一种用于检测生物细胞Hg2+的荧光探针及其合成方法与流程

本发明属于生物细胞诊断领域，具体涉及一种用于检测生物细胞hg²⁺的荧光探针及其合成方法。

背景技术：

汞是一种典型的重金属离子，具有极强的毒性，可造成生物神经系统的永久性损伤。环境中的汞在空气中被氧化成水溶性的二价汞离子，汞离子一旦进入水环境，就会被细菌类微生物转化为有机的甲基汞，并在生物体内(如鱼类)快速积累从而进入食物链。甲基汞破坏人的神经系统，引起大脑受损、认知和运动紊乱等，震惊世界的“水俣病”就是有机汞中毒的一种类型。因此寻找可在水溶液环境中检测汞离子的快速、简单、灵敏的检测方法，对水体环境中重金属的检测具有重要意义。

目前检测汞元素的主要方法有：高效液相色谱法，质谱法，原子吸收光谱法，等离子体感应光谱法，原子发射光谱法，电化学传感，双硫腙比色法等，但是这些方法比较昂贵，专业性强，耗时而且操作复杂。荧光法应用合适的探针可以对目标物实现高效、“裸眼”检测，无损耗，同时对目标物进行定性和定量分析。目前具有不同激发和发射波长的荧光团被用作化学检测器的信号接受者，例如香豆素，芘，1,8-萘二甲酰胺，罗丹明，花菁类，bodipy类等。其中以罗丹明为荧光基团构建的荧光探针，由于其优异的荧光性能和良好的可修饰性，目前已成为最受关注的荧光探针之一。

罗丹明是一类属于呫吨类的荧光染料，其结构如图a为氧蒽杂环结构，b为罗丹明染料。由于其具有优越的光物理性能，如高摩尔消光系数，光稳定性好，荧光量子产率高，发射波长长等优点，使得其得到了广泛的应用。自1905年noelting和dziewonsky首次报道合成了罗丹明类化合物(noelting,e.；dziewonski,k.totheknowledgeoftherhodamine[j].ber.dtschchem.ges.,1905,38,3516-3527.)，此后罗丹明类化合物便广泛应用于各领域，但是目前大多数罗丹明汞离子荧光探针存在水溶性较差，易受其他金属离子干扰，灵敏度不高等问题，不利于用于生物细胞成像。

如专利号cn201510869087.0公开了检测汞离子的反应型罗丹明类荧光探针及其制备与应用，2-叠氮甲基吡啶与4-(2-炔基丙氧基)苯甲醛经过铜(i)催化点击化学反应制得中间产物，所得中间产物与罗丹明内酰胺反应制得罗丹明类汞离子荧光探针，所述探针在环境检测方面10^-5m探针检测10^-6m的汞离子，可见其灵敏度不够高。

专利号cn201210454819.6公开了一种罗丹明b硫代双酰肼衍生物作为hg²⁺荧光探针在水中或血清与hg²⁺检测中的应用，其中所述罗丹明b硫代双酰肼衍生物结构式如式(i)所示，所述hg²⁺检测是利用罗丹明b硫代双酰肼衍生物与hg²⁺发生反应生成发荧光的结构式如式(ii)所示的罗丹明b-1,3,4-噁二唑衍生物实现。本发明可以选择性地使罗丹明b硫代双酰肼衍生物即hg²⁺荧光探针与分析物汞离子反应，灵敏度，强荧光增强效应明显，有效实现了对汞离子的非破坏性的和快速的检测，具有重要而广泛的社会价值和经济效益,但是其检测汞离子需在dmf的缓冲溶液中进行，dmf对生物细胞具有一定的毒性。

专利号cn201310409868.2公开了一种新型罗丹明类荧光探针，所述探针以罗丹明b(rhb)为原料，用二元胺修饰改性rhb制备罗丹明内酰胺，进而与马来酸酐(mah)和金刚烷胺反应，制备得到罗丹明类荧光探针，其结构中含有可与金属离子发生作用的多个胺基功能团和可与hg²⁺作用的碳碳双键。螺旋状罗丹明内酰胺化合物在与重金属粒子结合后，内酰胺氮原子的质子化将导致氮原子电荷密度减少，从而引发螺旋中心c-n键的开裂，产生荧光变化和颜色变化，但是所得探针对水溶液中汞离子和铁离子都具有较好的识别能力，检测时易造成干扰，不具有专一性。

因此，为了克服分析仪器比较昂贵、专业性强、耗时而且操作复杂等问题和目前荧光探针存在选择性差、水溶性差、灵敏度不高等问题，设计合成一种新型的用于检测生物细胞hg²⁺的荧光探针具有重要的意义。

技术实现要素：

为了解决荧光探针存在选择性差、水溶性差、灵敏度不高等问题，本发明提供一种新型的用于检测生物细胞hg²⁺的荧光探针及其合成方法与应用。

一种用于检测生物细胞hg²⁺的荧光探针，反应方程式如图1所示。

其合成步骤如下：

(i)在惰性气体保护下，将溶于有机溶剂的2-溴乙酰胺溶液逐滴加到koh和有机溶剂悬浮液中，控制反应温度-5～5℃，反应10～20min后，逐滴加入溴丙炔，-5～5℃反应1～10min后控制温度至20～50℃反应过夜，加入去离子水，chcl3萃取，饱和食盐水洗涤，无水mgso4干燥，过滤，浓缩，柱层析分离纯化，得到黄色液体(化合物1)；

(ii)在惰性气体保护下，将溶于有机溶剂的罗丹明内硫酰胺，搅拌下逐滴加到nah和有机溶剂悬浮液中，控制反应温度-5～5℃，反应10～50min，接着将溶于有机溶剂的化合物1，逐滴加到反应体系中，加完后控制温度至20～50℃反应过夜，加入去离子水，chcl3萃取，饱和食盐水洗涤，无水mgso4干燥，过滤，浓缩，柱层析分离纯化，得到灰白色固体(化合物2)；

(iii)将化合物2和化合物3溶于有机溶剂，惰性气体保护下，加入抗坏血酸钠和cuso4·5h2o去离子水溶液，室温反应过夜，加入去离子水，chcl3萃取，饱和食盐水洗涤，无水mgso4干燥，过滤，浓缩，柱层析分离纯化，得到粉色固体；

(iv)将粉色固体加到甲醇/水，三乙胺的溶液中反应3～8h，加入去离子水，chcl3萃取，饱和食盐水洗涤，无水mgso4干燥，过滤，浓缩，柱层析分离纯化，得到淡粉色固体(化合物4)。

进一步的，有机溶剂为无水甲醇、乙醇、乙腈、thf。

进一步的，溴丙炔、2-溴乙酰胺和koh的摩尔比为1:1.0～1.5:0.8～1.0。

进一步的，步骤iii中化合物2、化合物3、坏血酸钠和cuso4·5h2o的摩尔比为1:2～2.5:0.8～1.0:0.8～1.0。

进一步的，步骤iv中三乙胺：水：甲醇的体积比为1:0.8～1:6～10。

进一步的，柱层析分离纯化溶剂为二氯甲烷与乙醇。

本发明基于罗丹明染料和葡萄糖具有较好的水溶性，依据全乙酰糖基叠氮经过铜(i)催化点击化学反应以及脱乙酰化反应设计出一种特殊结构的用于检测生物细胞hg²⁺的荧光探针。此探针对汞离子有很好的选择性，对k⁺、na⁺、ca²⁺、mg²⁺、zn²⁺、cd²⁺、mn²⁺、fe³⁺、pb²⁺等金属离子具有很好的抗干扰能力，而且检测灵敏度高，分辨时间短，可应用于环境水体样品、活细胞内的汞离子检测，具有广泛应用前景。

附图说明

图1为用于检测生物细胞hg²⁺的荧光探针的反应方程式；

图2为检测生物细胞hg²⁺的荧光探针对金属离子选择性的荧光发射光谱图；

图3为检测生物细胞hg²⁺的荧光探针对3eq的hg²⁺和5eq其它干扰离子的荧光发射光谱图；

图4为检测生物细胞hg²⁺的荧光探针对不同hg²⁺浓度的荧光发射光谱图。

具体实施方式

如图1所示，合成用于检测生物细胞hg²⁺的荧光探针，具体方案如下：

实施例一

(i)将koh(5.60g)和无水thf(20ml)悬浮液冷却至-5℃，n2保护。将溶于无水thf的2-溴乙酰胺溶液逐滴加到koh和无水thf悬浮液中，加完后-5℃反应10min，逐滴加入溴丙炔，-5℃反应10min后控制温度至35℃反应过夜，加入去离子水，chcl3萃取，饱和食盐水洗涤，无水mgso4干燥，过滤，浓缩，柱层析纯化，得到黄色液体(化合物1)；

(ii)将nah(0.01mol)和无水thf(10ml)悬浮液冷却至-5℃，n2保护。将罗丹明内酰胺(0.01mol)溶于无水thf(15ml)后，搅拌下逐滴加入反应液中，加完后-5℃反应30min，再将预先配置的溶液(0.01mol化合物1和10ml无水thf)逐滴加入反应体系中，加完后控制温度至35℃反应过夜，加入去离子水，chcl3萃取，饱和食盐水洗涤，无水mgso4干燥，过滤，浓缩，柱层析纯化，得到灰白色固体(化合物2)；

(iii)将化合物2(0.02mmol)和罗丹明内硫酰胺(0.01mmol)溶于15mlthf，n2保护，加入10ml抗坏血酸钠(0.16g)和cuso4·5h2o(0.20g)去离子水溶液，室温反应过夜，加入去离子水，chcl3萃取，饱和食盐水洗涤，无水mgso4干燥，过滤，浓缩，柱层析纯化，得到粉色固体；

(iv)将粉色固体中加入体积比为8:1:1的甲醇、水、三乙胺的30ml溶液中反应8h，加入去离子水，chcl3萃取，饱和食盐水洗涤，无水na2so4干燥，过滤，浓缩，柱层析纯化，得到淡粉色固体(化合物4)。

实施例二

如图2所示，往探针溶液中分别加入5倍当量的k⁺、na⁺、ca²⁺、mg²⁺、zn²⁺、cd²⁺、mn²⁺、fe³⁺、pb²⁺离子时，探针溶液为无色，在580nm处荧光强度也没有发生变化，可见探针保持原来的结构，能够稳定存在于这些溶液体系中。当探针溶液中加入hg²⁺后，溶液由无色变为红色，在580nm处荧光强度明显增强，出现一个强的发射峰。这是由于hg²⁺与探针反应使得罗丹明的螺环打开，产生荧光发射。

实施例三

如图3所示，以最大发射峰位置的荧光强度为纵坐标，金属离子为横坐标，首先往探针溶液中分别加入5倍当量的干扰离子(k⁺、na⁺、ca²⁺、mg²⁺、zn²⁺、cd²⁺、mn²⁺、fe³⁺、pb²⁺)，再加入3倍当量的hg²⁺，溶液从无色状态马上变为红色，测试其荧光强度，由图可知，在其他干扰离子的存在下，探针对hg²⁺仍具有很好的识别能力。

实施例四

如图4所示，配制16份5ml的5μm探针溶液，分别加入0-80μm的铜离子，进行荧光检测(λex＝520nm)，计算各体系中荧光强度，通过分析580nm处的荧光强度与hg²⁺浓度的关系，评估探针对hg²⁺的响应性能。图4表明随着hg²⁺浓度的增大，溶液的荧光强度逐渐增强，直到最大发射强度不在变化，探针在hg²⁺浓度4×10^-6mol/l～6×10^-5mol/l范围内呈线性关系，线性相关系数为r²＝0.9915，而且探针对hg²⁺的检测限为1.16×10^-8mol/l。

上述仅为本发明的优选具体实施方式，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。