本发明属于生物医药技术领域。具体涉及一种新颖的医用免疫吸附剂，特别是适用于血液灌流清除患者体内类风湿因子的免疫吸附剂及其制备方法。
技术背景：
作为一种临床最常见的慢性全身炎症自身免疫性疾病，类风湿关节炎(rheumatoidarthritis，ra)是以关节滑膜炎为主要临床特征，它可以导致关节损坏和畸形，从而引起关节功能障碍甚至残废。在我国类风湿关节炎患者高达数百万，并且发病率为0.32％～0.38％。研究表明，患者血液中的类风湿因子(rheumatoidfactors，rfs)是主要的致病物质，主要包括rf-igm、rf-igg和rf-iga型，其中rf-igm和rf-igg约占80％。rfs是患者体内的最为特征的自身抗体，其水平的高低与患者关节炎的严重程度大致相符，可作为患者关节炎严重程度的诊断指标，因此如何最大限度的将rfs从患者体内清除，是临床面临的重大难题。针对这种情况，开发出一种能够有效清除患者体内rfs的血液净化装置，从而有效缓解ra患者的症状，将具有重大的社会价值和经济效应。
近年来，采用免疫吸附剂利用血液灌流的方式对ra患者体内rfs进行清除，已经被证明是一种行之有效的方法。目前，用于免疫吸附法治疗类风湿关节炎的免疫吸附剂主要采用两种功能性配基：生物型大分子和小分子化合物配基。生物型大分子配基吸附剂包括以蛋白a配基，分别以硅胶和琼脂糖为载体的prosorba和immusorba吸附剂，以及国内同类产品(cn1367181a)、热聚igg吸附剂、戊二醛交联igg吸附剂等。其中，蛋白a吸附剂由于存在制备工艺复杂、价格昂贵、治疗中需进行血浆分离处理等缺点，治疗费用较高，限制了其在临床上的应用；热聚igg吸附剂、戊二醛交联igg吸附剂由于高昂的配基生产成本，且存在灌流过程中配基脱落的安全隐患以及吸附能力较差等问题也给实际应用带来了障碍。小分子化合物配基吸附剂包括以日本asahi医疗公司开发的分别以疏水性的色氨酸和苯丙氨酸为配基的im-tr、im-ph吸附剂，以及中国同类专利(cn103611504a)、1-胺基-3-(2-(4-吡啶基))-乙基巯基为配基的吸附剂(cn103933947a)等。其中，采用疏水氨基酸为配基的吸附剂，主要是采用疏水作用力和静电作用力来清除毒素，特异性吸附比较差，在清除毒素的同时，也同样会清除患者血液中的总蛋白、纤维蛋白原等；1-胺基-3-(2-(4-吡啶基))-乙基巯基为配基的吸附剂是基于igm的分子结构特征，通过计算机分子对接，筛选出针对igm型抗体具有较强结合能力的配基，但是该类吸附剂只对rf-igm具有特异性的清除效果，对于rf-igg和rf-iga的清除效果较差。因此，急需开发一种具有高选择性和高吸附容量，制备工艺简单、价格低廉，具有良好血液相容性的类风湿因子免疫吸附剂，使其用于全血或者血浆灌流治疗类风湿关节炎。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术上的不足，提供一种新型的可用于血液灌流清除血液或血浆中类风湿因子的免疫吸附剂及其制备方法。本发明所述免疫吸附剂制备简单，成本低，具有较好的吸附选择性和较高的吸附容量、良好的机械强度和血液相容性。
为实现上述目的，本发明采取如下措施：
本发明提供的用于全血或血浆灌流去除类风湿因子的免疫吸附剂是一种由载体、配基和手臂三部分组成的免疫吸附剂，是以具有良好的机械强度、血液相容性、稳定的化学性质以及对疏水性毒素具有较好的吸附效果的氯甲基化大孔结构的聚苯乙烯-二乙烯苯微球作为载体，并通过载体微球上优化设计的适宜的大孔结构，提高吸附性能；并针对rf-igm、rf-igg和rf-iga的分子结构及其抗原表位，通过计算机分子对接模拟筛选出对它们均有特异性结合的、通过静电和疏水双重作用来捕获类风湿因子的小分子多肽作为配基，以具有良好的生物相容性，可以有效的克服配基与生物大分子-类风湿因子之间的空间位阻效应的氨基化的聚乙二醇作为手臂，使小分子多肽的羧基与聚乙二醇的氨基脱水缩合形成肽键而制成的高特异性和高选择性，同时又可以避免非特异性吸附的免疫吸附剂。
本发明的技术方案
血液(全血或血浆)灌流用类风湿因子的免疫吸附剂，该免疫吸附剂是由载体和配基，以及连接载体和配基的手臂三部分组成；所述载体为氯甲基化大孔结构的聚苯乙烯-二乙烯苯树脂(ps-cl)，所述的手臂为不同分子量的具有良好生物相容性的氨基功能化的聚乙二醇，所述配基为由6-14个氨基酸组成的小分子多肽，所述免疫吸附剂中小分子多肽的羧基与聚乙二醇的氨基脱水缩合形成肽键，而制成的一种新型的类风湿因子免疫吸附剂。所述吸附剂中，氯甲基化含量为3.2-5.8mmol/g，聚乙二醇接枝量为1.5-3.6mmol/g，小分子多肽固载量为0.9-2.3mmol/g。
所述的氯甲基化大孔结构的聚苯乙烯-二乙烯苯载体为球形，俗称氯球，粒度在300-800μm之间，优选400-600μm之间，比表面积在268-500m2/g之间，平均孔径在50-100nm之间。
所述的小分子多肽中的氨基酸组成包括可以提供静电作用的天冬氨酸(d)谷氨酸(e)中的至少一种，提供疏水作用的亮氨酸(l)、缬氨酸(v)和甲硫氨酸(m)中的至少一种，以及同时将提供静电作用的氨基酸和疏水作用氨基酸进行连接的不同长度的色氨酸(w)。所述的免疫吸附剂中的小分子多肽亲和配基包括：ddwwll、dewlwm、ddwllwv、ddwllwlm、eewllwdwv、ewdwlwvwmd、eewwddmmwwv、dewwwlvmwwwd、dwllwwwvvwwvm或ddwweewwllwwve等，优选ddwllwlm、eewwddmmwwv或ddwweewwllwwve，多肽分子上的羧基可通过手臂与载体共价键偶联，固载量优选1.2-2mmol/g。
所述的免疫吸附剂手臂为h2n-peg-nh2-400、h2n-peg-nh2-600、h2n-peg-nh2-800、h2n-peg-nh2-1000、h2n-peg-nh2-2000或h2n-peg-nh2-5000等，优选h2n-peg-nh2-600、h2n-peg-nh2-1000或h2n-peg-nh2-2000，接枝量优选2.5-3.5mmol/g。
本发明提供的血液灌流用去除类风湿因子的免疫吸附剂制备方法包括以下步骤：
第1步：氯甲基化大孔结构的聚苯乙烯-二乙烯苯载体微球的合成；
第1.1步、悬浮聚合制备大孔结构的聚苯乙烯-二乙烯苯树脂：将单体苯乙烯、交联剂二乙烯苯，由甲苯、煤油和辛烷的混合物构成的致孔剂混合均匀，加入适量的引发剂过氧化苯甲酰，搅拌使其溶解，待溶解后加入到含聚乙烯醇的水溶液中，调整搅拌速度至油滴均匀分散，升温引发聚合、固化；反应完毕后，停止加热和搅拌，反应体系经抽提、洗涤处理后，得大孔结构的聚苯乙烯-二乙烯苯树脂载体微球；
第1.2步、载体微球氯甲基化：
用已知的试剂和方法对载体微球进行氯甲基化，用乙醇及去离子水洗涤产物，并向洗涤液中加入agno3溶液后无沉淀产生，即得氯甲基化大孔结构的聚苯乙烯-二乙烯苯载体微球(ps-cl)；
第2步、接枝手臂；
将氯甲基化大孔结构的聚苯乙烯-二乙烯苯载体微球加入到甲苯中使其过夜溶胀后，加入h2n-peg-nh2，其中将氯甲基化大孔结构的聚苯乙烯-二乙烯苯载体微球的重量、甲苯的体积和h2n-peg-nh2的体积之比为0.1-0.2g:1-3ml:1-5ml，再加入10-30ml，0.1m的naoh溶液，封口，于60-80℃下振荡反应4-8h，抽滤，依次用乙醇、去离子水充分清洗，于4℃湿态保存，备用，得聚乙二醇化氯甲基树脂；
第3步、小分子多肽配基的偶联；
将edc·hcl、nhs和小分子多肽配基溶于水中，冰浴30min，加入聚乙二醇化氯甲基树脂，其中小分子多肽配基与聚乙二醇化氯甲基树脂的摩尔比为1.2-1.5:1，继续保持冰浴30min后，在35-50℃下反应8-12h，抽滤，用去离子水充分清洗，于4℃湿态保存，备用，得血液灌流用类风湿因子的免疫吸附剂(ps-peg-peptide)。
在上述制备方法中，具体的反应过程如下：
本发明第1.1步所述大孔结构的聚苯乙烯-二乙烯苯载体微球合成的具体操作为：
将单体苯乙烯与交联剂二乙烯苯按重量比3.2-6.5：1混合均匀，再按质量比加入占单体和交联剂总质量1.5-3.6倍的致孔剂，其中致孔剂由甲苯、煤油和辛烷按质量比为0.5-1:1:4-8混合而成，再按按质量比加入占反应单体和致孔剂总质量0.5％-2.5％的引发剂过氧化苯甲酰，搅拌使其混合均匀，称之为油相，然后将该体系溶液中加入含质量百分比为0.5％-3％的聚乙烯醇溶液的水相，其中油相与水相的质量比为1:1-5，调节搅拌速率，升温至50-60℃后，以5-10℃/10min升温至70-80℃，定型后在此温度下继续保持4-8h，再以1-2℃/5min的速度缓慢升温至92-95℃以上，反应8-12h，停止加热和搅拌，反应体系经抽提、洗涤处理后，即得大孔结构的聚苯乙烯-二乙烯苯载体微球。所述聚乙二醇接枝量优选2.5-3.5mmol/g，小分子多肽固载量优选1.2-2mmol/g。
本发明聚苯乙烯-二乙烯苯微球的氯甲基化是通过文献可知的方法和反应条件活化偶联，氯甲基活化后再接枝手臂并固载配基。
本发明提供的免疫吸附剂可用于血浆或全血灌流用于清除患者血液中的类风湿因子，用于治疗类风湿关节炎相关的疾病。
本发明的优点和有益效果
本发明根据类风湿因子的分子结构，以及其与吸附剂上配基的作用方式，设计合成了以氯甲基化大孔结构的聚苯乙烯-二乙烯苯树脂为载体，以小分子多肽(6-14个氨基酸组成)为配基，并以不同分子量的氨基功能化的聚乙二醇(h2n-peg-nh2)作为手臂与配基进行偶联的免疫吸附剂。该免疫吸附剂在保持对rfs特异性吸附的基础上，避免了大分子(抗原或抗体)配基免疫吸附剂的潜在免疫原性等相关副作用，且成本低，制作简单，不仅可以利用大孔苯乙烯骨架的疏水作用力和配基的特异性选择能力，而且通过手臂减少了载体表面活性位点相互间的空间位阻，增加了有效活性位点，从而极大提高了吸附剂对rfs的吸附能力。吸附实验表明，本发明所述的免疫吸附剂对血液中的rfs具有优良的吸附性能，具有高吸附选择性和特异性，为类风湿性关节炎的治疗提供一种新的途径，也是一种应用创新。
附图说明
图1免疫吸附剂对病人血清中中静态rf-igm、rf-igg、rf-iga和总蛋白的吸附测定。
图2免疫吸附剂对病人血清中rfs的动态吸附测定。其中，a：免疫吸附剂对血清中rf-igm的吸附动力学；b：免疫吸附剂对血清中rf-igg的吸附动力学；c：免疫吸附剂对血清中rf-iga的吸附动力学。
具体实施方式
实施例1
(1)氯甲基化大孔结构的聚苯乙烯-二乙烯苯载体微球的制备；
(1.1)大孔结构的聚苯乙烯-二乙烯苯微球的制备
将单体苯乙烯70g、交联剂二乙烯苯20g；致孔剂(甲苯29.5g、煤油37g和辛烷221.5g)以及引发剂过氧化苯甲酰(bpo)1.79g；加入到2000ml三口烧瓶中，搅拌使混合均匀，然后再加入456g，2.9％的聚乙烯醇水溶液，调节搅拌速度在120-160rpm/min，使体系分散成均匀的小油珠，升温至52℃，以5℃/10min升温至70℃，定型后在此温度下继续保持8h，再以1℃/5min的速度缓慢升温至92℃，反应12h，反应体系经过滤、洗涤后处理后，得到大孔结构的聚苯乙烯-二乙烯苯微球。粒度400-600μm,比表面积在459.3m2/g，平均孔径84.5nm。
(1.2)微球的氯甲基化
将干重的大孔结构的聚苯乙烯-二乙烯苯微球12g，加入到三口烧瓶中，并向其中加入氯甲醚75ml、dmso130ml，室温过夜反应后，加入干燥的催化剂6galcl3，在50℃下，搅拌反应8h后，停止反应，抽滤，依次用乙醇、去离子水冲洗，直至向滤液中加入agno3溶液后无沉淀产生，得氯甲基化大孔结构的聚苯乙烯-二乙烯苯微球，氯含量为5.3mmol/g。
(2)氯甲基化树脂接枝手臂
取步骤(1.2)制备的氯甲基化大孔结构的聚苯乙烯-二乙烯苯载体微球10g于三口烧瓶中，加入100ml甲苯过夜溶胀后，再加入40gh2n-peg-nh2-600、12.5ml0.1m的naoh溶液，封口，于65℃下振荡反应7.5h，抽滤，依次用乙醇、去离子水充分清洗，于4℃湿态保存，备用，得聚乙二醇化氯甲基树脂(ps-ch2-peg-nh2)，接枝量为1.9mmol/g。
(3)小分子多肽配基的偶联
将0.345gedc·hcl、0.518gnhs和小分子多肽配体5gddwllwlm溶于250ml，ph＝7.4的pbs溶液中，冰浴30min，加入步骤(2)制备的聚乙二醇化氯甲基树脂10g，继续保持冰浴30min后，在35℃下反应11h，抽滤，用去离子水充分清洗，于4℃湿态保存，备用，编号为ps-peg-peptide-1。
实施例2
(1)氯甲基化大孔结构的聚苯乙烯-二乙烯苯载体微球的制备
(1.1)大孔结构的聚苯乙烯-二乙烯苯微球的制备
将单体苯乙烯83.3g、交联剂二乙烯苯16.7g；致孔剂(甲苯29.6g、煤油32.0g和辛烷138.4g)以及引发剂过氧化苯甲酰(bpo)7g；加入到2000ml三口烧瓶中，搅拌使混合均匀,然后再加入840g，1.4％聚乙烯醇水溶液，调节搅拌速度在120-160rpm/min，使体系分散成均匀的小油珠，升温至52℃后，以7℃/10min升温至75℃，定型后在此温度下继续保持6h，再以2℃/5min的速度缓慢升温至94℃，反应9.5h，反应体系经过滤、洗涤后处理后，得到大孔结构的聚苯乙烯-二乙烯苯微球。粒度400-600μm,比表面积在548.9m2/g，平均孔径78.2nm。
(1.2)微球的氯甲基化：将干重的大孔结构的聚苯乙烯-二乙烯苯微球12g，加入到三口烧瓶中，并向其中加入氯甲醚60ml、dmso120ml，过夜后，置于超声中，并加入干燥的催化剂alcl36g，在50℃下，搅拌反应8h后，停止反应，抽滤，依次用乙醇、去离子水冲洗，直至向滤液中加入agno3溶液后无沉淀产生，得氯甲基化大孔结构的聚苯乙烯-二乙烯苯微球，氯含量为4.8mmol/g。
(2)吸附剂载体接枝手臂
取步骤(1.2)制备的氯甲基化大孔结构的聚苯乙烯-二乙烯苯载体微球10g于三口烧瓶中，加入100ml甲苯过夜溶胀后，再加入80gh2n-peg-nh2-1000、20ml0.1m的naoh溶液，封口，于70℃下振荡反应6h，抽滤，依次用乙醇、去离子水充分清洗，于4℃湿态保存，备用，得聚乙二醇化氯甲基树脂(ps-ch2-peg-nh2)，接枝量为1.79mmol/g。
(3)多肽配基的偶联
将0.437gedc·hcl、0.656gnhs和多肽配体31.5geewwddmmwwv溶于250ml,ph＝7.4的pbs溶液中，冰浴30min，加入步骤(2)制备的聚乙二醇化氯甲基树脂10g，继续保持冰浴30min后，在45℃下反应9h，抽滤，用去离子水充分清洗，于4℃湿态保存，备用，编号为ps-peg-peptide-2。
实施例3
(1)氯甲基化的大孔结构的聚苯乙烯-二乙烯苯载体微球的制备
(1.1)大孔结构的聚苯乙烯-二乙烯苯微球的制备
载体微球的合成：将单体苯乙烯120g、交联剂二乙烯苯20g；致孔剂甲苯41.8g、煤油52.3g和辛烷365.9g以及引发剂过氧化苯甲酰(bpo)9g；加入到2000ml三口烧瓶中，搅拌使混合均匀，然后再加入600g，2.5％聚乙烯醇水溶液，调节搅拌速度在120-160rpm/min，使体系分散成均匀的小油珠,升温至58℃后，以10℃/10min升温至80℃，定型后在此温度下继续保持4h，再以2℃/5min的速度缓慢升温至95℃，反应8h，反应体系经过滤、洗涤后处理后，得到大孔结构的聚苯乙烯-二乙烯苯微球。粒度400-600μm,比表面积在461.8m2/g，平均孔径80.6nm。
(1.2)微球的氯甲基化：将干重的大孔结构的聚苯乙烯-二乙烯苯微球12g，加入到三口烧瓶中，并向其中加入氯甲醚85ml、dmso150ml，过夜后，置于超声中，并加入干燥的催化剂alcl36g，在50℃下，搅拌反应8h后，停止反应，抽滤，依次用乙醇、去离子水冲洗，直至向滤液中加入agno3溶液后无沉淀产生，即得氯甲基化的聚苯乙烯-二乙烯苯微球，氯含量为4.4mmol/g。
(2)载体接枝手臂
取步骤(1.2)制备的氯甲基化大孔结构的聚苯乙烯-二乙烯苯载体微球10g于三口烧瓶中，加入100ml甲苯过夜溶胀后，加入120gh2n-peg-nh2-2000，25ml,0.1m的naoh，78℃下振荡反应5h，抽滤，依次用乙醇、去离子水充分清洗，于4℃湿态保存，备用,得聚乙二醇化氯甲基树脂(ps-ch2-peg-nh2)，接枝量最终为1.65mmol/g。
(3)多肽配基的偶联
将0.474gedc·hcl、0.569gnhs和多肽配体77.3gddwweewwllwwve溶于250ml,ph＝7.4的pbs溶液中，冰浴30min，加入步骤(2)制备的聚乙二醇化氯甲基树脂10g，继续保持冰浴30min后，在50℃下反应8h，抽滤，用去离子水充分清洗，于4℃湿态保存，备用，编号为ps-peg-peptide-3。实施例4
吸附剂对血清中rf-igm、rf-igg、rf-iga的静态吸附试验
分别取实施例1、2、3中免疫吸附剂ps-peg-peptide-1、ps-peg-peptide-2、ps-peg-peptide-3各0.5ml于离心管中，加入5ml类风湿关节炎患者的血清样品(样品中rf-igm浓度约为892.2iu/mg，样品中rf-igg浓度约为791.5iu/mg，样品中rf-iga浓度约为457.3iu/mg)，封口膜密封，于空气摇床中，37℃震荡吸附2h。吸附完成后，1000rpm/min离心1min，离心，取上层液于测定其浓度，吸附结果见附图1。
实施例5
吸附剂对血清中总蛋白的测定
分别取实施例1、2、3中免疫吸附剂ps-peg-peptide-1、ps-peg-peptide-2、ps-peg-peptide-3各0.5ml于离心管中，加入5ml类风湿关节炎患者(样品中总蛋白浓度约为65.24mg/l)，封口膜密封，于空气摇床中，37℃震荡吸附2h。吸附完成后，1000rpm/min离心1min，离心，取上层液于测定其浓度，吸附结果见附图1。
实施例6
吸附剂对血清中rf-igm、rf-igg和rf-iga微球蛋白的动态吸附试验
分别取实施例1、2、3中免疫吸附剂ps-peg-peptide-1、ps-peg-peptide-2、ps-peg-peptide-3各2ml于吸附柱中，连接透析患者的血清样品(样品中rf-igm浓度约为892.2iu/mg，样品中rf-igg浓度约为791.5iu/mg，样品中rf-iga浓度约为457.3iu/mg))和恒流泵，灌流速度1.0ml/min，灌流时间为180min，分别在10min、30min、60min、90min、120min、150min和180min中取上层血清样品测定其浓度。
动态吸附性见附图2。
实施例7
免疫吸附剂与全血作用实验
分别取实施例1、2、3中免疫吸附剂ps-peg-peptide-1、ps-peg-peptide-2、ps-peg-peptide-3各10ml，以健康大耳白兔为动物模型进行模拟体外血液灌流试验，灌流时间为120min，分别取灌流前后的全血加入到含有edta-k2抗凝采血管，3000rpm/min离心5min，用全自动血球计数仪测定血常规各项参数，结果见表1：
表1：全血灌流对细胞血常规的影响
从表中可知：吸附剂与全血作用后，血液各组分无显著改变，均在0-15％之间，其中血小板数有少许减少说明材料对血小板有少量的黏附，但变化在国家标准范围之内，符合国家生物材料医用使用标准，可用于全血灌流。