本发明属于植物病毒检测技术领域，具体涉及一种用于检测大麦黄花叶病毒的lamp引物组及检测方法。
背景技术：
大麦黄花叶病主要是由大麦黄花叶病毒引起，借助于土壤中的禾谷多黏菌进行传播。上个世纪40年代日本首次对该病毒报道以来，已经在欧亚多个国家发现了该病毒的广泛分布。我国于上世纪50年代首次在浙江珠海农场发现大麦黄花叶病，因未重视，于上世纪70年代在我国长江流域大麦产区大规模爆发，造成了严重的危害。
目前，黄花叶病毒的检测方法有很多，包括电镜法、酶联免疫法(elisa)、rt-pcr法、定量pcr和taqman探针法，等等。这些方法要么需要昂贵的仪器设备和复杂的操作方法，要么存在抗体制备难和假阳性的问题。
大麦黄花叶病毒是一种rna病毒，属于马铃薯y病毒科大麦黄花叶病毒属，其基因组由两个rna分子rna1和rna2组成，分别约为7.6kb和3.5kb，这两个rna分子被包被在一个丝状衣壳蛋白中形成大麦黄花叶病毒粒子(chenetal.,1999)。rna1编码8个蛋白，包括rna依赖的rna聚合酶，基因组连接蛋白，衣壳蛋白，丝氨酸蛋白酶等；rna2编码两个蛋白，分别为半胱氨酸蛋白酶和假定的载体感染因子(youandshirako,2013)。
环介导到等温扩增法(lamp)具备特异性强、操作简单、时间短、观察方便等优点，在病毒检测中发挥着重要的作用，目前，lamp技术在我国还未被应用于大麦黄花叶病毒的检测。利用lamp技术检测大麦黄花叶病毒的难点在于保守序列的选择和引物的设计，方法灵敏度较高时，还需要严格的防污染措施来避免假阳性结果。
技术实现要素：
本发明提供一种用于检测大麦黄花叶病毒的lamp引物组及检测方法，引物组由内外两对引物组成，具有高度的特异性，灵敏度高，可清晰检测植物rna稀释浓度为0.001ng/μl中的病毒，具有高度的选择性，检测方法具有反应条件简单、操作简便快速、结果判定方便、准确等优点。
为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种用于检测大麦黄花叶病毒的lamp引物组，其包括外引物f3和b3，内引物fip和bip，从5’端到3’端，具体序列如下：
f3:5’-cgcaactacagtgatgaaac-3’；
b3:5’-tcggaagttaacatggtgtt-3’；
fip:5’-gaagcgccatgcttcattgattttcgtcttactcatcacaaacaac-3’；
bip:5’-cgatttcttcgtcccacgatcatttttcagttccaagtgctgcta-3’。
本发明提供一种包含所述lamp引物组的大麦黄花叶病毒的lamp检测试剂盒。
进一步，所述lamp检测试剂盒包含lamp反应体系，该lamp反应体系包括：内引物fip、内引物bip、外引物f3、外引物b3、buffer、dntp、甜菜碱和bstdna聚合酶。
进一步，所述的lamp反应体系中，各成分的终浓度为：内引物fip为0.2-1.6μm，内引物bip为0.2-1.6μm，外引物f3为0.1-1.6μm，外引物b3为0.1-1.6μm，dntps为0.2-0.4mm、甜菜碱为0.4-0.8m，dna聚合酶bst为0.16-1u/μl。
优选地，所述lamp反应体系中，各成分的终浓度为：内引物fip为0.8μm，内引物bip为0.8μm，外引物f3为0.8μm，外引物b3为0.8μm，dntps为0.3mm、甜菜碱为0.6m，dna聚合酶bst为0.32u/μl。
进一步，所述lamp反应体系中，还含有大麦黄花叶病毒目标片段质粒的阳性模板。
一种大麦黄花叶病毒的lamp检测方法，包括以下步骤：
1)提取待测样品rna，进行反转录，获得cdna；
2)配制lamp反应体系；
所述lamp反应体系中，各成分的终浓度为：内引物fip为0.2-1.6μm，内引物bip为0.2-1.6μm，外引物f3为0.1-1.6μm，外引物b3为0.1-1.6μm，dntps为0.2-0.4mm、甜菜碱为0.4-0.8m，dna聚合酶bst为0.16-1u/μl；
3)进行lamp扩增反应
利用步骤2)的lamp反应体系，对步骤1)获得的cdna进行lamp扩增，以ddh2o为阴性对照，以包含大麦黄花叶病毒目标序列的质粒为阳性对照，获得对应的扩增产物；
lamp扩增反应的程序为：55-65℃，30-60min，80-85℃3-5min；
4)鉴定扩增结果
步骤3)lamp扩增反应结束后，向各扩增产物中加入sybrgreeni染料，观察颜色变化：阳性对照显色为绿色，阴性对照显色为橘色；待测样品显色为绿色的样品为阳性，含有大麦黄花叶病毒，显色为橘色的样品为阴性，不含大麦黄花叶病毒。
进一步，在所述的lamp反应体系中，各成分的终浓度为：内引物fip为0.8μm，内引物bip为0.8μm，外引物f3为0.8μm，外引物b3为0.8μm，dntps为0.3mm，甜菜碱为0.6m，dna聚合酶bst为0.32u/μl。
将本发明所述的lamp引物用于大麦黄花叶病毒的rt-lamp检测方法中。
进一步，所述rt-lamp检测方法中，以大麦黄花叶病毒rna为模板，反应体系中各成分的终浓度为：内引物fip为0.2-1.6μm，内引物bip为0.2-1.6μm，外引物f3为0.1-1.6μm，外引物b3为0.1-1.6μm，dntps为0.2-0.4mm、甜菜碱为0.4-0.8m，dtt为0.1-10mm，逆转录酶revertraace为1-5u/μl，dna聚合酶bst为0.16-1u/μl，待测样品rna0.001ng/μl-100ng/μl，反应程序为：60-65℃30-60min，80-85℃3-5min。
本发明的lamp或rt-lamp反应体系中，buffer中含镁离子，10×buffer的添加遵循本领域中的常规添加原则，通常为反应总体积的十分之一。
本发明对大麦黄花叶病毒(baymv)的衣壳蛋白基因(coatproteingene，cp)序列(genbank登录号为kc999959.1)进行查找，共计获得12条相关序列，通过比对，选择长度为211bp的共同保守区段为目标序列，在序列完全一致的区域，设计2对引物，分别为：外引物对f3和b3，内引物对fip和bip，内引物长度分别为46bp和45bp，具有长片段引物的特点，两对引物组成的扩增反应体系，使扩增高度特异性。
本发明对lamp反应温度和体系进行了详尽、可靠的研究。本发明对大麦黄花叶病毒的lamp反应温度设在55℃-65℃之间，在该温度范围内，lamp反应效率和产物产量较高，该温度的设定还考虑了反转录所需的温度因素，因此，该温度条件还适于进行rt-lamp反应；本发明对内引物及外引物的用量进行了摸索，最终确定内引物与外引物的使用浓度，内引物fip为0.2-1.6μm，内引物bip为0.2-1.6μm，外引物f3为0.1-1.6μm，外引物b3为0.1-1.6μm；对模板、dntp、betaine、bstdnapolymerase采用四种因素三水平的正交实验设计进行反应条件的优化，确定了各物质合适的用量。
利用本发明的lamp引物组，可以直接采用样品中提取的总rna进行环介导逆转录等温实验rt-lamp，利用revertraace逆转录酶(toyobo)和bstdna聚合酶，将逆转录和lamp实验相结合，极大地缩短了反应时间，以rna作为模板，通过一步法完成了反转录和lamp反应，方便，省时省力。
与现有技术对比，本发明具有如下有益效果：
本发明的lamp引物组，由两对引物组成，使扩增具有高度特异性，可以直接采用样品中提取的总rna进行rt-lamp进行大麦黄花叶病毒的检测，检测时，可无需电泳，通过添加显色剂，用肉眼来直接观察检测结果，操作简单，结果判定方便、准确。
附图说明
图1为本发明实施例1中baymv目标片段的pcr扩增产物。
图2为本发明实施例1中baymv目标片段单克隆的pcr扩增结果。
图3为本发明实施例4中rt-lamp灵敏度电泳结果示意图。
图4为本发明实施例4中rt-pcr灵敏度电泳结果示意图。
图5为本发明实施例4中rt-lamp灵敏度可视化结果示意图。
图6为本发明实施例5中rt-lamp可视化检测大麦样品结果示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
大麦黄花叶病毒(baymv)样品取自于盐城大麦黄花叶病病毒圃，大麦叶片用液氮冷冻后存储在液氮罐中带到上海市农科院，大麦无病毒感染样品取自于上海市农科院实验室人工气候室中水培的大麦幼苗，液氮冷冻后，一并储存于-80℃的超低温冰箱，以备后面rna提取。
使用transzoluprna抽提试剂盒，根据说明书进行rna提取，使用transscriptone-stepgdnaremovalandcdnasynthesissupermix试剂盒(购自北京全式金生物技术有限公司)进行dna去除和cdna反转录。
实施例1一种用于检测大麦黄花叶病毒的lamp引物组的获得
对大麦黄花叶病毒(baymv)的衣壳蛋白基因(coatproteingene，cp)序列(genbank登录号为kc999959.1)进行查找，共计获得12条相关序列，通过比对获得共同保守区段序列，设计2对引物，分别为：外引物f3和b3，内引物fip和bip，设计原则或选择保守区段时，引物结合序列完全一致。
设计的引物序列如下：
f3:5’-cgcaactacagtgatgaaac-3’；
b3:5’-tcggaagttaacatggtgtt-3’；
fip:5’-gaagcgccatgcttcattgattttcgtcttactcatcacaaacaac-3’；
bip:5’-cgatttcttcgtcccacgatcatttttcagttccaagtgctgcta-3’。
实施例2大麦黄花叶病毒的lamp检测方法
1)提取待测样品rna，将总rna用全式金逆转录试剂盒进行逆转录，获得cdna；
2)配制lamp反应体系；
所述lamp反应体系中，各成分的终浓度为：内引物fip为0.8μm，内引物bip为0.8μm，外引物f3为0.8μm，外引物b3为0.8μm，10×buffer，dntps为0.3mm、甜菜碱为0.6m，dna聚合酶bst为0.32u/μl；
3)进行lamp扩增反应
利用步骤2)获得的lamp反应体系，与步骤1)获得的cdna进行lamp扩增；
以ddh2o为阴性对照，以包含大麦黄花叶病毒目的序列的质粒为阳性对照，获得对应的扩增产物；设置阴性对照以证明反应体系未被大麦黄花叶病毒目的序列污染，设置阳性对照以对比测定结果的正确性；
lamp扩增反应的程序为：62℃30-60min，80-85℃3-5min；
4)扩增结果
步骤3)lamp扩增反应结束后，向扩增产物中加入sybrgreeni染料，观察颜色变化：显色为绿色的样品为阳性，含有大麦黄花叶病毒；显色为橘色的样品为阴性，不含大麦黄花叶病毒。
其中，所述的包含大麦黄花叶病毒目的序列的阳性对照质粒，其构建过程如下：
提取大麦黄花叶病毒(baymv)样品rna，进行反转录，得到cdna，利用外引物f3和b3，对合成的cdna进行pcr扩增。
反应体系为：10×pcrbuffer2.5μl，dntp2.0μl，f31.0μl，b31.0μl，taqploymerase(takara)0.5μl，ddh2o17μl，cdna1.0μl。
反应程序：95℃预变性10min，95℃变性60s，51℃退火45s，72℃延伸35s，共35个循环，最后72℃再延伸7min。
反应结束后取5μlpcr扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，120v电泳20min，结果参见图1，其中，m：marker，条带1-6为pcr扩增产物，条带7-8为阴性对照，表明扩增出了与目的片段211bp相应的特异片段，而且引物特异性也非常好。
pcr扩增产物经过回收纯化后，与
将含baymv目标序列的阳性质粒进行测序，利用bioxm软件对测序结果与目标序列进行比对，结果表明，该序列与目的序列完全一致。
实施例3大麦黄花叶病毒的rt-lamp检测方法
1)提取待测样品rna；
2)配制rt-lamp反应体系；
所述lamp反应体系中，各成分的终浓度为：内引物fip为0.8μm，内引物bip为0.8μm，外引物f3为0.8μm，外引物b3为0.8μm，10×buffer，dntps为0.3mm、甜菜碱为0.6m，dna聚合酶bst为0.32u/μl；dtt为0.1-10mm，逆转录酶revertraace为3.33u/μl，待测样品rna10μg/μl；3)进行rt-lamp扩增反应
利用步骤2)的rt-lamp反应体系，与步骤1)获得的rna进行rt-lamp扩增；
以ddh2o为阴性对照，以包含大麦黄花叶病毒目的序列的质粒为阳性对照，获得对应的扩增产物；设置阴性对照以证明反应体系未被大麦黄花叶病毒污染，设置阳性对照以检测反应体系能够正常工作；
rt-lamp扩增反应的程序为：62℃30min，80-85℃3-5min；
4)扩增结果
步骤3)rt-lamp扩增反应结束后，向扩增产物中加入1μlsybrgreeni染料，观察颜色变化：显色为绿色的样品为阳性，含有大麦黄花叶病毒；显色为橘色的样品为阴性，不含大麦黄花叶病毒。
实施例4灵敏度验证
除rna模板浓度外，其余rt-lamp实验条件参考本发明实施例3。
以含大麦黄花叶病毒的大麦叶片总rna为模板，设置不同浓度，分别为100ng/μl，10ng/μl，1ng/μl，0.1ng/μl，0.01ng/μl，0.001ng/μl，0.0001ng/μl，0.00001ng/μl，以水为阴性对照，利用rt-lamp检测大麦黄花叶病毒，产物采用电泳检测或可视化检测；以rt-pcr检测为对比，产物采用电泳检测。
其中，rt-pcr检测时，将各浓度的rna进行反转录，得到对应浓度的cdna(20μl)；利用外引物f3和b3，对合成的cdna进行pcr扩增；cdna的用量分别为，100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、0.1ng/μl、0.01ng/μl、0.001ng/μl、0.0001ng/μl、0.00001ng/μl、阴性对照。
pcr扩增反应体系为：10×pcrbuffer2.5μl，dntp2.0μl，f31.0μl，b31.0μl，taqploymerase(takara)0.5μl，ddh2o16μl，cdna2μl。
反应程序：95℃预变性10min，95℃变性60s，51℃退火45s，72℃延伸35s，共35个循环，最后72℃再延伸7min。
rt-lamp电泳结果参见图3，其中，m：marker，1：100ng/μl，2：10ng/μl，3：1ng/μl，4：0.1ng/μl，5：0.01ng/μl，6：0.001ng/μl，7：0.0001ng/μl，8：0.00001ng/μl，9-10：阴性对照。
由于pcr扩增时，反应体系中cdna的用量(2μl)为反转录产物总cdna体积(20μl)的1/10，需对检测结果进行换算，经过换算后，对应于上述rt-lamp反应rna各浓度的rt-pcr电泳结果参见图4，其中，m：marker，1：100ng/μl，2：10ng/μl，3：1ng/μl，4：0.1ng/μl，5：0.01ng/μl，6：0.001ng/μl，7：0.0001ng/μl，8：0.00001ng/μl，9-10：阴性对照。
从图3中可以看到，当rna浓度为0.001ng/μl时，rt-lamp的扩增产物仍然能够很清楚的检测到，图4可以看出，当rna浓度为0.01ng/μl时，pcr扩增的目标条带就很弱了，而当rna浓度为0.001ng/μl时，基本就检测不到了。而从这说明rt-lamp的灵敏度非常高，而且很明显要高于rt-pcr的灵敏度。
rt-lamp可视化检测结果参见图5，其中，1：100ng/μl，2：10ng/μl，3：1ng/μl，4：0.1ng/μl，5：0.01ng/μl，6：0.001ng/μl，7：0.0001ng/μl，8：0.00001ng/μl，9-10：阴性对照。
由图5可以看出，可视化检测结果与电泳检测结果相对应，检测准确且灵敏度高。
实施例5样品实际检测
利用rt-lamp反应来检测感染大麦黄花叶病的病叶(来自江苏盐城田间的大麦黄花叶病发病叶片)和未感染大麦黄花叶病的健康叶片(来自上海农科院人工气候室水培的大麦幼苗)，并利用显色反应进行肉眼观察。
除rna模板来源外，其余rt-lamp实验条件参考本发明实施例3，结果参见图6。
从图6中可以看出，感病样品呈现出明显的绿色，而健康大麦叶片和阴性对照则没有这种颜色，因此，本发明的rt-lamp反应将可以直接用于大麦叶片是否感染大麦黄花叶病毒的检测和判断。