本发明涉及一种24孔培养板高通量细胞悬浮培养方法，属于生物工程技术领域。
背景技术：
在生物药物的上游研究阶段，尤其在细胞株筛选早期，常需要进行大量高通量筛选工作，包括细胞株筛选、培养基组分筛选和工艺参数优化等，此过程是一个耗时耗力的工作，高通量筛选可以从源头确保获得产量高、质量优的细胞株，减轻下游研究工作，加快项目的研究速度，提升研究质量。
目前，早期细胞株筛选一般在孔板中静止培养，静止培养无法真实反映出后期摇瓶悬浮培养的实际状态，所以这种方法无法准确评估细胞的生长状况及表达情况，且获得样品量少，难以进一步进行质量分析。摇瓶/摇管培养方法虽然可以真实反映出后期细胞生长的真实状况，但操作繁琐，成本高，对摇床等硬件设施要求高，且因为通量低，不适合早期细胞株的高通量筛选。
如中国专利文献cn104404082a(申请号201410662495.4)公开了一种高效的外源蛋白表达细胞株的筛选方法。包括下列步骤：目的蛋白表达载体转染宿主细胞；筛选药物加压，稳定细胞池形成；稳定细胞池细胞接种于半固体培养基中；将细胞克隆从半固体培养基中挑至96孔细胞板中，继续培养4-5天，检测细胞上清中目的蛋白表达量；将表达量排名前50名的细胞扩至24孔板继续培养5天；将24孔板中细胞进一步扩至6孔板中继续培养5天；将6孔板中细胞扩至摇瓶中培养，检测评估不同细胞克隆在悬浮状态下的目的蛋白表达量；将根据摇瓶评估结果，将表达量排名前10名的细胞进行稳定性传代试验；根据细胞株表达目的蛋白的水平及持续表达蛋白的稳定性确立候选细胞株。该技术方案即采用静止培养完成高通量筛选过程，然后对筛选后的少量目标株再采用摇瓶培养筛选。
目前，高通量研究设备包括多联微型反应器，其通量仍相对较低，且仪器耗材等造价昂贵。因此，建立一种通量高、成本低、易操作的高通量细胞悬浮培养方法，就变得非常必要。
技术实现要素：
本发明针对现有技术存在的不足，提供一种高通量细胞悬浮培养方法。本发明利用常用的24孔普通培养板作为材料，通过一系列培养条件的研究、优化，最终建立一种高效的高通量细胞悬浮培养方法，目前已用于多个项目细胞株筛选和培养基优化，取得良好效果。
本发明的技术方案如下：
本发明的目的之一是提供一种24孔培养板高通量细胞悬浮培养方法，技术方案如下：
一种高通量细胞悬浮培养方法，采用24孔培养板作为培养材料，细胞接种密度为0.2～0.5×106细胞/ml，培养体积为0.6～1.2ml，采用摇床转速为115～200rpm进行摇床培养。
根据本发明优选的，所述培养体积为0.8～1.0ml，更优选为1.0ml。
根据本发明优选的，所述细胞接种密度为0.3×106细胞/ml。
根据本发明优选的，所述摇床转速为150rpm。
根据本发明，上述技术方案可以在通常的培养条件下培养，比如培养温度设定为36～37℃，相对湿度75％～95％，co2浓度5％(v/v)。
根据本发明优选的，所述的24孔培养板每孔容积为3.4ml。
在细胞培养过程中，接种密度对细胞生长有影响，适宜的接种密度，可以促使细胞增殖，接种密度太低或太高都不利于细胞的生长增殖。不同培养容器，如96孔板、48孔板等，其最适接种密度不同，接种密度不同会导致不同研究结果。本发明采用24孔板作为培养材料，细胞接种密度设定在0.2～0.5×106细胞/ml，可以体现出不同接种密度之间的差异，用于评估不同接种密度对产品产量和质量的影响。
目前细胞生长及产量质量的评估方法多采用补料批培养方式进行，如果培养体积较大，随着培养周期的延长(12～18天)，培养体积增加，会增加培养孔之间交叉污染的机率，后期会出现细胞聚集活力下降情况，掩盖了细胞的真实生长情况；而较小体积的培养，会因湿度的控制等问题引起培养基的挥发，造成培养基营养物质浓度的改变，进而影响了细胞的正常生长。因此，较大或较小培养体积会引入大量不确定性因素，影响细胞生长及产量质量情况评估的真实性。本发明采用24孔板作为培养材料，培养体积设定为0.6～1.2ml，不仅不会出现交叉污染现象，而且在本发明摇床转速下可以较好的悬浮，使细胞的生长和细胞活力都可以维持在较高水平。
摇床转速的不同，会影响细胞与培养基内营养物质及外界气体的交换速率，进而影响了细胞的代谢，表现为细胞数及细胞活力的差异。摇床转速过低，细胞不能较好的悬浮，不利于细胞生长，而摇床转速过高，会使普通培养板中的细胞培养液溢出，引起交叉污染。本发明摇床转速设定为115～200rpm，可以适应不同细胞株的培养要求。
温度、湿度、co2浓度等都是影响细胞生长的因素，采用现有技术中通用的方法即可，一般培养温度设定为36～37℃，co2既是细胞的代谢产物，又是维持培养液的ph有关，一般需要把细胞置于95％空气加5％co2的混合气体环境中。细胞培养也需要维持一定的湿度，湿度太低会导致细胞培养液的蒸发，使渗透压发生变化，影响细胞的生长。本发明所用的24孔培养板培养体积相对较小，培养基的挥发对细胞生长影响巨大，所以一般设定相对湿度在75％～95％，以维持细胞的正常生长。
有益效果
本发明首次采用普通24孔板进行震荡培养达到早期的细胞株高通量筛选，不仅解决了生物药物早期研发阶段高通量筛选的问题，而且与采用24孔深孔板的方法相比，由于大幅降低了培养基的使用量，在不影响筛选效果的前提下大幅降低了研发成本，并为后续大规模细胞培养时节约更多的培养基，加快了克隆筛选的过程，缩短了研发周期，可以加快药物的开发速度。
附图说明
图1：相同接种密度和摇床转速条件下，不同培养体积下细胞的生长曲线对比图；
图2：相同接种密度和摇床转速条件下，不同培养体积下细胞活力对比图；
图3：相同接种密度和摇床转速条件下，不同培养体积下细胞表达量对比图；
图4：相同培养体积和摇床转速条件下，不同接种密度下细胞生长曲线对比图；
图5：相同接种密度和培养体积条件下，不同摇床转速下细胞生长曲线对比图；
图6：b1细胞株在本发明培养条件下和摇瓶培养条件下生长曲线对比图；
图7：b2细胞株在本发明培养条件下和摇瓶培养条件下生长曲线对比图；
图8：b3细胞株在本发明培养条件下和摇瓶培养条件下生长曲线对比图；
图9：b4细胞株在本发明培养条件下和摇瓶培养条件下生长曲线对比图；
图10：b5细胞株在本发明培养条件下和摇瓶培养条件下生长曲线对比图；
图11：b6细胞株在本发明培养条件下和摇瓶培养条件下生长曲线对比图；
图12：b7细胞株在本发明培养条件下和摇瓶培养条件下生长曲线对比图；
图13：b8细胞株在本发明培养条件下和摇瓶培养条件下生长曲线对比图；
图14：b9细胞株在本发明培养条件下和摇瓶培养条件下生长曲线对比图；
图15：b10细胞株在本发明培养条件下和摇瓶培养条件下生长曲线对比图；
图16：b11细胞株在本发明培养条件下和摇瓶培养条件下生长曲线对比图；
图17：b12细胞株在本发明培养条件下和摇瓶培养条件下生长曲线对比图；
图18：本发明培养条件和摇瓶培养条件下不同细胞株活细胞数线下面积(ivcd)图；
图19：本发明培养条件和摇瓶培养条件下不同细胞株表达量对比图。
具体实施方式
下面通过具体的制备实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本发明实施例中所用的培养基成分、培养板、细胞株等均可以市购获得。
24孔培养板：costar3524，购自corning公司，每孔容积为3.4ml。
infors摇床：购自伊孚森生物技术(中国)有限公司，型号为multitronpro。
clonpix2、cloneselectimage：购自moleculardevices公司。
clonematrix、clonedetect和reagentxl：购自moleculardevices公司。
cho-s细胞：购自lifetechnology公司。
所用基础培养基是xh001，为自主配制，所述xh001培养基的具体组成为：4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)5g/l，葡萄糖8g/l，丙酮酸钠0.2g/l，氯化钠3g/l，氯化钾0.4g/l，亚硒酸钠0.000005g/l，硫酸锰0.05g/l，乙醇胺10μg/l，柠檬酸铁5mg/l，硫酸锌0.1g/l，硫酸铜0.02g/l，谷胱甘肽0.05g/l，氯化镁0.1g/l，磷酸二氢钠0.2g/l，碳酸氢钠2.1g/l，丙氨酸0.015g/l，天冬酰胺0.035g/l，精氨酸0.25g/l，天冬氨酸0.2g/l，胱氨酸0.41g/l，半胱氨酸0.11g/l，谷氨酸0.08g/l，甘氨酸0.01g/l，组氨酸0.15g/l，异亮氨酸0.25g/l，亮氨酸0.25g/l，赖氨酸0.2g/l，甲硫氨酸0.11g/l，苯丙氨酸0.065g/l，脯氨酸0.045g/l，丝氨酸0.2g/l，苏氨酸0.15g/l，色氨酸0.02g/l，酪氨酸0.2g/l，缬氨酸0.33g/l，生物素0.006mg/l，泛酸钙0.0023g/l，氯化胆碱0.061g/l，叶酸0.003g/l，肌醇0.015g/l，烟酰胺0.003g/l，维生素b60.0023g/l，维生素b20.0002-0.0006g/l，维生素b10.002-0.006g/l，维生素b120.000009g/l，亚油酸0.001g/l，嵌段式聚醚f-68(pluronicf-68)1.02g/l。
实施例1：影响本发明高通量细胞悬浮培养主要因素的筛选
在保持温度36.5℃、相对湿度80％，co2浓度5％(v/v)的条件下，将24孔培养板固定在保湿盒中，在周围加固浸满水的脱脂棉或海绵，以保证保湿盒湿度环境的稳定，并每2～3天更换一次，以防止细菌、霉菌等微生物的生长。以cho空白细胞作为细胞株，对影响细胞生长的关键参数如接种密度、培养体积、摇床转速进行筛选。每组试验设置两个平行研究组，参数水平设置如表1：
表1影响因素及水平设计
(1)培养体积研究
以0.3×106细胞/ml细胞密度将cho细胞接种到24孔培养板中悬浮培养，培养体积分别为0.6ml，0.8ml，1.0ml，1.2ml，1.5ml，保持培养温度为36.5℃，湿度为80％，co2浓度为5％，摇床转速为115rpm，每2～3天利用台盼蓝染色法对活细胞进行染色计数，绘制细胞生长曲线图(图1)，细胞活力对比图(图2)，细胞表达量对比图(图3)。
固定接种密度(0.3×106细胞/ml)和摇床转速(115rpm)前提下，对细胞生长情况进行评估。图1的结果表明，24孔培养板细胞在第七天密度达到最高，约为12×106细胞/ml，反映了细胞的正常生长规律。1.5ml培养体积实验组细胞生长缓慢，峰值细胞密度仅为3×106细胞/ml，且细胞形态较差，发明人根据经验推测当前转速条件下，过大体积培养使细胞无法悬浮起来，从而影响了细胞对营养物质的利用，造成了细胞生长缓慢的现象。
图2的结果表明，在24孔培养板培养，细胞活力都维持在较高位，无明显差异。
图3的结果表明，细胞的产量与细胞密度的高低直接成正相关，同时也与培养体积成线性关系。其中，摇瓶中细胞产量最高，达到1.1g/l(第九天)左右；其次是培养体积为0.6～1.2ml实验组，第九天表达量约为800mg/l；最后是培养体积为1.5ml，由于细胞密度过低，其产量也最低，约为300mg/l。
根据细胞的生长情况，结合以上实验结果，本发明24孔培养板悬浮培养方法的培养体积为0.6～1.2ml。
(2)接种密度研究
固定培养体积(1ml)和摇床转速(115rpm)，分别以0.2×106细胞/ml，0.3×106细胞/ml，0.4×106细胞/ml，0.5×106细胞/ml细胞密度将cho细胞接种于24孔培养板中，保持培养温度为36.5℃，湿度为80％，co2浓度为5％，每2～3天利用台盼蓝染色法对活细胞进行染色计数，绘制细胞生长曲线图，结果如图4所示。
图4的结果表明，不同接种密度条件下，细胞生长曲线趋势基本一致，但随着接种密度的不同，其细胞数略有差异。其中，0.5×106细胞/ml细胞密度条件下细胞密度峰值最高，随着接种密度的降低，其细胞密度峰值依次下降，0.2×106细胞/ml细胞接种密度组活细胞数相对最少。
且从图4可以看出，不同接种密度条件下，细胞的生长曲线可以体现出不同接种密度间的差异，因此，本发明24孔培养板悬浮培养方法的接种密度为0.2～0.5×106细胞/ml。
(3)摇床转速研究：
固定细胞接种密度(0.5×106细胞/ml)的前提下，以培养基体积为0.6ml、0.8ml、1.0ml三组分别设定摇床转速为115rpm、150rpm和250rpm，保持24孔培养板的培养温度为36.5℃，湿度为80％，co2浓度为5％，每2～3天利用台盼蓝染色法对活细胞进行染色计数，绘制细胞生长曲线，结果如图5所示。
图5的结果表明，不同摇床转速条件下细胞的生长趋势基本一致，不同培养体积实验组的细胞生长无明显差异。因此，24孔培养板悬浮培养方法的摇床转速设置为115～200rpm。
实施例2：利用本发明进行重组抗vegfr2抗体细胞株筛选
(1)抗vegfr2抗体重组质粒的构建
由基因合成公司直接合成抗体全序列(参考文献：wo03075840a2，whodruginformationvol23,no.3,2009)，根据lifetechnology公司freedomcho-skit试剂盒说明书，将重链、轻链基因克隆至表达质粒pcho1.0中，经过测序验证正确后，利用质粒中提试剂盒nucleobondxtramidi(购自macherey-nagel公司，货号：740410.50)抽提质粒，利用denovixds-11微量紫外核酸检测仪进行定量，-80℃储存备用。
重组质粒具体构建过程如下：合成抗vegfr2单抗重链和轻链dna序列，5’和3’端分别含有ecorv/paci和avrii/bstz171酶切位点。利用限制性内切酶ecorv/paci双酶切抗vegfr2单抗重链基因序列，进行回收。将重链基因克隆至经限制性内切酶ecorv/paci双酶切的真核表达载体pcho1.0上，构建含重链重组质粒，记为pcho1.0-h。利用限制性内切酶avrii/bstz171双酶切抗vegfr2单抗轻链基因序列，进行回收，再克隆至经限制性内切酶avrii/bstz171双酶切的真核表达载体pcho1.0-h上，构建含重链、轻链重组质粒，记为pcho1.0-h-l。对构建的重组质粒进行测序验证，测序正确后进行中提、定量，备用。
(2)细胞复苏及摇瓶培养：
向xh001培养基中加入anti-clumpingagent(体积比0.1～1％)，l-glutamine(0.8～8mm)，并在37℃条件下预热约30min；将本发明cho-s细胞从液氮中取出，迅速放入37℃水浴快速解冻，并于超净台中加入到事先37℃预热好的xh001培养基中，countstar细胞计数仪进行计数，接种密度控制在0.5～1.0×106细胞/ml，于37℃，85％湿度，5％co2，110～150rpm摇床中进行摇瓶培养；
(3)细胞转染
转染前24小时，对细胞进行接种，接种密度为：0.5～0.6×106细胞/ml，培养条件为37℃，5％co2，110～150rpm悬浮培养。转染前由培养箱中取出细胞，1000rpm，离心3min，收集细胞，弃上清，用37℃预热的xh001培养基制备密度为1×107细胞/ml的细胞悬液。取800μl细胞悬液至1.5ml离心管中，将40μg质粒加到800μl细胞悬液中，充分混合，将质粒-细胞混合物加到电转杯中。在电转仪上设置输出电压值，电击次数1次，时间17ms，电击杯4mm，启动电击。
(4)细胞株加压筛选
电击48小时后，在t75瓶中对细胞库施加筛选压力，mtx浓度为10～100nm，期间每隔4-5天计数，并对细胞更换含相同mtx浓度的xh001培养基，细胞库在一周后活力降到最低20％，经过一周的低活力阶段，细胞恢复，第一阶段加压筛选细胞库恢复共计20天。取恢复的第一阶段加压筛选的细胞库计数，将细胞库按照3×105细胞/ml的密度接种125ml摇瓶中，接种体积20ml，进行批培养研究，第8天取样检测表达量。
细胞库适应第一阶段加压筛选后，将细胞库在125ml摇瓶中进一步将筛选压力mtx浓度提高至0.5～1μm，每4-5天计数，并对细胞更换含相同mtx浓度的xh001培养基，细胞库在一周后活力降到最低。经过一周的低活力阶段，细胞恢复，第二阶段加压筛选细胞库恢复共计20天。取第二阶段加压筛选恢复的细胞库计数，将细胞库按照0.3×106细胞/ml的密度接种摇瓶，接种体积20ml，进行批培养研究，第8天取样检测表达量。
(5)单克隆细胞株筛选
对上述加压获得细胞库进行单克隆筛选，具体流程如下：将加压细胞株培养2-3天，待细胞密度达到2-3×106细胞/ml时，在6孔板按照500细胞/ml接种2mlclonemedia半固体培养基，按照表2体系配制100ml半固体细胞液：
表2半固体培养基体系
接种细胞后6孔板放在培养箱静止培养4～5天后再观察，10～15天后利用clonepix2设备进行单克隆细胞株挑选。将接种好的六孔板放到clonepix2中筛选单克隆，同时将含有100μl新鲜培养基的96孔板放入clonepix2，根据荧光强度对六孔板中单克隆细胞进行分类，挑选荧光强度高的单克隆到96孔板中培养，筛选数量在2000～3000个细胞。
从clonepix2筛选出的细胞放入培养箱培养，每3～5天细胞换液，待细胞长满，期间采用csi扫描细胞生长情况。待细胞长满后，取上清通过octet检测表达量，筛选500株细胞扩培到24孔板中，每3～5天细胞换液(50％-90％换液)，放入摇床90rpm培养，待细胞长满后接种进行筛选。从24孔板筛选出的细胞株待细胞长满后扩培到6孔板，每3～5天细胞换液，待细胞长满后扩培到摇瓶中进行培养。最终获得12株单克隆细胞株，对其进行编号，编号为b1、b2、…b12。
(6)单克隆细胞株24孔板筛选
将以上编号为b1、b2、…b12的12株细胞接种125ml摇瓶，接种密度为0.5×106细胞/ml，所用培养基为xh001，培养体积为20ml，摇床转速为115rpm，进行培养试验，设定培养温度为36.5℃，湿度为80％，co2浓度为5％。然后，从摇瓶中取2ml培养液，然后分别以1ml/孔接种2个24孔板培养孔，培养体积为1.0ml，于相同转速、温度、湿度、co2浓度条件下进行培养实验。每2～3天利用台盼蓝染色法对活细胞进行染色计数，绘制细胞生长曲线，结果如图6～17所示。
从图6～17可以看出，不同细胞株在24孔培养板中的细胞生长趋势与摇瓶结果表现一致，细胞数低于摇瓶条件。
通过计算活细胞数线下面积(ivcd)发现，不同细胞株间的ivcd值与摇瓶条件趋势表现一致，且不同亚克隆间的细胞生长差异显著，表明24孔培养板法灵敏性和精确性与摇瓶研究基本一致(结果如图18所示)。
24孔培养板的细胞表达量与摇瓶条件趋势基本一致，不同细胞株间的产量差异可明显表现(结果如图19所示)，进一步证明了该方法的灵敏性及精确性。
以上可以看出，利用本发明建立的24孔培养板细胞悬浮培养方法，可成功用于细胞及培养基组分等的筛选，不仅准确率与灵敏性与摇瓶基本一致，并且每孔只需0.6～1.2ml，极大降低了成本，取得了很好的技术效果。