本发明涉及一类3,16-雄甾烯二酮类化合物或其药用盐及其在制备免疫抑制、抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
免疫应答反应本是机体自我保护、自身稳定的一种防御反应，长期抑制这种反应会带来感染和诱发肿瘤等一些严重的后果，这也是目前免疫抑制剂所遇到的一些问题。免疫抑制剂在临床为自身免疫病和器官移植后的排斥反应提供了有效的治疗药物，通常用来抑制器官移植后出现的排异反应，治疗骨髓移植后出现的移植物抗宿主病，或治疗类风湿性关节炎、克隆氏症等自身免疫性疾病，一般会通过药物进行免疫抑制。
目前约有100多种恶性肿瘤，死于癌症人数约占全世界疾病死亡人数的13%，预计全世界癌症死亡将继续增加；肿瘤的发生和发展与整个机体免疫功能衰退密切相关，肿瘤一旦发生又会反过来加深对机体免疫功能的抑制，助长肿瘤的发展。肿瘤细胞从原发部转移到其它部位继续生长，乃是肿瘤威胁生命的重要原因。在肿瘤发病的诸多因素中，各种类型的免疫抑制分子在肿瘤的形成及发展过程中起着关键作用，可作为抗瘤药物的新靶点，为肿瘤的生物治疗提供新思路。
自身免疫性疾病和癌症需要长期用药，而现有的糖皮质激素（如地塞米松）和免疫抑制剂长期用药普遍存在毒副作用大、使用不方便等缺点。中药作为一种天然产物，具有与人组织相容性质好、副作用小等优点，在免疫抑制剂和抗肿瘤制剂的研究中越来越受到人们的重视。因而，从天然产物中寻找具有免疫抑制和恶性肿瘤细胞增殖抑制作用的化合物，对于开发高效低毒的新型免疫抑制剂和抗肿瘤制剂具有应用价值。
思茅藤属（epigynum）富含雄甾烷、孕甾烷及其糖苷类成分。在发现新药先导化合物的兴趣驱动下，前期生物活性筛选发现其中多烯雄甾酮类化合物显著的免疫抑制活性；本发明提供的多烯雄甾酮化合物及其作为免疫抑制药物尚未见报道。
技术实现要素：
本发明提供了从思茅藤属植物中提取分离的3,16-雄甾烯二酮类化合物或其药学上可接受的盐，其化学结构式如式ⅰ所示：
其中，r1选自氢、羟基、甲基、卤素、羰基、脂肪烃基、脂肪氨基；
r2选自氢、羟基、甲基、卤素、脂肪烃基、脂肪氨基；
式中：
本发明所述3,16-雄甾烯二酮类化合物选自如下之一：
其中r1为氢、羰基或羟基，r2为氢或羟基。
本发明所述3,16-雄甾烯二酮类化合物药学上可接受的盐为与有机酸形成的盐或与无机酸形成的盐，其中有机酸包括但不限于酒石酸、柠檬酸、甲酸、乙酸、乙二酸、丁酸、马来酸、琥珀酸，无机酸包括但不限于盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸。
本发明化合物是从思茅藤属植物原料中进行溶剂提取，分离纯化制得。如有必要，与适当的酸成盐，所述的适当的酸包括选自酒石酸、柠檬酸、甲酸、乙酸、乙二酸、丁酸、马来酸、琥珀酸，盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸或磷酸或其他适当的有机酸或无机酸。
所述溶剂提取优选有机溶剂回流提取，超声波辅助提取或浸提，所述的有机溶剂选择不同比例的甲醇、乙醇、丙酮等水溶液。
本发明3,16-雄甾烯二酮类化合物选自如下之一：
化合物1为雄甾-4(5),14(15)-二烯-3,16-二酮，化合物2为雄甾-4(5),8(9),14(15)-三烯-3,11,16-三酮，化合物3为12β-羟基雄甾-4(5),14(15)-二烯-3,16-二酮。
本发明的另一目的是将上述3,16-雄甾烯二酮类化合物或其药学上可接受的盐应用在制备免疫抑制药物中。
本发明另一目的是将上述3,16-雄甾烯二酮类化合物或其药学上可接受的盐应用在制备抗肿瘤药物中。
具体是免疫抑制药物应用在制备自身免疫性疾病的治疗药物中，或应用在制备器官移植抗排斥反应的治疗药物、或应用在抗肿瘤药物中。
本发明所述应用中还可以加入一种或多种药物上可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的填充剂、稀释剂、粘合剂、赋形剂、吸收促进剂、填充剂、表面活性剂和稳定剂等，必要时还可加入香味剂、色素和甜味剂等。
本发明所述应用除制成胶囊外，还可以制成丸剂、粉剂、片剂、粒剂、口服液和注射液等多种形式。
本发明中用健康的balb/c小鼠来制备脾细胞，用于试验；脾细胞制备完成后，通过cona或者lps进行诱导，同时在试验组加入不同浓度供试化合物，培养72h后，通过cck-8试剂法分别测定试验组、诱导对照组和未诱导对照组的吸光值，从而评价化合物刺激t细胞或者b细胞增殖的能力；实验结果表明本发明中涉及的三个3,16-雄甾烯二酮类化合物，即化合物1-3；对cona（伴刀豆蛋白）刺激的balb/c小鼠脾淋巴细胞增殖有明显的抑制作用，与不加该化合物的对照组相比有显著性差异(p<0.05)。
取处于对数生长期人体肿瘤细胞调整为一定浓度的细胞悬液接种于96孔培养板，90μl/孔，培养24小时待其贴壁后加入不同浓度的化合物，10μl/孔，每个浓度均设3个复孔。细胞计数并使用台盘蓝染色法测定细胞的存活率，存活率＝未着色细胞数/细胞总数×100％，存活率＞95％者用于试验，细胞悬液调至1×106个/ml。设细胞空白对照组、阳性对照组（地塞米松）及样品组（浓度根据预试验结果定为25μmol·l-1，均含等浓度的dmso）。阴性对照为等体积培养基，同时设化合物25μg/ml时相应的dmso浓度为溶媒对照，以消除dmso对细胞生长的影响。加药后继续置于37℃，5％co2培养箱培养，在药物分别作用1、3、6、12、18、24小时后，每孔加入mtt（5mg/ml）20μl，继续培养4小时，每孔加入三联液[10％sds-5％异丁醇－0.012mol/lhcl(w/v/v)]100μl溶解甲臜。用酶标仪在570nm波长下测定各孔的od值推测出细胞增殖抑制率。
本发明优点和技术效果：本发明首次从思茅藤属植物中中获得三个3,16-雄甾烯二酮类化合物，免疫抑制实验表明该类化合物在浓度为25μm和50μm时均具有显著地免疫抑制活性，且对24种人体肿瘤细胞株有较好的抑制作用，其中有9株人体肿瘤细胞（molt-4、k-562、snb-75、sf-539、sf-295、nci-h226、nci-h522、sr、hs578t）对阳性药物地塞米松表现出耐药性。本发明中的三个化合物为研制免疫抑制剂和抗肿瘤制剂提供了先导化合物，有利于开发利用植物药用资源。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规市售试剂或按常规方法配置的试剂。
实施例1：3，16-雄甾烯二酮类化合物的制备
取思茅藤属植物样品，经干燥、粉碎后采用，用体积浓度70%的乙醇溶液回流提取2次，每次3h，过滤除去滤渣后合并提取液，减压浓缩后再用乙酸乙酯进行萃取2次，浓缩后得到乙酸乙酯层萃取物；将乙酸乙酯层萃取物用大孔吸附树脂d101进行粗分，依次用纯水、体积百分比40%、60%、80%、100%的甲醇水溶液进行洗脱总共得到5个部分(fr.a、fr.b、fr.c、fr.d、fr.e)；d部分5g用c18中压柱体积浓度60%、70%、80%、90%的甲醇水溶液冲洗划段，取其80%甲醇水冲洗段，用100-200目硅胶拌样，以石油醚-丙酮两相体系为流动相进行10:1-2:1梯度洗脱，然后对其中成点的化合物用高效液相色谱hplc进行分离纯化，得到化合物1（1.8mg）；
e部分8g用c18中压柱50%、60%、70%、80%甲醇水体系划段，取其体积浓度70%甲醇水冲洗段，用100-200目硅胶拌样，以氯仿-丙酮两相体系为流动相10:1-1:1进行梯度洗脱，得到e1和e2两个部分（e1=24mg，e2=34mg）,e1部分用凝胶柱纯化，然后氯仿：丙酮2:1跑制备版，刮板得到化合物2（9.6mg）；e2部分用高效液相色谱hplc进行分离纯化，得到化合物3（5mg）；
鉴定结果如下：
3,16-雄甾烯二酮类化合物1：黄色不定型粉末；[α]
3,16-雄甾烯二酮类化合物2：黄色不定型粉末；[α]
3,16-雄甾烯二酮类化合物3：黄色不定型粉末；[α]
以上所述三个3,16-雄甾烯二酮类化合物均为新的天然有机化合物。
表1：3,16-雄甾烯二酮类化合物的1hnmr和13cnmr数据
实施例2：免疫抑制检测试验
（1）脾淋巴细胞悬液的制备
取18~22g的健康babl/c小鼠放血处死，置于体积浓度75%酒精中浸泡消毒5分钟，取出，置于无菌托盘中，左侧朝上，在超净台中，用消毒过的镊子夹起腹中部皮毛，作一切口，用另外一套器械剪开腹壁各层，用第三套器械将脾取出，去除脂肪和结缔组织，放入pbs（磷酸盐缓冲液）中，洗去浮血；然后将脾组织移至盛有rpmi1640不完全培养液的平皿中，用剪刀剪成小块，用无菌注射器芯在200目不锈钢筛网中将脾研碎，用pbs少量多次冲洗，将悬液用移液器转移至15ml离心管中；1000r/min转速离心5min；吸弃上清液，加入3ml红细胞裂解液（tris-nh4cl）混匀，静置2min后加入10mlpbs终止反应，离心(1200rpm,5min)，去上清，沉淀用5mlpbs洗涤两次，同样条件下离心；沉淀用5ml含10%胎牛血清的rpmi1640完全培养液悬浮；以0.8%台盼兰活细胞拒染法计数，活细胞数不少于95%，加rpmi1640完全培养液稀释，调整细胞浓度至1×106个/ml左右。
（2）供试液的制备
精密称取单体化合物2mg，加入dmso溶解，上样前用pbs稀释至所需浓度，并使得上样后的dmso终浓度不超过0.1%。
（3）实验分组
正常对照组：100μl脾细胞悬液+10μlrpmi1640完全培养基+10μlpbs
模型组：100μl脾细胞悬液+10μlcona(终浓度为10μg/ml)+10μlpbs
样品组：100μl脾细胞悬液+10μlcona(终浓度为10μg/ml)+10μl样品；
96孔板中，每孔加入淋巴细胞悬液（1×106个/ml）100μl，cona10μl(终浓度为10μg/ml)，不同浓度试药化合物稀释液10μl(终浓度分别为12.5、25、50μg/ml)，地塞米松也做三个对应的浓度组，正常对照组孔分别用10μl的1640完全培养液（含10%胎牛血清）和10μl的pbs补齐，每个浓度组设4个平行。
（4）培养：置于37℃，5%co2培养箱内培养72小时。
（5）cck-8法测定细胞od值
培养72小时后，每孔中加入10μl的cck-8试剂(碧云天)，置于37℃，5%co2培养箱内继续培养4小时后，在450nm处测定每孔的吸光值以计算细胞增殖情况，并按下式计算刺激指数（si）：
si（刺激指数）=加有丝分裂原培养物的od值/不加有丝分裂原培养物的od值；
（6）数据处理
实验数据od值采用“平均数±标准差”来表示，数理统计及方差分析工作采用origin软件完成；
（7）实验结果
表2：化合物1对cona刺激的balb/c小鼠脾淋巴细胞增殖的刺激指数
化合物1在浓度为12.5、25、50μm时的刺激指数分别为3.49，2.55，1.72；显著性分析表明，中浓度和高浓度组与模型组相比有显著性差异（p<0.05）。
表3：化合物2对cona刺激的balb/c小鼠脾淋巴细胞增殖的刺激指数
化合物2在浓度为12.5、25、50μm时的刺激指数分别为3.18，2.21，1.51；显著性分析表明，高浓度组与模型组相比有显著性差异（p<0.05）。
表4：化合物3对cona刺激的balb/c小鼠脾淋巴细胞增殖的刺激指数
化合物3在浓度为12.5、25、50μm时的刺激指数分别为2.87，2.38，1.79；显著性分析表明，高浓度组与模型组相比有显著性差异（p<0.05）。
阳性对照结果为：
表5：地塞米松对cona刺激的balb/c小鼠脾淋巴细胞增殖的刺激指数
地塞米松在浓度为12.5、25、50μm时的刺激指数分别为1.71，1.42，1.15；显著性分析表明，各浓度组与模型组相比有显著性差异（p<0.05）。
实验结果表明，3,16-雄甾烯二酮类化合物1-3在浓度为25μm和50μm时均具有显著地免疫抑制活性。
实施例3：体外抗肿瘤活性试验
（1）材料
dmso（美国sigma公司）、胎牛血清（美国hyclone公司）、rpmi-1640培养液（美国hyclone公司）、磷酸盐缓冲液（上海beyotime公司）、双抗（美国hyclone公司）、cck-8（东仁化学科技有限公司），人体肿瘤细胞（ccrf-cem、molt-4、k-562、malme-3m、uacc-62、snb-75、ovcar8、ekvx、u0-31、sf-295、nci-h226、sk-ov3、mda_mb-468、hop92），本发明化合物及地塞米松均用dmso配制。
（2）方法
取5种处于对数生长期人体肿瘤细胞调整为一定浓度的细胞悬液接种于96孔培养板，90μl/孔，培养24小时待其贴壁后加入不同浓度的化合物，10μl/孔，每个浓度均设3个复孔。细胞计数并使用台盘蓝染色法测定细胞的存活率，存活率＝未着色细胞数/细胞总数×100％，存活率＞95％者用于试验，细胞悬液调至1×106个/ml。设细胞空白对照组、阳性对照组（地塞米松）及样品组（浓度根据预试验结果定为25μmol·l-1，均含等浓度的dmso）。阴性对照为等体积培养基，同时设化合物25μg/ml时相应的dmso浓度为溶媒对照，以消除dmso对细胞生长的影响。
（3）培养
加药后继续置于37℃，5％co2培养箱培养。
（4）mtt法测定od值
在药物分别作用1、3、6、12、18、24小时后，每孔加入mtt（5mg/ml）20μl，继续培养4小时，每孔加入三联液[10％sds-5％异丁醇-0.012mol/lhcl]100μl溶解甲臜，通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可以根据光密度od值推测出活细胞的数目，并按下式计算细胞抑制率：
（5）数据处理
实验数据od值采用“平均数±标准差”来表示，数理统计及方差分析工作采用origin软件完成。
（6）实验结果
本发明三个新化合物对24种人体肿瘤细胞株有较好的抑制。结果显示其中有9株人体肿瘤细胞（molt-4、k-562、snb-75、sf-539、sf-295、nci-h226、nci-h522、sr、hs578t）对地塞米松具有耐药性，本发明化合物1具有较好的细胞毒活性；本发明三个新化合物对其他15株肿瘤细胞（sk-ov3、mda_mb-468、hop92、ekvx、u0-31、ovcar8、uacc-62、malme-3m、ccrf-cem、sk-mel-2、snb-19、u251、ht-29、t-47d、nic-h322m）有抑制作用且与阳性对照活性相当(表6)。
表6：化合物对人体肿瘤细胞存活率的影响