1)处理好的油茶籽中加入血粉、磷酸氢二钾、硫酸镁、蒸馏水，制成液体培养基，于121℃灭菌20min；
(3)制备活化培养基(pda培养基)和种子培养基(液态pda培养基)，对黑曲霉菌进行活化和扩增(扩增条件：30℃150rpm振荡72h)，制备种子菌种液；
(4)利用种子菌种液和步骤(2)制成的液体培养基，进行接种和发酵，接种量为5％-8％(质量分数)，温度为20℃，摇床转速为100rpm，发酵时间为3d；
(5)将步骤(4)接种发酵好的发酵产物于121℃30min灭活，高速离心，取固体部分干燥，粉碎，加入8倍体积50％乙醇(质量分数)，于60℃提取2次，每次1h，过滤，滤液合并浓缩至无醇；
(6)将步骤(5)得到的滤液用0.5倍体积石油醚萃取2次，收集水液层；
(7)将步骤(6)得到的水液层用等体积量乙酸乙酯萃取2次，收集乙酸乙酯层，浓缩，烘干，得到黄酮苷0.027g，得率为0.27％。
黄酮苷含量测定方法同实施例1，样品中黄酮苷的含量为87％。
实施例3：
(1)取10g油茶籽，粉碎，用2倍体积石油醚于60℃加热回流脱脂；
(2)向步骤(1)处理好的油茶籽中加入血粉、磷酸氢二钾、硫酸镁、蒸馏水，制成液体培养基，于121℃灭菌20min；
(3)制备活化培养基(pda培养基)和种子培养基(液态pda培养基)，对黑曲霉菌进行活化和扩增，制备种子菌种液；
(4)利用种子菌种液和步骤(2)制成的液体培养基，进行接种和发酵，接种量为5％-8％，温度为30℃，摇床转速为150rpm，发酵时间为3d；
(5)将步骤(4)接种发酵好的发酵产物于121℃30min灭活，高速离心，取固体部分干燥，粉碎，加入10倍体积50％乙醇，于70℃提取3次，每次1h，过滤，滤液合并浓缩至无醇；
(6)将步骤(5)得到的滤液用0.5倍体积石油醚萃取2次，收集水液层；
(7)将步骤(6)得到的水液层用等体积量乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯层，浓缩，烘干，得到黄酮苷0.029g，得率为0.29％。
黄酮苷含量测定方法同实施例1，样品中黄酮苷的含量为90.31％。
实施例4：
(1)取10g油茶籽，粉碎，用2倍体积石油醚于40℃加热回流脱脂；
(2)向步骤(1)处理好的油茶籽中加入血粉、磷酸氢二钾、硫酸镁、蒸馏水，制成液体培养基，于121℃灭菌20min；
(3)制备活化培养基(pda培养基)和种子培养基(液态pda培养基)，对黑曲霉菌进行活化和扩增，制备种子菌种液；
(4)利用种子菌种液和步骤(2)制成的液体培养基，进行接种和发酵，接种量为5％-8％，温度为30℃，摇床转速为180rpm，发酵时间为4d；
(5)将步骤(4)接种发酵好的发酵产物于121℃30min灭活，高速离心，取固体部分干燥，粉碎，加入8倍体积60％乙醇，于70℃提取3次，每次1h，过滤，滤液合并浓缩至无醇；
(6)将步骤(5)得到的滤液用0.5倍体积石油醚萃取2次，收集水液层；
(7)将步骤(6)得到的水液层用等体积量乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯层，浓缩，烘干，得到黄酮苷0.0378g，得率为0.378％。
黄酮苷含量测定方法同实施例1，样品中黄酮苷的含量为95.5％。
实施例5：
(1)取10g油茶籽，粉碎，用2倍体积石油醚于40℃加热回流脱脂；
(2)向步骤(1)处理好的油茶籽中加入血粉、磷酸氢二钾、硫酸镁、蒸馏水，制成液体培养基，于121℃灭菌20min；
(3)制备活化培养基(pda培养基)和种子培养基(液态pda培养基)，对黑曲霉菌进行活化和扩增，制备种子菌种液；
(4)利用种子菌种液和步骤(2)制成的液体培养基，进行接种和发酵，接种量为5％-8％，温度为30℃，摇床转速为180rpm，发酵时间为3d；
(5)将步骤(4)接种发酵好的发酵产物于121℃30min灭活，高速离心，取固体部分干燥，粉碎，加入10倍体积60％乙醇，于70℃提取3次，每次1h，过滤，滤液合并浓缩至无醇；
(6)将步骤(5)得到的滤液用0.5倍体积石油醚萃取1次，收集水液层；
(7)将步骤(6)得到的水液层用等量乙酸乙酯萃取2次，收集乙酸乙酯层，浓缩，烘干，得到黄酮苷0.0335g，得率为0.335％。
黄酮苷含量测定方法同实施例1，样品中黄酮苷的含量为91.3％。
实施例6：
(1)取10g油茶籽，粉碎，用2倍体积石油醚于50℃加热回流脱脂；
(2)向步骤(1)处理好的油茶籽中加入血粉、磷酸氢二钾、硫酸镁、蒸馏水，制成液体培养基，于121℃灭菌20min；
(3)制备活化培养基(pda培养基)和种子培养基(液态pda培养基)，对黑曲霉菌进行活化和扩增，制备种子菌种液；
(4)利用种子菌种液和步骤(2)制成的液体培养基，进行接种和发酵，接种量为5％-8％，温度为30℃，摇床转速为180rpm，发酵时间为3d；
(5)将步骤(4)接种发酵好的发酵产物于121℃30min灭活，高速离心，取固体部分干燥，粉碎，加入10倍体积60％乙醇，于60℃提取3次，每次1h，过滤，滤液合并浓缩至无醇；
(6)将步骤(5)得到的滤液用0.5倍体积石油醚萃取2次，收集水液层；
(7)将步骤(6)得到的水液层用等量乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯层，浓缩，烘干，得到黄酮苷0.0309g，得率为0.309％。
黄酮苷含量测定方法同实施例1，样品中黄酮苷的含量为93.7％。