一种双酶放大汞离子生物传感器的构建的制作方法

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种双酶放大汞离子生物传感器的构建。

背景技术：

外切酶ⅲ(exonucleaseⅲ,exoⅲ)是作用于双链dna的核酸外切酶,对单链dna无活性；它无需切割位点序列的识别，只需底物是平末端或者3’凹陷末端就会被exoⅲ沿3’到5’方向逐个催化去除单核苷酸；同时还可以作用于双链dna切割产生单链gap；3’突出末端抗exoⅲ活性，其拮抗程度随3’突出末端的长度的不同而不同，当突出等于4bp或者更长时，突出可以完全阻碍其活性；同时exoⅲ也有rnaseh、3’磷酸酶和脱嘌呤/嘧啶-核酸内切酶活性。

末端脱氧核苷酸转移酶(terminaldeoxynucleotidyltransferase,tdt)是一种不需要模板的聚合酶，能在核酸序列的3’-oh端直接进行延伸，根据体系中加入的脱氧核苷三磷酸腺苷(deoxyribonucleosidetriphosphatesdntp)的比例，生成随机核酸序列。由于tdt产生的dna序列很大程度上是取决于底物dntp库的组成，所以合理优化三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(dgtp)和三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸(datp)的浓度可以使得生成的序列为富g序列，在合适的条件下形成具有类过氧化物酶活性的g四连体。

汞离子(hg²⁺)是一种分布广泛的重金属，主要以有机汞和无机汞两类形式存在于环境中，其进入环境后很难降解，可通过生物富集作用在动物或人体内积累，对人体健康具有极大的危害，并且食品中汞中毒事件常有发生。生活饮用水卫生标准gb5749-2006中规定汞离子限量值为1mg/l。传统的hg²⁺检测方法主要包括原子吸收光谱法(aas)、原子荧光光谱法(afs)等，这些检测方法灵敏、检出限低，而且一般需要大型仪器设备、检测周期长、费用高、需要专业的操作人员。所以建立一种廉价、快速、灵敏、特异性的汞离子的检测方法是非常有必要的。

技术实现要素：

本发明提供了一种双酶放大汞离子生物传感器的构建。本发明生物传感器的构建，根据汞离子与胸腺嘧啶之间可以形成配位键，使得核酸双链之间形成稳定的平末端，激活外切酶ⅲ(exoⅲ)的活性，切割平末端的3’端，使得核酸链的3’-oh端暴露；而末端脱氧核糖转移酶(tdt)在3’-oh端暴露，无模板的情况下就可以进行链的延伸，通过控制核酸体系中脱氧核糖的配比就可以产生大量的富g序列，富g序列在tmb存在的情况下显色，完成对hg²⁺的比色定量检测。本发明同时还提供了一种hg²⁺检测方法，所述方法是一种基于双酶放大的比色传感新方法，用于hg²⁺的超灵敏检测。本发明所述方法至少解决了目前急需建立一种廉价、快速、灵敏、特异性强的汞离子的检测新方法的需求。

本发明的一个目的是提供一种hg²⁺检测传感器，包括一种含发卡结构的核酸序列，所述含发卡结构的核酸序列的3’和5’端各包括一段含多个t碱基的序列，在hg²⁺存在的条件下可以形成3’平末端；所述传感器还包括：底物是平末端且可沿3’到5’方向催化去除核苷酸的外切酶；不需要模板、能在核酸序列的3’-oh端直接进行链延伸的聚合酶。

具体的，所述含多个t碱基的序列包括含4个以上t碱基的序列。

具体的，所述传感器还包括下述1)-8)中的至少一种：

1)所述含发卡结构的核酸序列的3’端修饰有阻碍所述聚合酶延伸的基团；

2)所述聚合酶的产物，所述产物包括g-四链体；

3)氯高铁血红素；

4)g-四链体-氯高铁血红素类过氧化物酶的底物，所述底物包括经g-四链体-氯高铁血红素类过氧化物酶催化后，可产生吸收光信号；

5)所述外切酶为exoⅲ；

6)所述聚合酶为tdt酶；

7)所述含发卡结构的核酸序列包括：序列表中seqid№：1所示核苷酸序列；或将序列表中seqid№：1所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且在hg²⁺存在的条件下可以形成3’平末端的核苷酸序列；

8)与g-四链体结合产生荧光信号的物质。

具体的，所述传感器还包括下述1)-4)中的至少一种：

1)当所述传感器包括exoⅲ时，还包括exoⅲ的缓冲液；

2)当所述传感器包括tdt酶时，还包括tdt酶的缓冲液、cocl2、dgtp和/或datp；

3)当所述传感器包括g-四链体-氯高铁血红素类过氧化物酶的底物时，所述底物为tmb和h2o2；

4)当所述含发卡结构的核酸序列的3’端修饰有阻碍所述聚合酶延伸的基团时，所述基团为氨基。

本发明的另一个目的是提供一种hg²⁺检测方法，所述方法包括使用本发明任一所述传感器进行hg²⁺检测。

具体的，所述方法还包括：

以所述含发卡结构的核酸序列为模板，根据所述外切酶，构建外切酶反应的反应体系和反应条件，所构建的外切酶反应的反应体系中包括待测物样品；进行所述外切酶反应；

根据所述聚合酶，构建聚合酶反应的反应体系和反应条件，所构建的聚合酶的反应体系中包括外切酶反应产物或外切酶反应完成后的反应体系，且所述聚合酶的反应体系中包括dgtp，并使得聚合酶反应的产物包括g-四链体；进行所述聚合酶反应；

利用所述g-四链体获得能产生吸收光信号或荧光信号的物质；检测所述能产生吸收光信号或荧光信号的物质的吸光度或荧光值。

具体的，所述方法还包括下述1)-5)中的至少一种：

1)所构建的外切酶的反应体系还包括：序列表中seqid№：1所示核苷酸序列、exoⅲ、exoⅲ的缓冲液、ddh2o；

2)所构建的外切酶的反应条件包括：30℃，10min；然后85℃，10min失活；

3)所构建的聚合酶的反应体系还包括：tdt酶、tdt酶的缓冲液、datp、cocl2、ddh2o；具体的，所构建的聚合酶的反应体系中，datp和dgtp的摩尔比为1:1以下；具体的，datp和dgtp的摩尔比为1:4-1:1；再具体的，datp和dgtp的摩尔比为2:3；

4)所构建的聚合酶的反应条件包括：37℃反应20min以上，85℃10min失活；具体的，37℃反应20min-1h；再具体的，37℃反应30min；

5)利用所述g-四链体获得能产生吸收光信号的物质包括：先将所述g-四链体和氯高铁血红素制备成g-四链体-氯高铁血红素类过氧化物酶；再利用g-四链体-氯高铁血红素类过氧化物酶获得能产生吸收光信号的物质。

具体的，利用所述g-四链体获得能产生吸收光信号的物质包括：将所述g-四链体、氯高铁血红素、缓冲液于37℃恒温金属浴30min，加入tmb、h2o2后，37℃温浴5min，再加入h2so4终止反应；再具体的，所述缓冲液的组成为：10mmol/ltris、120mmol/lnacl、10mmol/lmgcl2·6h2o、10mmol/lkcl,ph8.4，溶剂为水。

本发明的还一个目的是提供一种含发卡结构的核酸序列的应用，所述含发卡结构的核酸序列包括所述含发卡结构的核酸序列的3’和5’端各包括一段含多个t碱基序列，在hg²⁺存在的条件下可以形成3’平末端，所述应用包括下述1)-4)中的至少一种：

1)用于检测hg²⁺；

2)用于制备用于检测hg²⁺的产品和/或相关产品；

3)用于制备权利要求1、2、和/或3任一所述传感器；

4)在权利要求4、5、和/或6任一所述方法中的应用。

具体的，所述含多个t碱基的序列包括含4个以上t碱基的序列。

具体的，所述所述含发卡结构的核酸序列包括：序列表中seqid№：1所示核苷酸序列；或将序列表中seqid№：1所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且在hg²⁺存在的条件下可以形成3’平末端的核苷酸序列。

本发明的再一个目的是提供本发明任一所述传感器的应用，所述应用包括下述1)-2)中的至少一种：

1)用于检测hg²⁺；

2)用于制备用于检测hg²⁺的产品和/或相关产品。

本发明的最后一个目的是提供本发明任一所述方法的应用，所述应用包括用于检测hg²⁺。

本发明的有益效果包括：

本发明提供的一种hg²⁺定量检测传感器及方法，是一种新的检测产品和方法，该产品和方法丰富了现有检测技术或方法，为新的检测产品或方法的研发提供了一个新的平台和思路。

本发明通过现有的两种酶和基于功能核酸原理，开发出了一种新的、具易于修饰、成本低、结构稳定、特异性强等优点的用于检测hg²⁺的功能核酸生物传感器。

在一个具体的实施方式中，由于实验设计包括exoⅲ和tdt的双重放大作用，所以可以对痕量的hg²⁺检测也获得较好的检测效果。

在一个具体的实施方式中，本发明建立的基于双酶放大的用于hg²⁺的超灵敏比色定量检测传感器及新方法的检出限为0.2nmol/l，灵敏度高。

在一个具体的实施方式中，本发明建立的基于双酶放大的用于hg²⁺的超灵敏比色定量检测传感器及新方法的特异性高。

在一个具体的实施方式中，本发明建立的基于双酶放大的用于hg²⁺的超灵敏比色定量检测传感器及新方法的加标回收率在98.75％-103％，准确度高。

附图说明

图1为验证实验的凝胶电泳结果图，其中，泳道1-4依次分别表示分子量标记、对照组一、实验组、对照组二的实验结果。

图2为琼脂糖凝胶电泳结果图，其中，泳道1-4依次分别表示分子量标记、对照组、实验组一至实验组六的实验结果。

图3为脱氧核糖的比例优化实验结果图，其中，泳道1-6依次分别表示分子量标记、对照组、实验组一至实验组四的实验结果；a-e分别依次代表对照组、实验组一至实验组四的比色实验结果。

图4为灵敏度实验结果图。

图5为特异性实验结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。具体的，外切酶ⅲ(exonucleaseiii，exoⅲ)、exoⅲ缓冲液、末端脱氧核苷酸转移酶(tdt)、tdt缓冲液均购自美国neb公司

实施例1、基于双酶放大的用于hg²⁺的超灵敏比色定量检测传感器及新方法的建立

(一)含发卡结构的模板序列的设计

本实施例所设计出的含发卡结构的模板的核苷酸序列如表1所示。表1所示hairpin2序列通过人工合成获得。

表1

表1中的hairpin2序列是将序列表中seqid№：1所示核苷酸序列的3’端修饰了氨基。

本实施例表1所示含发卡结构的模板序列是根据下述方法设计出来的：

根据hg²⁺与t碱基之间能都够形成稳定的双螺结构，设计含发卡结构的模板序列，使其自然情况下序列自身的3’和5’端富t碱基不能互补配对，exoⅲ的活性受到抑制；同时序列的3’端修饰氨基，在模板与tdt酶单独存在时也不能激活tdt酶活性进行延伸。只有在hg²⁺存在的条件下才可以使模板形成3’平末端，激发exoⅲ活性，催化模板的3’端碱基发生切割，使其羟基暴露，进而激活tdt酶的活性进行延伸。人为控制tdt酶反应体系中的脱氧核苷酸碱基组成，使得延伸的产物具有类过氧化物酶活性的富g序列。根据g四链体与hemin结合形成具有类过氧化物模拟酶的特点，催化h2o2和tmb显色。

根据上述方法设计出的表1所示的含发卡结构的模板序列，通过本实施例下述实验过程的验证，可成功用于构建基于双酶放大的用于hg²⁺的超灵敏比色定量检测的新方法，因此，可用于基于双酶放大的用于hg²⁺的超灵敏比色定量检测的含发卡结构的模板序列需要具备下述特征：

所述含发卡结构的模板序列的3’和5’端各包括一段富t碱基序列，在hg²⁺存在的条件下才可以使模板形成3’平末端，且所述含发卡结构的模板序列的3’端修饰氨基。

(二)用于hg²⁺的超灵敏比色定量检测的exoⅲ反应体系、反应条件

本实施例建立的用于hg²⁺的超灵敏比色定量检测的exoⅲ反应体系如表2所示。

表2

本实施例建立的用于hg²⁺的超灵敏比色定量检测的exoⅲ切割反应条件为：30℃10min，然后85℃，10min失活。

(三)验证实验

验证实验的反应体系分为3组，对照组一、对照组二和实验组。

对照组一的反应体系：只含终浓度为500nmol/l的表1所示的hairpin2，ddh2o补足至50μl；

对照组二的反应体系：终浓度为500nmol/l的表1所示的hairpin2、终浓度为2.5u/μl的exoⅲ，ddh2o补足至50μl；

实验组的反应体系：终浓度为500nmol/l的表1所示的hairpin2、终浓度为100nmol/l的hg²⁺、终浓度为2.5u/μl的exoⅲ，ddh2o补足至50μl；

按照上述建立的用于hg²⁺的超灵敏比色定量检测的exoⅲ切割反应条件进行exoⅲ切割反应。

完成切割反应后用20％的page进行验证，120v电压凝胶电泳约2小时，拍照系统：molecularimagergeldocxr(bio-rad)，实验结果如图1所示。

图1结果显示，只有代表实验组反应结果的泳道3中的条带模糊，说明hairpin2发生了降解，即只有实验组发生了exoⅲ切割反应；而对照组一(泳道2)和对照组二(泳道4)中的条带清晰，说明没有发生exoⅲ切割反应。

上述图1所示的对照组二即泳道4中的条带清晰的结果表明，在hg²⁺不存在的条件下，本实施例所设计的含发卡结构的模板序列hairpin2，没有形成3’平末端，exoⅲ的活性受到抑制，不能发生切割反应。

上述图1所示的实验组即泳道3中的条带模糊的结果表明，在hg²⁺存在的条件下，本实施例所设计的含发卡结构的模板序列hairpin2形成了3’平末端，激活了exoiii，发生了切割反应，hairpin2被降解；该实验结果还表明本实施例所建立的exoiii反应体系和反应条件可以成功应用于exoiii的切割反应。

(四)用于hg²⁺的超灵敏比色定量检测的tdt酶反应体系、反应条件

本实施例建立的用于hg²⁺的超灵敏比色定量检测的tdt酶反应体系如表3所示。

表3

本实施例建立的用于hg²⁺的超灵敏比色定量检测的tdt酶反应条件为：37℃反应30min，85℃10min失活。

(五)用于hg²⁺的超灵敏比色定量检测的比色反应体系、反应条件

本实施例建立的用于hg²⁺的超灵敏比色定量检测的比色反应体系和反应条件为：

80μl酶活提升缓冲液(酶活提升缓冲液的组成为：10mmol/ltris、120mmol/lnacl、10mmol/lmgcl2·6h2o、10mmol/lkcl,ph8.4，溶剂为水)，10mmol/l氯高铁血红素(hemin)10μl，按照上述(四)所述tdt酶反应体系和反应条件制备得到的含tdt酶反应产物的反应体系10μl，混匀放于37℃恒温金属浴30min，50μltmb显色液(含h2o2)加入后37℃温浴5min，再加入50μl2mol/l的h2so4终止反应。

(六)验证及优化实验

1、tdt酶反应条件中延伸时间的优化实验

实验分为7组，对照组、实验组一至实验组六，各组的反应体系和反应过程为：

对照组：终浓度为500nmol/l的表1所示的hairpin2，ddh2o补足至50μl；依次按照上述(二)中的exoⅲ切割反应条件、(四)中的tdt酶反应体系、反应条件进行反应；

实验组一至实验组六：依次按照上述(二)中的exoⅲ反应体系、切割反应条件、(四)中的tdt酶反应体系、反应条件进行反应，不同的是，将(二)中的exoⅲ反应体系中的待测样品替换为终浓度为100nmol/l的hg²⁺，，实验组一至实验组六的tdt酶反应条件将(四)中的tdt酶反应条件中的37℃时的反应时间分别依次调节为：5min、10min、20min、30min、40min、1h。

tdt酶反应完成后，使用2％溴化乙锭预染色的琼脂糖凝胶电泳验证各组的实验结果，电泳条件：130vfor25min，拍照系统：molecularimagergeldocxr(bio-rad)，结果如图2所示。

图2实验结果表明，tdt酶延伸30min即可获得较好的检出效果。

2、通过比色反应优化tdt酶反应体系中脱氧核糖的比例

由于tdt酶是不需要模板的延伸酶，所得产物可以根据体系中脱氧核苷酸碱基的不同来进行调节。为了获得更易形成g-四链体的富g序列，因此对腺嘌呤和鸟嘌呤的配比进行了优化。

实验分为5组，对照组、实验组一至实验组四，各组的反应体系和反应过程为：

对照组：终浓度为500nmol/l的表1所示的hairpin2，ddh2o补足至50μl；依次按照上述(二)中的exoⅲ切割反应条件、(四)中的tdt酶反应体系、反应条件进行反应；

实验组一至实验组四：依次按照上述(二)中的exoⅲ反应体系、切割反应条件、(四)中的tdt酶反应体系、反应条件进行反应，不同的是，将(二)中的exoⅲ反应体系中的待测样品替换为终浓度为100nmol/l的hg²⁺；实验组一至实验组四的tdt酶反应体系将(四)中的tdt酶反应体系中的datp的用量分别依次调节为：2、4、2、0mmol/l；dgtp的用量分别依次调节为：2、6、8、10mmol/l；即实验组一至实验组三中的datp：dgtp分别依次为1:1、2:3、1:4。

tdt酶反应完成后，使用2％溴化乙锭预染色的琼脂糖凝胶电泳验证各组的实验结果；同时按照(五)中的比色反应体系、反应条件进行显色反应。

电泳结果和显色结果如图3所示。

图3结果表明，当腺嘌呤与鸟嘌呤之间的配比为2:3时，能获得较长的产物(表现为泳道4中的条带的分子量较大)并且产物催化tmb显色效果较好(表现为c组中的颜色较其它组的均深),因此选择配比为2:3的脱氧核苷酸碱基配比作为tdt酶反应体系中的最优配比。

实施例2、基于双酶放大的用于hg²⁺的超灵敏比色定量检测的新方法的灵敏度实验

灵敏度实验配制了6组反应体系，每组依次按照上述(二)中的exoⅲ反应体系、切割反应条件、(四)中的tdt酶反应体系、反应条件进行反应，不同的是，将(二)中的exoⅲ反应体系中的待测样品替换为一系列已知浓度的hg²⁺溶液，本实施例具体选取的exoⅲ反应体系中的hg²⁺的终浓度分别依次为1.5nmol/l、5nmol/l、10nmol/l、20nmol/l、30nmol/l、45nmol/l。

tdt酶反应完成后，按照(五)中的比色反应体系、反应条件进行显色反应，显色反应完成后，通过分光光度计获得每组的吸光值。

以hg²⁺的浓度值为横坐标，以对应浓度检测获得的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，如图4所示，hg²⁺浓度在1.5nmol/l-45nmol/l范围内具有较好的线性范围，经计算，检出限为0.2nmol/l(3σ)，检出方程是：y＝0.0304x+0.126，r²＝0.9996。

灵敏度实验结果说明，实施例1具体建立的基于双酶放大的用于hg²⁺的超灵敏比色定量检测新方法的灵敏度高。

实施例3、基于双酶放大的用于hg²⁺的超灵敏比色定量检测的新方法的特异性实验

特异性实验配制了8组反应体系，每组依次按照上述(二)中的exoⅲ反应体系、切割反应条件、(四)中的tdt酶反应体系、反应条件进行反应，不同的是，将(二)中的exoⅲ反应体系中的待测样品替换为已知浓度的hg²⁺和含其它金属离子的溶液，本实施例具体选取的exoⅲ反应体系中金属离子及其终浓度分别依次为100nmol/l的hg²⁺、1μmol/l的pb²⁺、zn²⁺、mg²⁺、ag⁺、cr³⁺、cd²⁺、cu²⁺。

tdt酶反应完成后，按照(五)中的比色反应体系、反应条件进行显色反应，显色反应完成后，通过分光光度计获得每组的吸光值。

实验结果如图5所示，只有反应体系中含有hg²⁺的吸光值较高，而含其它金属离子的反应体系的吸光值均接近于零。图5所示结果表明，实施例1具体建立的基于双酶放大的用于hg²⁺的超灵敏比色定量检测新方法的特异性高。

实施例4、基于双酶放大的用于hg²⁺的超灵敏比色定量检测的新方法的准确度实验

通过自来水的加标回收检测实验验证方法的准确度。

利用本身无hg²⁺检出的自来水进行加标回收率的检测。加标回收检测实验配制了3组反应体系，每组依次按照上述(二)中的exoⅲ反应体系、切割反应条件、(四)中的tdt酶反应体系、反应条件进行反应，不同的是，将(二)中的exoⅲ反应体系中的待测样品分别依次替换为含5、10、40nmol/l的hg²⁺的自来水样品。

tdt酶反应完成后，按照(五)中的比色反应体系、反应条件进行显色反应，显色反应完成后，通过分光光度计获得每组的吸光值，然后通过检出方程：y＝0.0304x+0.126，r²＝0.9996计算出每组加标自来水样品中的hg²⁺的测量值，根据测量值再计算得出每组各自的回收率，测量值和回收率如表4所示。

表4

表4结果表明，实施例1具体建立的基于双酶放大的用于hg²⁺的超灵敏比色定量检测的新方法的加标回收率在98.75％-103％，准确度高。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>中国农业大学

<120>一种双酶放大汞离子生物传感器的构建

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>44

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ttttttcgcatgccagatgcgggatgggctggcatgcgtttttt44