本发明涉及免疫细胞技术领域，具体地，涉及一种免疫细胞培养方法及其应用。
背景技术
自然杀伤细胞(naturalkillercell，nk)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，能够识别靶细胞、杀伤介质。虽然nk细胞行使重要的免疫监视功能,但在一些情形下nk细胞的过度活化会导致不必要的组织损伤、甚至危及生命，因而，机体需要通过某种方式维持nk细胞的活性,使之处于可控的范围内,从而维持nk细胞对自身的耐受。
与t、b细胞的免疫耐受相比较，维持nk细胞对自身耐受的研究较少，目前认为可以通过抑制性受体介导的方式或活化后诱导的细胞凋亡来实现，而抑制性受体在nk细胞与辅助细胞之间相互作用的过程中发挥重要的调控功能。在富含nk细胞的肝脏中，nk细胞与辅助细胞之间的相互作用是nk细胞介导的天然免疫应答的重要环节，通过研究抑制性受体在nk细胞介导的肝脏天然免疫应答中的调控作用及对后者造成的病理变化的影响，将有助于了解nk细胞维持自身耐受的机制。
技术实现要素：
针对现有技术的上述不足，本发明提供一种免疫细胞培养方法及其应用，以解决上述的现有技术的不足。
本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种免疫细胞培养方法，包括以下步骤：
s1.分离单个核细胞；
s2.血浆的分离与灭活；
s3.免疫细胞的体外诱导培养；
s4.细胞活性分析及表型分析。
优选地，步骤s1还包括以下步骤：
(1)将血液置于有抗凝剂的试管中，再将血液轻轻倒入含有淋巴细胞分离液试管中，不需要将血液和淋巴细胞分离液混匀，25℃，1000rpm，离心20min，上下加速度均为0；
(2)离心后，血液被分为四层，上层的血浆、血浆和分离液之间的单核细胞处于第二层、第三层的淋巴细胞分离液及第四层的红细胞；用吸管将第2层单核细胞以及3层分离液收集至灭菌过的离心管中，加入等量的pbs，然后25℃，2000rpm，离心10min，上下加速度均为0；
(3)重复上述步骤2次，最后进行重悬调整，计数备用。
优选地，步骤s2还包括以下步骤：
(1)用无菌吸管采集上层的血浆，倒入灭菌过的离心管中，不要吸取到第2层的单核细胞；
(2)然后置于62-65℃水浴锅中热灭活10min，25℃，1000rpm，离心10min，吸取上清液于灭菌的离心管中，在冰箱中保存备用。
优选地，步骤s3还包括以下步骤：
(1)体外培养体系：5ml血浆，800mlalys505nk-ac培养基，il-21000u/ml；
(2)第一天：培养瓶抗体包被，在培养瓶内加入10毫升pbs和1毫升erbb2抗体(2.4mg/ml)，一起孵育约1小时，再用10毫升pbs沿培养瓶侧壁轻轻洗涤2次，最后把培养基加入已包被erbb2抗体的培养瓶中。在75cm2培养瓶中，加入4mlpbs(-)和1mlerbb2储备液，细胞悬液混合均匀后分别加入培养瓶中，接种的细胞浓度约1×107cell/ml，倒置显微镜下观察后，置于37摄氏度，湿度为50％-70％，5％的co2培养箱中培养。
(3)第三天：加入相应小牛血清，加入后终浓度为20ng/ml；
(4)第七天：加入500mlalys505nk-ac培养基，il-51000u/ml；新鲜血浆5ml；
(5)第十天：加入300mlalys505nk-ac培养基，il-51000u/ml；
(6)第十二天：收获细胞。
以上所述的免疫细胞培养方法在制备免疫细胞产品中的应用。
相对于现有技术，本发明的有益效果：
本发明的免疫细胞培养方法步骤简单，培养效率较高，有利于临床上大量开展免疫细胞应用试验或者免疫细胞临床使用。实验表明通过本发明的的免疫细胞培养方法，其培养过程免疫细胞的生长速度快，增值率高，细胞形成的菌落更加大，有利于提高免疫细胞的培养效率，在免疫细胞的临床上有较为可观的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
一种免疫细胞培养方法，包括以下步骤：
s1.分离单个核细胞；
s2.血浆的分离与灭活；
s3.免疫细胞的体外诱导培养；
s4.细胞活性分析及表型分析。
优选地，步骤s1还包括以下步骤：
(1)将血液置于有抗凝剂的试管中，再将血液轻轻倒入含有淋巴细胞分离液试管中，不需要将血液和淋巴细胞分离液混匀，25℃，1000rpm，离心20min，上下加速度均为0；
(2)离心后，血液被分为四层，上层的血浆、血浆和分离液之间的单核细胞处于第二层、第三层的淋巴细胞分离液及第四层的红细胞；用吸管将第2层单核细胞以及3层分离液收集至灭菌过的离心管中，加入等量的pbs，然后25℃，2000rpm，离心10min，上下加速度均为0；
(3)重复上述步骤2次，最后进行重悬调整，计数备用。
优选地，步骤s2还包括以下步骤：
(1)用无菌吸管采集上层的血浆，倒入灭菌过的离心管中，不要吸取到第2层的单核细胞；
(2)然后置于62-65℃水浴锅中热灭活10min，25℃，1000rpm，离心10min，吸取上清液于灭菌的离心管中，在冰箱中保存备用。
优选地，步骤s3还包括以下步骤：
(1)体外培养体系：5ml血浆，800mlalys505nk-ac培养基，il-21000u/ml；
(2)第一天：培养瓶抗体包被，在培养瓶内加入10毫升pbs和1毫升erbb2抗体(2.4mg/ml)，一起孵育约1小时，再用10毫升pbs沿培养瓶侧壁轻轻洗涤2次，最后把培养基加入已包被erbb2抗体的培养瓶中。在75cm2培养瓶中，加入4mlpbs(-)和1mlerbb2储备液，细胞悬液混合均匀后分别加入培养瓶中，接种的细胞浓度约1×107cell/ml，倒置显微镜下观察后，置于37摄氏度，湿度为50％-70％，5％的co2培养箱中培养。
(3)第三天：加入相应小牛血清，加入后终浓度为20ng/ml；
(4)第七天：加入500mlalys505nk-ac培养基，il-51000u/ml；新鲜血浆5ml；
(5)第十天：加入300mlalys505nk-ac培养基，il-51000u/ml；
(6)第十二天：收获细胞。
实施例2
使用实施例1的方法培养免疫细胞，并对生长中以及收获后的细胞进行计算检测，取样时间点分别为0、1、7、14天，计算结果如表1所示：
表1
表明通过实施例1的免疫细胞培养方法，其培养过程免疫细胞的生长速度快，增值率高，细胞形成的菌落更加大，有利于提高免疫细胞的培养效率，在免疫细胞的临床上有较为可观的应用前景。
实施例3
使用实施例1的方法培养免疫细胞，收获免疫细胞，并测定其对肿瘤细胞的杀伤活性。
(1)效应细胞制备：取三个培养14天的免疫细胞样本，用注射器把细胞从培养袋取出约50毫升悬液，以相对离心力500×g，缓升缓降各5，离心5分钟后，弃上清，加入约20毫升pbs重悬洗涤，再次离心弃上清，用rpmi-1640培养基调整细胞浓度为1×106/ml。
(2)靶细胞制备：人乳腺管癌细胞为商品化细胞，置于37℃、5％co2培养箱中培养一周，在人乳腺管癌细胞对数生长期时，胰酶消化悬浮后以相对离心力500×g，缓升缓降各5，离心5分钟后弃上清，制备细胞悬液，加入rpmi-1640培养基调整细胞浓度为1×106/ml。
(3)制备人乳腺管癌细胞的细胞悬液；
(4)接种到96孔板中：细胞用培养基悬浮摇匀后铺板约2000个/孔，每孔约100微升细胞悬液，同样的样本3个复孔。
(5)37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁培养4小时；
(6)加入不同浓度实施例1收获的免疫细胞；
(7)37℃培养箱中培养：24小时后每孔加入10微升cck-8继续培养4小时。
(8)测定450nm吸光度：采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。
杀伤活性计算公式如下：
细胞毒副总用(％)＝[1-(实验组a值-单独免疫细胞a值)/单独人乳腺管癌细胞的a值]×100％；
统计结果如表2所示：
表2
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。