本发明属于生物技术领域，具体涉及一种水母雪莲高产黄酮细胞系的制备方法及培养基。
背景技术：
水母雪莲(sausureamedusamaxim.)是藏药“雪莲”药材的原植物，分布在我国青海、甘肃、西藏等地，是藏药中的名贵药材。雪莲中含黄酮、生物碱、内酯、甾醇、挥发油、多糖等多种成分，其有效成分主要为黄酮类化合物。黄酮类化合物的药理作用包括抗癌、抗肿瘤，抗心脑血管疾病，镇咳祛痰，抗炎、镇痛作用，免疫调节作用，雌性激素样作用，抗菌及抗病毒作用，抗氧化、抗衰老作用，抗辐射。以黄酮类化合物为有效成分的雪莲注射液治疗偏头痛效果显著。又如用来治疗偏瘫的雪莲通脉丸、雪莲注射液和治疗脑动脉硬化与缺血性中风的雪莲通脉口服液，都是以黄酮类化合物含量为质量标准的。
雪莲生长在海拔2400米至4000米以下的石缝、砾石坡和湿润沙地上，属于生长期较长的耐寒植物，通常需用5年时间才能生长为成熟的植株。由于雪莲药用价值高、资源贫乏。导致掠夺式盗挖严重，已经威胁到了雪莲物种的生存，且采集野生雪莲对野生资源具有严重的破坏性。
雪莲中有效成分结构复杂，难以化学合成。通过植物细胞大量培养生产植物药可不受自然条件的限制，对药物质量容易控制。不占用耕地面积，以及对保护国家珍稀植物物种，维护生物多样性及持续发展具有重要意义。但是，目前采用植物细胞进行培养，其获得有效成分黄酮类化合物含量低，通常只有干重的6-7％左右，对于能产生较高黄酮类化合物产量细胞系，一直较难培育，如何能获得一种较高黄酮类化合物含量、发酵期短的细胞系的方法，更是比较困难。
技术实现要素：
为解决现有技术的上述技术问题，本发明提供一种水母雪莲高产黄酮细胞系的制备方法，该方法所获得的黄酮高产细胞系，其遗传性能稳定，黄酮含量高，细胞悬浮培养易形成细胞聚集体，比较适合于大型生物反应器规模化的批量生产。
为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
一种水母雪莲高产黄酮细胞系的制备方法，其包括如下步骤：
s1、采用水母雪莲种子诱导愈伤组织；
s2、将步骤s1获得的愈伤组织进行固体继代培养；
s3、用目测法从步骤s2中的愈伤组织中直接挑选总黄酮的含量高的细胞系；
s4、将步骤s3获得的细胞系从固体培养转到液体培养，再从液体转入到固体培养，如此不断地反复筛选、继代多次得到成长迅速、总黄酮的含量较高的细胞系。
如上所述的制备方法，优选地，所述方法还包括：
s5、将步骤s4获得的所述较高产细胞系作60coγ-射线照射诱变，之后采用小细胞团筛选法，获得总黄酮高产量的细胞系。
如上所述的制备方法，优选地，所述步骤s1包括将水母雪莲种子消毒后，去掉外壳和种皮，然后接在含3mg/l的2,4-二氯苯氧基乙酸的培养基中，25℃暗培养，30d后从种子胚轴和子叶边缘能够生长出颗粒状愈伤组织，每2周继代一次。
如上所述的制备方法，优选地，所述消毒为先用70-75％乙醇消毒1分钟，无菌水冲洗，再用2％的次氯酸钠溶液振荡消毒60-62min，再用无菌水冲洗。
如上所述的制备方法，优选地，所述步骤s2中愈伤组织的培养采用的培养基中添加有0.2mg/l的苄氨基腺嘌呤，2mg/l萘乙酸进行继代培养。
如上所述的制备方法，优选地，在所述步骤s2中，采用58.4μmol·m-2·s-1日光灯照射，25℃下培养，每隔2周继代1次。
如上所述的制备方法，优选地，所述步骤s4中，所述继代为12-30次。
如上所述的制备方法，优选地，采用的培养基的配方为：
大量元素：nh4no31200mg/l，kno31200mg/l，cacl2·2h2o300mg/l，mgso4·7h2o370mg/l，kh2po4300mg/l；
微量元素：h3bo36.2mg/l，mnso4·4h2o22.3mg/l，znso4·7h2o10mg/l，na2mno4·2h2o0.25mg/l，cuso4·5h2o0.025mg/l，cocl2·6h2o0.025mg/l，feso4·7h2o22mg/l，na2-edta·2h2o30mg/l；
有机成分：肌醇100mg/l，烟酸0.5mg/l，盐酸吡哆醇0.5mg/l，盐酸硫胺素0.5mg/l，甘氨酸2mg/l，蔗糖30g/l，琼脂7g/l，ph为5.8，其中，液体培养时不添加琼脂，在所述步骤s1中所用的培养基中为所述大量元素减半的培养基。
如上所述水母雪莲高产黄酮细胞系在用于制备黄酮类化合物中的应用。
一种用于水母雪莲高产黄酮细胞系的培养基，所述培养基的配方为：含有1200mg/l的nh4no3，1200mg/l的kno3，300mg/l的cacl2·2h2o，370mg/l的mgso4·7h2o，300mg/l的kh2po4；6.2mg/l的h3bo3，22.3mg/l的mnso4·4h2o，10mg/l的znso4·7h2o，0.25mg/l的0.25mg/l的na2mno4·2h2o，0.025mg/l的cuso4·5h2o，0.025mg/l的cocl2·6h2o，22mg/l的feso4·7h2o，30mg/l的na2-edta·2h2o；100mg/l的肌醇，0.5mg/l的烟酸，0.5mg/l的盐酸吡哆醇，0.5mg/l的盐酸硫胺素，2mg/l的甘氨酸，30g/l的蔗糖和7g/l的琼脂，ph为5.8。
本发明的有益效果为：
本发明方法提供的一种水母雪莲高产黄酮细胞系，细胞悬浮培养在25℃左右，其细胞生长速率可达45g-50g干重/升/月，黄酮类化合物的含量可达培养物干重的12％，生长周期为12d。但现有雪莲细胞的固体培养需要14-15d。
本发明还提供一种适用于水母雪莲细胞系的培养基，有助于水母雪莲细胞系的生长及黄铜的产生。
本发明较已有技术相比具有如下优点及积极效果:
1、本发明采用雪莲种子进行培育产生愈伤组织，比与用雪莲外植体诱导愈伤组织相比，更加方便获得，因为雪莲产于我国特殊地域，如从我国遥远的西藏等地区的高山上采取新鲜的外植体带到实验室作为愈伤组织诱导的材料比较困难。
2、通过植物细胞大量培养进行工业化生产雪莲类黄酮化合物可保护雪莲野生资源，保护生态环境。
3、对制备获得的水母雪莲高产黄酮细胞系可应用细胞大量培养进行工业化生产雪莲类黄酮化合物，不受自然条件的限制，对药物质量容易控制。
4、通过人工可有效对细胞生长及黄酮含量提高的调节与控制。
附图说明
图1高产细胞系红色系(a-1)细胞聚集体的研究结果。
图2为水母雪莲红色系(a-1)悬浮培养细胞的生长动态与黄酮含量变化曲线。
具体实施方式
本发明方法采用种子进行产生愈伤组织，比用雪莲外植体诱导愈伤组织方便，因雪莲新鲜的外植体带到实验室作为愈伤组织诱导的材料比较困难。经大量实验表明先将种子进行消毒后，去掉外壳和种皮，种子萌发速率快，产生的愈伤组织只需要30d左右，如果不除去外壳和种皮产生愈伤组织需要40d。种子消毒后，去掉外壳和种皮，种子萌发速率高，每100粒可有80粒产生愈伤组织，而不去掉外壳和种皮得种子只有50粒。并对ms培养基进行了改良，采用改良后的培养基可获得较好的效果。本发明中采用细胞聚集体体积大小来筛选高产细胞系，获得的细胞系产量高，较稳定，对细胞悬浮乃大规模的发酵具有重大意义。
下面结合具体的实施例来说明本发明内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，下面实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
(1)天山雪莲幼胚愈伤组织的诱导
用70％乙醇对天山雪莲种子消毒1min，无菌水冲洗2-3遍；再用2％的次氯酸钠溶液振荡消毒60-62min，无菌水冲洗4-5遍；在无菌条件下，去掉外壳和种皮，然后接在改良后的ms固体培养基(1/2)，需要注意的是：1/2是指培养基成分中大量元素减半，其中，在改良后的ms培养基中添加有2，4-d(2,4-二氯苯氧基乙酸)浓度为3mg/l，ph值为5.8，在25℃进行暗培养，30d后，从种子胚轴和子叶边缘能够生长出颗粒状愈伤组织，于25℃暗培养，每2周继代一次(即每2周更换一次培养基)。
(2)愈伤组织的培养
在改良后的ms培养基中添加0.2mg/lba(苄氨基腺嘌呤)、2mg/lnaa(萘乙酸)，ph5.8的培养基上对上述愈伤组织进行固体继代培养。培养条件：50ml三角瓶内含20ml固体培养基(在改良后的培养基中加有琼脂)，每瓶接种量约为鲜重0.5g，具体操作为用镊子取出愈伤组织(步骤(1)中诱导并继代10次的愈伤组织)直接接种到上述三角瓶中，在58.4μmol·m-2·s-1日光灯照射，25℃下培养，每隔2周继代1次。
(3)高产细胞系的筛选
固体培养基状态下的筛选：用目测法从上述(2)的愈伤组织中直接挑选分别得到红色的、浅黄色和白色的愈伤组织，即红色系，黄色系，白色系，在培养条件：细胞悬浮培养，培养基(改良的ms培养基)，温度25℃，培养周期12d，其获得的组织特征见表1，并分别明名为a、b、c系，转接培养。经筛选获得的三种不同颜色的细胞系中扩大增殖的愈伤组织一部分用作继代培养，另一部分用于测定黄酮含量和生长速率。用快速灵敏的高效液相法，测得离体培养细胞物干重总黄酮的含量分别为a细胞系3.9％，b细胞系2.8％，c细胞系1.2％。
表1.水母雪莲细胞红色系与黄色系、白色系组织特征的比较
(4)选取总黄酮含量高的红色细胞系(a系)进行筛选从固体培养转到液体培养，再从液体转入到固体培养，如此不断地反复筛选、继代15次最后得到生长迅速为40-45干重/升/月、总黄酮的含量为10.9％的较高产细胞系。
实施例2
本实施例是在实施例1的基础上，取实施例1中高产的红色细胞系(a系)作60coγ-射线照射诱变。采用5～30gy的60co-γ射线照射处理，照射速率0.8gy/min，诱变愈伤组织的半致死剂量为20gy。诱变的细胞系再用小细胞团筛选法，可参考《植物细胞组织培养》第二版，刘庆昌等主编，中国农业大学出版社，2010.01.第308页13.3细胞系的筛选)获得总黄酮的含量为10.9％较高产量的细胞系。
a细胞系液体状态下细胞聚集体的筛选：将上述高产量的红色细胞系(a)在悬浮培养条件下(不含琼脂的改良后的培养基)培养，将细胞聚集体通过一系列不同尺寸(1,2,3,4,5,and6mm)的不锈钢筛子，称量不同部分细胞聚集体干重(wi)。不同部分聚集体所占百分比(frequency)＝各部分细胞干重(wi)/总细胞干重(σwi)×100％。如图1所示为细胞培养分别在第9、9、12天时，细胞聚集体体积大小的分布。从不同聚集体体积大小中筛选得到聚集体体积为1-2mm的细胞系，其黄酮含量最高可达12％左右，生长速率可达细胞干重的45g-50g/l/月，测量结果如图2所示，并将该细胞系命名为a-1系，并保藏。
细胞系的筛选用目视法一般情况是在固体培养条件下进行，但结合悬浮培养把细胞愈伤组织分散开比较容易看出不同颜色的细胞。此方法为本发明筛选高产细胞系的方法。
其中，本发明中采用的细胞生长测定采用如下方法：
取上述三种不同颜色的细胞系，即红色系(a-1)，黄色系(b)，白色系(c)继代悬浮培养的细胞，于含30ml液体培养基的100ml的接种瓶中进行细胞生长速率及黄酮含量的测定。培养周期为12d。以每瓶细胞的鲜重或干重表示培养过程中的生长变化。计算：细胞增长量＝收获量/瓶-接种量/瓶；细胞增长率＝细胞增长量×100/接种量。所有数据为3次重复，每次5瓶，共计15瓶的标准误差值。
其中，培养物中总黄酮的测定，即快速灵敏的高效液相法，采用如下步骤：
1.称取50mg烘干后的雪莲培养物，在研钵中充分研磨。
2.将研磨后的雪莲培养物粉末放入一个干净的1.5ml离心管中，加入1ml70％的乙醇。
3.50℃水浴，浸泡24h,取滤液进行测定。
4.以芦丁为标准品，用高效液相色谱仪测定一系列浓度(0、30、60、90、150μg/ml)标准芦丁溶液，根据峰面积制作标准曲线，芦丁浓度在0-90μg/ml范围内呈良好的线性关系，标准曲线为：c＝28.242a-24.079(其中，c表示芦丁浓度，单位：μg/ml；a为峰面积)，相关系数r＝0.9981。雪莲中总黄酮类物质的hplc分析采用dionexhplc系统，色谱柱为ods-80tsqac18column(4.6×250mm，i.d.5μm)，信号采集为pda100紫外检测器；流动相采用a相＝甲酸：水(0.2：99.8，v/v)；b相＝乙腈；流速：0.8ml/min；梯度洗脱条件：0min,7％b；30min,19％b；40min，25％b；60min，27％b；70min，35％b；80min，40％b；and90min，7％b；进样量：10μl；柱温：35℃；检测波长：280nm，全波长扫描范围：200-800nm。
测定的结果如表2所示。
表2.水母雪莲细胞红色系(a-1)与黄色系、白色系中总黄酮含量
其中本发明中，所用的改良后的ms培养基的配方如下：
大量元素：nh4no31200mg/l，kno31200mg/l，cacl2·2h2o300mg/l，mgso4·7h2o370mg/l，kh2po4300mg/l；
微量元素：h3bo36.2mg/l，mnso4·4h2o22.3mg/l，znso4·7h2o10mg/l，na2mno4·2h2o0.25mg/l，cuso4·5h2o0.025mg/l，cocl2·6h2o0.025mg/l，feso4·7h2o22mg/l，na2-edta·2h2o30mg/l；
有机成分：肌醇100mg/l，烟酸0.5mg/l，盐酸吡哆醇(维生素b6)0.5mg/l，盐酸硫胺素(维生素b1)0.5mg/l，甘氨酸2mg/l，蔗糖30g/l，琼脂7g/l，ph为5.8。