一种特异识别己烯雌酚的核酸适配体的制作方法

本发明属于生物检测技术领域，尤其是涉及一种特异识别己烯雌酚的核酸适配体。

背景技术：

己烯雌酚作为与食品安全风险密切相关的一种环境激素，具有类似雌性激素的作用，即使数量极少，也可能导致动物和人体行为异常、生殖能力下降、性早熟等疾病。由于己烯雌酚能够促进动物生长、增加廋肉率，常被非法用于动物的饲养而引起药物在动物内脏、肌肉、甚至蛋、奶中的残留，引发食品安全隐患。

己烯雌酚的测定方法主要有高效液相色谱-串联质谱法、高效液相色谱法和酶联免疫法等。前两种方法具有高的灵敏度和准确性，但需要昂贵的精密仪器和训练有素的专业技术人员，检测成本较高，适合大型实验室的确证检测；酶联免疫法操作简单，适合大量样品检测的快速筛查，但是生物抗体制备过程繁琐耗时、成本昂贵。

核酸适配体是通过指数富集的配体进化技术（systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，selex）得到的一组能与靶分子如蛋白质、有机物或金属离子等高亲和、高特异性结合的寡核苷酸序列（dna或rna）。核酸适配体的筛选在体外完成筛选，不依赖动物或细胞，得到的序列可通过聚合酶链反应（pcr）技术大量合成；同时适配体化学稳定性好，易于修饰。因此，核酸适配体常被研究者用于药物残留、真菌毒素等领域的便携、低成本检测技术的开发。

技术实现要素：

本发明的目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供一种特异识别己烯雌酚的核酸适配体。

为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：

一种特异识别己烯雌酚的核酸适配体，所述特异识别己烯雌酚的核酸适配体包括核苷酸序列为：gaaggatggatgctttggtgtgtagtatgagcgagcgttgcga的核酸适配体。

为了取得进一步的技术效果，本发明还可以采用以下进一步的技术方案：

优选地，核苷酸序列为：

gaaggatggatgctttggtgtgtagtatgagcgagcgttgcga的核酸适配体的两端可以用修饰材料进行修饰，修饰材料包括氨基、生物素、纳米物质或荧光物质。

本发明提供一种特异识别己烯雌酚的核酸适配体，具有如下有益效果：

（1）本发明通过指数富集的配体系统进化技术，利用磁珠法进行己烯雌酚结合筛选，然后经pcr扩增结合的核苷酸序列经过多轮富集筛选，获得了高亲和力且特异识别己烯雌酚的核酸适配体；

（2）本发明所提供的核酸适配体可由商业公司合成获得，可以进行人工合成和标记，成本较低；

（3）本发明所提供的核酸适配体能够与己烯雌酚特异性结合，可以建立食品或环境中己烯雌酚的快速检测方法，应用前景广阔。

附图说明

图1为本发明所提供的特异识别己烯雌酚的核酸适配体的空间结构预测图；

图2为本发明所提供的特异识别己烯雌酚的核酸适配体的特异性试验结果图。

具体实施方式

参照附图和具体实施例对本发明作进一步详细地描述。

实施例1：借助链霉亲和素磁珠的己烯雌酚适配体指数富集筛选

1、随机核酸文库及引物（由生工生物合成（上海）股份有限公司完成），核苷酸序列如下：

随机核酸文库：5’-acggactgagctcgagtct-(n40)-agattgaccgacggatgcg-3’

其中，n40代表40个随机核苷酸。

上游引物p1：5’-acggactgagctcgagtct-3’

下游引物p2：5’-cgcatccgtcggtcaatct-3’

5’生物素化下游引物biotin-p2：5’-biotin-cgcatccgtcggtcaatct-3’

2、pcr扩增条件及单链次库的制备条件

以随机核酸文库做为模板，进行非对称pcr扩增，具体如下：

（1）pcr反应体系为：

模板23μl，上游引物2μl，下游引物1μl，dntp（各2.5mm）4μl，10×pcr扩增缓冲溶液5μl，taqdna聚合酶0.25μl，加超纯水至50μl。

（2）pcr反应条件为：

95℃预变性5min，95℃变性45s，51℃退火30s，72℃延伸20s，20个循环；最后72℃延伸5min。

3、筛选过程

（1）将人工合成的寡核苷酸混合物（1.6nmolbiotin-p2，0.4nmol随机核酸文库，250μl结合缓冲液）加入至50μl链霉亲和素磁珠中，摇床上缓慢混合30min；将离心管置于磁力架上1～2min后，吸弃上清液；

（2）在离心管中加入200μl洗脱缓冲液重悬磁珠，置磁力架上1~2min，吸弃上清液；

（3）加100μl结合缓冲液于离心管中，然后加200μm靶物质（己烯雌酚）至寡核苷酸混合物和磁珠的溶液中，摇床上缓慢孵育60min；将离心管置于磁力架上2min后，吸取上清液；

（4）当进行到第8轮时进行反筛选，在加入靶物质之前，先加入其它反筛选物质（双烯雌酚、双酚a、17β-雌二醇，浓度2μm），摇床上缓慢孵育30min，吸弃上清液，然后进行步骤（3）的操作；

（5）收集洗脱液，以洗脱液为模板进行非对称pcr扩增，pcr反应体系及条件同2中pcr反应体系和反应条件，将pcr扩增产物纯化并单链化处理，得到单链次库，投入至下一轮筛选，直到得到第十轮筛选的单链次库，也即是得到核酸适配体。

（6）将第10轮筛选得到寡核苷酸适配体送至上海生工生物技术公司测序。对测序获得的寡核苷酸适配体用rnastructure5.3软件进行二级结构分析，选出结构稳定的序列为代表，并对代表序列截短优化，图1所示为代表序列的截短序列：gaaggatggatgctttggtgtgtagtatgagcgagcgttgcga的二级结构模拟图，由上海生工合成以做进一步特异性分析。

4、特异性分析

根据上述3中得到的筛选结果，对核酸适配体进行特异性分析。在加有100μl结合缓冲液的离心管中，加0.02μm靶物质（己烯雌酚）或其他环境激素（双烯雌酚、双酚a、17β-雌二醇）至寡核苷酸混合物（核酸适配体浓度为2μm）和磁珠的溶液中，摇床上缓慢孵育60min；将离心管置于磁力架上2min后，吸取上清液，通过超微量核酸测定仪测定上清液中核酸的量，并计算洗脱率（洗脱率=上清中核酸的量/体系中加入的核酸总量*100%）。洗脱率越高表明因与己烯雌酚结合而被洗脱的适配体越多。特异性试验结果如图2所示，结果显示己烯雌酚核酸适配体结合己烯雌酚的能力远远强于其他三种环境激素，可以特异性识别己烯雌酚。

上述具体实施方式用来解释说明本发明，仅为本发明的优选实施例，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改、等同替换、改进等，都落入本发明的保护范围。

技术特征：

技术总结
本发明属于生物检测技术领域，尤其是涉及一种特异识别己烯雌酚的核酸适配体。本发明通过指数富集的配体系统进化技术，利用磁珠法进行己烯雌酚结合筛选，然后经PCR扩增结合的核苷酸序列经过多轮富集筛选，获得了高亲和力且特异识别己烯雌酚的核酸适配体；本发明所提供的核酸适配体可由商业公司合成获得，可以进行人工合成和标记，成本较低；本发明所提供的核酸适配体能够与己烯雌酚特异性结合，可以建立食品或环境中己烯雌酚的快速检测方法，应用前景广阔。

技术研发人员：张慧;姜侃;陈小珍;张东雷
受保护的技术使用者：浙江省产品质量安全检测研究院
技术研发日：2018.05.23
技术公布日：2018.11.06