本发明属于生物技术领域，具体涉及一种应用重组酶聚合酶扩增技术(recombinaseploymeraseamplification，rpa)并结合侧流层析技术(lateralflowassay)检测bpiv3的引物、探针及其试剂盒。
背景技术：
牛副流行性感冒又称为运输热，是由牛副流感病毒3型(bovineparainfluenzavirustype3，bpiv3)病毒引起的一种急性接触性呼吸道传染病，主要发生于气候骤变，长途运输牛群以及饲养密度大的集约化养牛场。bpiv3也是较为重要的牛呼吸道综合征(bovinerespiratorydiseasecomplex，brdc)病原之一，主要侵害呼吸道，引起机体免疫机能和巨噬细胞功能下降，造成感染动物免疫抑制，进而继发细菌或支原体感染，发生典型的brdc，导致严重的支气管炎、细支气管炎和肺炎。
由于养殖动物高度密集，患病动物呼出、排泄大量的病原微生物，造成舍内高浓度微生物气溶胶的积聚，而且通过舍内外气体的交换，病原微生物随着大气传播、扩散，造成环境生物污染和传染病传播。bpiv3能在空气中形成气溶胶，病毒可随风远距离、快速传播度。因此，通过建立一种适用于bpiv3气溶胶及临床样本的检测方法，将为牛副流感的群体监测和预报预警提供配套技术。目前该病的诊断方法主要有病原分离、pcr方法、elisa试验和血清中和试验等，由于这些方法需要精密的仪器以及繁琐的试验程序，难以满足非实验室环境下现场检测的要求。因而亟需建立一套快速、准确、简便的诊断方法，为现场检测、病原的环境监测及疫情预报预警等提供新一代的检测技术与手段。
重组酶聚合酶扩增(recombinaseploymeraseamplification,rpa)技术是不同于pcr的核酸检测技术，rpa是在重组酶介导下模拟体内dna的复制过程。重组酶与引物结合形成蛋白-dna复合物后，寻找到双链dna同源序列，在单链dna结合蛋白的作用下，模板dna解链，引物与模板dna配对，并在链置换dna聚合酶的作用下复制、扩增，单个dna模板分子得到大约1012扩增产物。它与pcr不同，不需要退火反应过程，可在37℃～42℃等温条件下，反应20余min即可得到扩增产物(forgetetal.,2012)。rpa可以与侧向流动免疫层析技术相结合，在rpa扩增体系中，需要生物素标记的反向引物和荧光基团标记的探针，在距荧光基团30个碱基处有一个脱碱基位点(dspacer)，该位点可被nfo核酶识别、切割，产生新的羟基末端，并在dna聚合酶作用下延伸，形成带有生物素和荧光基团双标记的rpa产物，通过层析膜扩散，被生物素配体和荧光基团标记抗体捕获，形成具有颜色的检测线。该方法检测时间短，5min左右就能目测结果，肉眼判读。
本发明系首次采用rpa技术建立快速检测bpiv3的方法，并通过特异性和灵敏度评价，可用于临床现场检测，为bpiv3的现场检测提供一种灵敏、可靠的新方法。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供了一种rpa-侧流层析检测bpiv3的引物、探针组合，一种检测bpiv3的试剂盒，该试剂盒使用准确、快速、简便。本发明还提供一种应用rpa技术并结合侧流层析技术检测bpiv3的方法。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种rpa-侧流层析检测bpiv3引物和探针，其正向引物序列如seqidno.1所示，反向引物序列如seqidno.2所示，探针序列如seqidno.3所示。
正向引物bpiv3-f：5’-tttatcaatgaattagcaaacaagagagat-3’，(seqidno.1)；
反向引物bpiv3-r：
5’-[biotin]ccgatttgtaatacttgataagacttccct-3’，(seqidno.2)；
探针序列bpiv3-p：5’-[fam]gagatgtacctctggcaatccatccctgacaag[dspacer]aacccaaagataagac[c3-spacer]-3’；(seqidno.3)。
需要说明的是：与常规pcr反应不同，rpa反应所需引物的长度通常为30-35bp，探针序列的长度为46-52bp，引物设计时为了避免形成引物内部及之间的二级结构，其长度的增加也使引物设计及选择难度的增加，因此，引物的设计和选择对rpa的结果至关重要。rpa技术正处于起步研究阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其引物设计原则提供依据。因此，本发明的引物和探针组合是需要从靶标序列两端设计多对引物进行优化、筛选才能得到。
本发明相应的保护上述引物和探针组合在制备bpiv3的检测试剂中的应用。
本发明还提供了一种检测bpiv3的试剂盒，该试剂盒中包含有用于上述通过rpa技术检测bpiv3的引物和探针组合。
所述引物探针液的组成为：正向引物和反向引物终浓度均为0.4μmol/l，检测探针的终浓度为0.12μmol/l，扩增bpiv3核苷酸序列片段为seqidno.4。
进一步的，上述试剂盒中还包括：标准阳性质粒、缓冲液、酶扩增八联管、无菌双蒸水、反应驱动液、产物稀释液和侧流层析检测试剂。
所述标准阳性质粒为t3-bpiv3-hn，用于bpiv3检测的阳性对照，检验相应的反应体系和反应条件能否正常反应，由seqidno.5和seqidno.6扩增的核苷酸序列片段seqidno.7与peasy-t3载体相连接后得到的重组质粒。。
所述rpa侧流层析检测试剂包括侧流层析试纸条，杂交检测缓冲液(1×pbs+0.1％tween20)。
所述无菌双蒸水可作为阴性对照或补足反应体系用，其制备方法为双蒸水经高压灭菌后，分装到灭菌的小管中。
所述的缓冲液、酶扩增八联管、反应驱动液于市场购买得到。
具体的，一种检测bpiv3的试剂盒，每50μl扩增体系中含有缓冲液29.5μl、bpiv3的引物探针液4.6μl、无菌双蒸水12.4μl、待测样本cdna或以阳性标准质粒为阳性对照分别为1μl或以无菌双蒸水为空白对照1μl、反应驱动液2.5μl。
本发明还提供一种应用rpa技术并结合侧流层析技术检测bpiv3的方法，步骤如下：
(1)提取待测样本的总rna，参照反转录试剂盒说明书进行反转录，获得cdna；
(2)设计用于bpiv3检测的引物和探针，以cdna为模板，进行rpa扩增，扩增条件为：38℃水浴4min后，混匀，再38℃水浴20min；所述引物中正向引物序列如seqidno.1所示，反向引物序列如seqidno.2所示，所述探针序列如seqidno.3所示。该条件下合成的探针扩增效果最佳，条带特异性良好。
优选的，步骤(2)中rpa扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，分别回收，克隆至peast-t3载体连接，转化，蓝白斑筛选，挑取白色菌落，进行菌落pcr验证。将阳性重组菌在lb中培养过夜，试剂盒提取质粒dna，质粒测序，将测序正确的重组菌摇菌培养，提取质粒dna，获得阳性质粒，命名为t3-bpiv3-hn。
(3)应用侧流层析试纸条进行扩增产物检测。
优选的，当试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有bpiv3核酸；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有bpiv3核酸。
本发明的有益效果：
(1)本发明系首次采用rpa-侧流层析技术建立快速检测牛bpiv3的方法，并通过特异性和灵敏度评价，可用于临床现场检测，为bpiv3的现场检测提供一种灵敏、可靠的新方法。
(2)采用本发明的引物和探针组合，通过rpa技术对bpiv3临床样本进行了检测，具有较高的灵敏度、特异性和重复性。
本发明选用的bpiv3hn基因引物是经大量实验筛选获得的，特异性好，与牛的其它病毒包括牛肠道病毒、牛流热病毒、牛病毒性腹泻病毒、水疱性口炎病毒、牛传染性鼻气管炎病毒等病毒无交叉反应。
本发明所使用的引物探针扩增效果良好，条带特异性强，能够在检测区形成较高浓度的引物-探针异二聚体，因而使试纸条呈现强阳性反应，增加检测的灵敏度，本发明所建立检测方法可检测3个拷贝的bpiv3粒子。
(2)本发明的rpa技术并结合侧流层析技术检测bpiv3气溶胶的方法，既具有分子生物学检测的高灵敏、高通量，又具有免疫学检测的特异性好、操作简便的优点，还不需复杂仪器，尤其适于基层实验室和现场的bpiv3快速筛查检测。
(3)检测速度快：与常规pcr相比，不必经过变性、退火、延伸三个步骤，rpa反应的最适温度在37℃-42℃之间，无需变性，在常温下20min左右即可完成反应。
(4)不需要复杂的仪器设备，适用于现场检测。本发明所建立检测方法可以在常温等温条件下扩增、试纸条可视化检测，不要pcr仪、荧光定量pcr仪、电泳仪、电泳槽等复杂的仪器设备，而且rpa不需复杂的样品处理，可以真正实现便携式的现场快速核酸检测。
附图说明
图1bpiv3的rpa引物、探针组的琼脂糖凝胶电泳图；
其中1为f1/p1/r1引物探针组，2为f1/p1/r2引物探针组，3为f2/p1/r1引物探针组，4为f2/p1/r2引物探针组，5为f3/p1/r1引物探针组，6为f3/p1/r2引物探针组，pc为阳性对照，nc为阴性对照，m为dnamarkerdl2000；
图2bpiv3的rpa引物、探针组的侧流层析试纸条筛选结果图；
其中1为f1/p1/r1引物探针组，2为f1/p1/r2引物探针组，3为f2/p1/r1引物探针组，4为f2/p1/r2引物探针组，5为f3/p1/r1引物探针组，6为f3/p1/r2引物探针组，pc为阳性对照，nc为阴性对照；
图3bpiv3的rpa反应温度的筛选结果图；
图4bpiv3的rpa反应时间的筛选结果图；
图5rpa灵敏性的琼脂糖凝胶电泳检测结果图；
图6rpa灵敏性的侧流层析试纸条检测结果图；
图7rpa侧流层析试纸条检测方法的特异性试验结果图；
病原分别为牛病毒性腹泻病毒(bvdv)、牛传染性鼻气管炎病毒(ibrv)、牛流热病毒(befv)、牛冠状病毒(bcov)、水疱性口炎病毒(vsv)、牛呼吸道合胞体病毒(brsv)。
图8部分临床样本的rpa侧流层析试纸条检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
twistampnfokits购自twistdx公司，genlinehybridetect-1lateralflowstrips购自mileniagmbh(germany)，反转录试剂盒(codeno.：d2639a)购自宝生物工程(大连)有限公司，临床样本的dna/rna提取使用punch-ittmna-samplekit(nanohelix,daejeon,southkorea)；检测引物和探针由上海生工生物技术有限公司合成。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规的条件，例如sambrook等的《分子克隆：实验室手册》(newyork:coldspringharborlaboratorypress,2001)中所述条件，或按照仪器或试剂制造厂商所建议的条件进行操作。
一、阳性标准质粒的制备
1.引物的设计与合成
通过对genebank中bpiv3hn基因进行序列比对，确定保守区域，设计1对引物hn-f：5’-gcaaccacaacaaaatagc-3’，hn-r：5’-cggagttgagcacaactg-3’，分别为序列表中的seqidno.5和seqidno.6，扩增出pcr片段(序列表中的seqidno.7)，用于阳性标准质粒的构建；所有引物由上海生工生物技术有限公司合成。
2.bpiv3cdna的制备
参照病毒dna/rna提取试剂盒说明书，提取bpiv3rna，参照反转录试剂盒说明书进行反转录，获得cdna。
3.阳性质粒的制备
以上述方法制备的cdna为模板，进行pcr扩增，反应体系为50μl：10×pcrbufferii(mg2+plus)5μl、2.5mmdntpmixture8μl、lataq0.5μl(5u/μl)、cdna模板2μl，分别加入10μmol/l的引物bpiv3-f和bpiv3-r各2μl，灭菌超纯水加至50μl。反应程序为94℃预变性3min，然后94℃20s，55℃40s，72℃2min，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
bpiv3hn的pcr扩增产物为641bp，经1％琼脂糖凝胶电泳，分别回收，克隆至peast-t3载体连接，转化，蓝白斑筛选，挑取白色菌落，进行菌落pcr验证。将阳性重组菌在lb中培养过夜，试剂盒提取质粒dna，质粒测序，将测序正确的重组菌摇菌培养，提取质粒dna，获得阳性质粒，命名为t3-bpiv3-hn。二、bpiv3rpa侧流层析试纸条检测方法的优化与建立
1.rpa引物与探针的设计
rpa扩增的关键在于扩增引物和探针的设计。有关rpa引物和探针设计相关数据少，目前尚无用于设计的软件或成熟的原则。pcr引物并不适用于rpa，rpa引物比一般pcr引物长约30-35bp。引物过短会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度；而引物长度增加容易形成引物内部及之间的二级结构，其长度的增加也使引物设计及选择难度的增加。因此，用于rpa扩增的引物需要经过大量的实验进行筛选与优化。
一般情况下引物、探针的设计需参考以下因素：(1)gc含量在40％～60％；(2)尽量避免引物内部出现二级结构；(3)避免引物出现重复序列。
rpa探针的长度一般46～52个碱基，尽量避免与引物重叠、形成异二聚体。探针5’端标记fam基团，中间thf替代g或c(dspacer)，且dspacer两侧尽量避免g、c，dspacer修饰与5’端至少30碱基，与3’端至少15碱基，3’端c3-spacer修饰。
本实施例针对bpiv3hn基因的保守区设计了一系列的rpa引物与探针，具体见表1。
表1针对bpiv3hn基因保守区设计的rpa引物与探针
2.利用rpa扩增反应筛选引物和探针
以107拷贝的t3-bpiv3-hn为模板，rpa方法扩增bpiv3的hn基因。具体步骤：
(1)于离心管管底中分别加入引物探针组：其中上下游引物各2.1μl(10μmol/l)，lf探针0.6μl(10μmol/l)，缓冲液29.5μl，t3-bpiv3-hn1μl，用ddh2o补足到体积47.5μl，吹打混匀；每对引物探针组均设立阴性对照。
(2)将47.5μl缓冲液转移到含有冻干酶粉的0.2mltwistampnfo八联反应管中，经移液器反复吹打直至完全溶解。
(3)向每个反应管液体内加入2.5μl的醋酸镁(280mmol/l)溶液，混匀后反应即刻发生。
(4)将反应管放入38℃的恒温水浴锅中，处理4min。
(5)反应4min后，取出反应管，再次混匀后继续放入38℃的恒温水浴锅中反应20min。
(6)取检测管，在其中加入扩增产物1μl和49μl的产物稀释液，混合均匀后，放入检测试纸条，3～5min后，通过试纸条的显色进行判读。
3.引物和探针的筛选结果
表1所示的bpiv3引物探针组经rpa扩增后，通过琼脂糖凝胶电泳检测，引物探针组6：f3/p1/r2的rpa扩增效果最好，条带特异性好，没有非特异性扩增；而其它探针引物对出现非特异性扩增、没有目的条带、探针和下游引物扩增效率低等问题经过试纸条检测(图1)；rpa扩增产物经侧流层析试纸条检测，质控区均出现条带，引物探针组6：f3/p1/r2的rpa产物在检测区的颜色最深，表明引物探针组6形成了较高浓度的引物-探针异二聚体，因而使试纸条呈现强阳性反应；而其它引物探针组虽然也能在试纸条的检测区出现阳性条带，但检测颜色较浅，表明所形成的引物-探针异二聚体效率低，且结合琼脂糖凝胶电泳数据有非特异性扩增，因而这些引物探针对不能应用于rpa的检测。因此，选用引物探针组6：f3/p1/r2进行后续的rpa反应条件优化、特异性和敏感性试验，并将引物探针分别命名为bpiv3-f、bpiv3-r、bpiv3-p。
4.rpa扩增反应体系的优化
按表2所示，进行bpiv3-f、bpiv3-r、bpiv3-p使用量的优化，优化结果表明，上下游引物各为2μl、探针为0.6μl，效果较好。另外，还针对醋酸镁的使用量设置了7个浓度梯度。在rpa反应体系中加入浓度为280mm/μl醋酸镁的量分别为0.5μl、1μl、1.5μl、2μl、2.5μl和3μl，结果显示，醋酸镁用量过少将导致扩增的失败，反应体系中加入1μl及以上醋酸镁可以得到的扩增产物，并且产物随着醋酸镁量的增加而增加，但添加2.5μl和3μl的醋酸镁差别不明显。最终确定反应体系中加入2.5μl醋酸镁。
经优化后的rpa反应体系为：上下游引物各2.0μl(10μmol/l)，探针0.6μl(10μmol/l)，缓冲液29.5μl，模板cdna1μl，用ddh2o12.4μl，将上述混合液加入到含有冻干酶粉的0.2mltwistampnfo八联反应管中，用移液器反复吹打直到完全溶解。最后加入2.5μl的醋酸镁(280mmol/l)启动反应。38℃4min，混匀后，再38℃20min。
另外，还对rpa反应时间、反应温度进行优化，分别使用30℃、34℃、38℃、42℃、45℃和48℃进行rpa反应温度进行优化，反应温度38℃的rpa扩增效率最高(图3)；分别经5min、10min、15min、20min、25min、30min进行rpa反应时间进行优化，反应时间20min及以上时间，可以达到较好的扩增效率，优化的rpa反应时间为20min(图4)。
表2rpa反应引物和探针使用量组合优化表
三、bpiv3rpa侧流层析试纸条检测方法的灵敏度、重复性、特异性检测
1.rpa侧流层析试纸条检测方法的灵敏度分析及重复性检测
将标准阳性质粒t3-bpiv3-hn经pbs进行10倍系列稀释5×105～5拷贝和1个拷贝，应用试剂盒提取病毒的rna，反转录cdna；以优化的rpa条件进行rpa扩增，反应体系为：上下游引物各2.0μl(10μmol/l)，探针0.6μl(10μmol/l)，缓冲液29.5μl，模板cdna1μl，用ddh2o12.4μl，将上述混合液加入到含有冻干酶粉的0.2mltwistampnfo八联反应管中，用移液器反复吹打直到完全溶解。最后加入2.5μl的醋酸镁(280mmol/l)启动反应。38℃4min，混匀后，再38℃20min。
上述每个梯度的模板浓度做3个重复，通过rpa侧流层析试纸条检测，验证rpa侧流层析试纸条技术的批内重复性；另外，每间隔2d重复一次，共进行3次重复，验证rpa侧流层析试纸条技术的批间重复性。所获得的rpa产物分别进行侧流层析试纸条检测。结果表明，rpa-lfd的检测限为5个拷贝(图5)。
2.rpa侧流层析试纸条检测方法的特异性分析
参照病毒dna/rna提取试剂盒说明书，提取牛传染性鼻气管炎病毒(ibrv)的dna，提取牛病毒性腹泻病毒(bvdv)、牛流热病毒(befv)、牛冠状病毒(bcov)、水疱性口炎病毒(vsv)、牛呼吸道合胞体病毒(brsv)的rna，参照反转录试剂盒说明书进行反转录，获得cdna。
按照上述步骤建立rpa方法进行特异性试验，分别以ibrv的dna，bvdv、befv、bcov、vsv、brsv的cdna为模板，以ddh2o为阴性对照，进行rpa扩增，试验重复3次。
所有的rpa产物进行侧流层析试纸条检测，如图7所示，从图中可以看出，rpa扩增bpiv3特异性好，与其它检测病毒无交叉反应。因此，引物探针组bpiv3-f、bpiv3-r、bpiv3-p，可以用于建立检测bpiv3的rpa侧流层析试纸条方法，适用于鉴定未知样本bpiv3的检测。
四、rpa侧流层析检测试剂盒的组装与灵敏度、重复性试验
将引物bpiv3-f、bpiv3-r各200μl、探针bpiv3-p60μl混合，分装50μl/管，标准阳性质粒t3-bpiv3-hn分装，分装50μl/管，作为阳性对照；然后与缓冲液、酶扩增八联管、无菌双蒸水、反应驱动液、侧流免疫层析试纸条、产物稀释液组装成rpa侧流层析检测试剂盒。
利用所组装的rpa侧流层析检测试剂盒，按实施例3中t3-bpiv3-hn载体的5拷贝进行灵敏度检测，反应体系为：引物探针液4.6μl，缓冲液29.5μl，模板cdna1μl，ddh2o12.4μl，将上述混合液加入到酶扩增八联管中，用移液器反复吹打直到完全溶解。最后加入2.5μl的反应驱动液启动反应。38℃4min，混匀后，38℃20min。做三个重复，取1μl的rpa扩增产物用49μl的产物稀释液稀释，侧流免疫层析试纸条进行检测。结果表明，所组装的rpa侧流层析检测试剂盒可检测到的5拷贝的t3-bpiv3-hn，试验重复3次。
五、临床样本的检测
1.临床样本的采集
气溶胶样本：选择奶牛场的不同区域(奶牛舍、运动场、挤奶厅等)，应用ms-i型空气微生物采样箱，通过多功能微生物采样器(青岛，ms-1型)的porton采样器采集空气样品。首先安装三脚架，采样器放置高度为距地面1.5m，然后将10ml无菌磷酸盐缓冲液(pbs)注入proton采样器，同时滴加一滴橄榄油，放入三脚固定支架内固定。将porton冲击式稳流器的一端接到主机入气口上，另一端用橡胶管连接到proton采样器的出气口上。采样流量为5～35l/min，采样时间为30min。采样结束后将采样器内的采集液收集到15ml离心管保存用于检测。
鼻拭子样本：采集具有呼吸道临床症状牛的鼻拭子样本，将其放于含有5mlpbs的离心管内保存用于检测。
2.利用现场提取试剂盒punch-ittmna-samplekit快速提取临床样本的核酸
(1)在1.5ml的离心管中，加入50μl的裂解液，再加入10μl的样本，均匀混合；
(2)将上述裂解液加入到试剂盒的样本孔内，直到溶液完全被滤膜所吸收；
(3)在滤膜上加入200μl的洗涤液3-5min；
(4)从样本孔滤膜取下1mm大小的滤膜进行待检。
3.反转录制备cdna
参照反转录试剂盒说明书进行反转录，5×rtbuffer2μl、随机引物1μl、amv反转录酶1μl、ddh2o5μl、含有rna的1mm大小滤膜。30℃10min，42℃30min，95℃5min，将反应管置于冰上。
4.临床样本的检测
待测样本为经本实验室利用荧光定量方法检测的气溶胶样本13份、鼻拭子样本21份和15份阴性样本。利用现场提取试剂盒punch-ittmna-samplekit快速提取临床样本的总rna，反转录cdna。以提取的49份样本的cdna分别为模板，以阳性质粒为阳性对照、ddh2o为阴性对照，利用实施例4组装的rpa侧流层析检测试剂盒进行bpiv3的检测。反应体系如下：引物探针液4.6μl，缓冲液29.5μl，模板cdna1μl，ddh2o12.4μl，将上述混合液加入到酶扩增八联管中，用移液器反复吹打直到完全溶解。最后加入2.5μl的反应驱动液启动反应。38℃4min，混匀后，38℃20min。取1μl的rpa扩增产物用49μl的产物稀释液稀释，侧流免疫层析试纸条进行检测。若试纸条的检测区出现阳性检测条带，则待测样本中含有bpiv3；若试纸条的检测区未出现阳性检测条带，待测样本中没有bpiv3病原体。
经rpa侧流层析检测试剂盒检测，呈bpiv3阳性的样本34份，呈阴性的样本15份(图8)，此结果与sybrgreeni荧光定量pcr检测结果对照，结果完全一致。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
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<110>山东师范大学
<120>牛副流感病毒3型的rpa-侧流层析检测引物、探针及试剂盒
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