本发明涉及化学分析检测技术领域，尤其涉及一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的串联质谱非衍生化检测试剂盒及其应用。
背景技术：
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g6pd)是一种存在于人体红血球内，协助葡萄糖进行新陈代谢的酶。
在该代谢过程中，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶能在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp)存在下将6-磷酸葡萄糖氧化成6-磷酸葡萄糖酸，同时产生还原型辅酶ii(nadph)，nadph能保护红血球免受氧化物质的威胁。
g6pd缺乏时，若身体接触到具氧化性的特定物质或服用了这类药物时，红血球就容易被破坏而发生急性溶血反应，其临床表现包括：(一)新生儿黄疸：近三分之一的新生黄疸症是由于g6pd缺乏；(二)急性溶血性贫血：当病患接触到具氧化性物质时，即刻发生溶血反应。
会造成溶血的具有氧化性物质的药品方面包括：(1)抗疟疾药物；(2)抗感染药物中的磺胺剂；(3)某些解热镇痛剂，如著名的阿斯匹灵类，某些过去用于控制尿道感染的药物。另外，一些化学品如樟脑丸(臭丸)、龙胆紫(紫药水)及甲基蓝也会造成溶血。食物方面，患儿食用蚕豆及其制品后，常会出现急性溶血性贫血的现象，所以g6pd缺乏症又俗称蚕豆症。
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症筛查是新生儿筛查中一项重要检查。检测g6pd活性的现有方法主要包括荧光法和分光光度法。
荧光法通过观察荧光的存在与否来判断结果，往往带有主观性并且在许多情况下不能检出g6pd的部分缺乏。
分光光度法是通过g6pd反应生成nadph，通过吩嗪二甲酯硫酸盐的递氢使硝基四氮唑兰还原成紫色的甲臌(formazan)，nadph生成量与甲臌生成量在一定范围内成线性，用分光光度法测定甲臌的量再换算成g6pd酶活性。由于分光光度法受基质和环境的影响较大，检测结果的准确性和稳定性存在一定的波动。
因此，急需一种检测通量高，灵敏度好，准确度高的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性检测方法。
技术实现要素：
本发明提供了一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的串联质谱非衍生化检测试剂盒，该试剂盒检测通量高，灵敏度好，准确度高，能大大提高工作效率，降低采血量。
本发明提供了如下技术方案：
一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的串联质谱非衍生化检测试剂盒，包括孵育液、稀释剂、酶淬灭剂和流动相；
所述的孵育液由水、缓冲盐、6-磷酸葡萄糖、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和表面活性剂组成；
所述的稀释剂由水、缓冲盐和表面活性剂组成；
所述的流动相包括有机相和水相；所述有机相为甲醇和/或乙腈，所述水相为甲酸铵和/或乙酸铵水溶液。
本发明的试剂盒可用于检测生物样本中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g6pd)的含量，在nadp存在的条件下，6-磷酸葡萄糖在生物样本中g6pd的作用下转化成6-磷酸葡萄糖酸，淬灭反应后通过串联质谱测定淬灭液中的6-磷酸葡萄糖酸含量，其中淬灭液中6-磷酸葡萄糖酸的含量与生物样本中的g6pd含量量相关。
优选的，所述的孵育液中，缓冲盐浓度为0.5～400mmol/l，6-磷酸葡萄糖浓度为1.0～50mmol/l，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸浓度为0.5～30mmol/l，表面活性剂的浓度为2～50g/l。
采用该配方的孵育液孵育样本时，均可获得理想的效果，g6pd的回收率和准确度能够达到美国疾病预防控制中心质控要求。
优选的，所述的稀释剂中，缓冲盐浓度为0.5～400mmol/l，表面活性剂的浓度为2～50g/l。
稀释剂中各组分的浓度与各组分在孵育液中的浓度相同，可用于稀释样本。
优选的，所述的酶淬灭剂为乙腈、甲醇、乙醇、高氯酸和三氯乙酸中的一种或多种；进一步优选的，所述的酶淬灭剂为乙腈、甲醇和乙醇中的一种或多种。
优选的，所述的水相中，甲酸铵和乙酸铵水溶液的浓度为2～50mmol/l；所述的水相的ph为9～11。
采用该流动相时，具有理想的检测效果，g6pd的回收率能够达到美国疾病预防控制中心质控要求，若水相的ph或甲酸铵和乙酸铵的浓度超出上述范围时，检测信号的强度会降低，准确度会下降，g6pd的回收率会下降或者升高。
优选的，所述的表面活性剂为皂素、聚山梨酯、泊洛沙姆、磷脂和十二烷基硫酸钠中的一种或多种。
优选的，所述的缓冲液为磷酸盐缓冲盐或tris缓冲盐。
为了使用的方便，本发明的检测试剂盒还包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的校准品；进一步优选的，所述的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的校准品采用冷冻干燥法或者冷冻离心法预包被在96孔孵育板上，该校准品的浓度为0.001～0.1u/ml。
为了使用的方便，本发明的检测试剂盒还包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的质控品；进一步优选的，所述的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的质控品采用冷冻干燥法或者冷冻离心法预包被在96孔孵育板上。
优选的，本发明的检测试剂盒还包括预包被有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶校准品和质控品的96孔孵育板、96孔检测板和96孔板封膜。
本发明还公开了上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的串联质谱非衍生化检测试剂盒在检测样本中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性中的应用。
所述的样本为体液，所述的体液为全血、血浆、血清、尿液或唾液。
所述的为新鲜采集的体液或由体液在滤纸上制成的干液斑。
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的串联质谱非衍生化检测试剂盒在检测样本中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性中的应用，包括以下步骤：
(1)分别在孔板孔中配置浓度为0～0.1u/ml的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标准液；
(2)将2.5μl体液加入孔板孔中，或用打孔器将体液干液斑样本打入孔板孔中；
(3)向所有标准品、质控品和样本孔中各加40μl稀释剂，再加50μl孵育液，贴膜覆盖后放入恒温孵育震荡器中，在37℃温度中震荡孵育30min；加入100μl酶淬灭剂，贴膜密封后震荡，在冷冻离心机上10分钟；
(4)揭去贴膜，每孔移出20μl上清液，顺序置入洁净的检测板中，每孔加水180μl，贴膜密封后震荡混匀供质谱检测，记录6-磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖酸的峰面积用于定量。
优选的，质谱检测条件为：进样10μl；采用串联质谱仪电喷雾负离子方式，采用esi离子源，离子源参数为：干燥气温度：325℃，干燥气流速：5l/min，雾化气压力：45psi，鞘气温度：350℃，鞘气流速：11l/min，毛细管电压：3000v(-)。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的试剂盒所依据的原理是在nadp存在的条件下，6-磷酸葡萄糖在生物样本中g6pd的作用下转化成6-磷酸葡萄糖酸，淬灭反应后通过串联质谱测定淬灭液中的6-磷酸葡萄糖酸含量，其中淬灭液中6-磷酸葡萄糖酸的含量与生物样本中的g6pd含量相关。
本发明串联质谱非衍生化法检测试剂盒检测通量高，灵敏度高，准确性好，能大大提高工作效率，降低采血量。
附图说明
图1为6-磷酸葡萄糖标准品和6-磷酸葡萄糖酸标准品离子对色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。
检测试剂盒组成如表1所示：
表1试剂盒组成
试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)校准样和质控品的制备：
取出孵育96孔板，将在校准样孔中和质控品孔中分别加入40μl水，复溶，备用。
将2.5μl全血加入96孔板中或用3.2mm打孔器将干血斑样本打入96孔孵育板中，加40μl稀释剂，备用。
(2)孵育
在96孔孵育板的各校准样孔、质控品孔和各样本孔中分别加入孵育液50μl，用贴膜密封孔板，在37℃孵育振荡器中100rpm震荡30分钟。
(3)淬灭
揭去密封膜，在各孔中分别加入酶淬灭剂100μl，用贴膜密封后震荡1min，在冷冻离心机上4℃3000rpm离心10分钟。
(4)样本上机检测
揭去密封膜。用移液器每孔移出100μl上清液，顺序置入洁净的96孔板。用贴膜密封96孔板，放入质谱自动进样器托盘，供质谱检测，进样10μl，采用串联质谱仪电喷雾负离子方式，质谱条件：esi离子源，负离子模式。离子源参数如下：干燥气温度：325℃，干燥气流速：5l/min，雾化气压力：45psi，鞘气温度：350℃，鞘气流速：11l/min，毛细管电压：3000v(-)。
采用mrm模式进行检测，各化合物的lc-ms参数见表2。
表26-磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖酸的lc-ms参数
记录6-磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖酸的质谱峰面积用于定量。
实施例1孵育液配方的确定
取同一质控样，分别采用表3所示配方的孵育液，按照上述串联质谱非衍生化检测g6pd的含量，孵育温度为37℃，孵育时间为30min，震荡速度为100rpm，流动相为有机相：水相，梯度洗脱，梯度为：初始比例为2∶98，0～2min，有机相维持2％，2～3min，有机相从2％升至95％，3～6min，有机相比例维持95％。
表3不同孵育液配方
配方1～6的孵育液均可获得理想的效果，回收率和准确度能够达到美国疾病预防控制中心质控要求。
实施例2流动相配方的确定
取同一质控样，分别采用分别采用表4所示配方的流动相，按照上述串联质谱非衍生化法检测g6pd含量，配方1～6的流动相均可获得理想的检测效果，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的回收率能够达到美国疾病预防控制中心质控要求。超出配方1～6的范围后，信号强度变低，准确度下降，回收率会下降或者升高。
表4不同流动相配方
实施例3～8试剂盒
试剂盒包括：
实施例3中，孵育液由水、缓冲盐、皂素、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp)和6-磷酸葡萄糖组成，缓冲盐浓度为0.5mmol/l，皂素浓度为50g/l，nadp浓度为0.5mmol/l，6-磷酸葡萄糖浓度为5mmol/l；酶淬灭剂为乙腈；a有机相为乙腈，水相为10mmol/l的醋酸铵水溶液，水相ph为10。
实施例4中，孵育液由水、缓冲盐、聚山梨酯、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp)和6-磷酸葡萄糖组成，缓冲盐浓度为400mmol/l，聚山梨酯浓度为20g/l，nadp浓度为20mmol/l，6-磷酸葡萄糖浓度为1mmol/l；酶淬灭剂为甲醇：乙醇＝1∶1；a有机相为甲醇，水相为20mmol/l的醋酸铵水溶液，水相ph为10。
实施例5中，孵育液由水、缓冲盐、泊洛沙姆、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp)和6-磷酸葡萄糖组成，缓冲盐浓度为200mmol/l，泊洛沙姆浓度为10g/l，nadp浓度为10mmol/l，6-磷酸葡萄糖浓度为2mmol/l；酶淬灭剂为甲醇：乙醇＝1∶1；a有机相为甲醇：乙腈＝1∶1，水相为10mmol/l的甲酸铵水溶液，水相ph为9。
实施例6中，孵育液由水、缓冲盐、磷脂、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp)和6-磷酸葡萄糖组成，缓冲盐浓度为100mmol/l，磷脂浓度为50g/l，nadp浓度为30mmol/l，6-磷酸葡萄糖浓度为20mmol/l；酶淬灭剂为乙醇＝1∶1；a有机相为甲醇∶乙腈＝99∶1，水相为10mmol/l的甲酸铵水溶液，水相ph为11。
实施例7中，孵育液由水、缓冲盐、十二烷基硫酸钠、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp)和6-磷酸葡萄糖组成，缓冲盐浓度为20mmol/l，十二烷基硫酸钠浓度为10g/l，nadp浓度为10mmol/l，6-磷酸葡萄糖浓度为10mmol/l；酶淬灭剂为甲醇；a有机相为甲醇∶乙腈＝99∶1，水相中醋酸铵浓度为5mmol/l、甲酸铵浓度为10mmol/l，水相ph为9。
实施例8中，孵育液由水、缓冲盐、皂素、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp)和6-磷酸葡萄糖组成，缓冲盐浓度为50mmol/l，皂素浓度为2g/l，nadp浓度为5mmol/l，6-磷酸葡萄糖浓度为50mmol/l；酶淬灭剂为甲醇∶乙醇＝1∶1；a有机相为甲醇∶乙腈＝4∶6，水相为2mmol/l的甲酸铵水溶液，水相ph为10。
实施例9
试剂盒的使用方法
(1)工作曲线和质控样制备：
在预包被有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶g6pd校准品a～f和质控品q1、q2的96孔孵育板相应的孔中，以每孔加40μl水，复溶，准备孵育。
(2)加样：
将2.5μl全血加入96孔孵育板中，准备孵育。
(3)孵育：
将所有样本孔、校准品和质控品孔中各加40μl稀释液，浸润滤纸片，再加50μl孵育液，加膜覆盖后放入恒温孵育震荡器中，在37℃温度中100rpm震荡孵育30min，加入酶淬灭剂(甲醇∶乙醇＝1∶1)100μl，用贴膜密封后震荡5min，在冷冻离心机上20℃3000rpm离心30分钟。
(4)上机检测：
揭去封膜，用移液器每孔移出20μl上清液，顺序置入洁净的96孔检测板中，每孔加水180μl，用封膜密封96孔板，震荡混匀后放入质谱自动进样器中供质谱检测，进样10μl，采用串联质谱仪电喷雾负离子方式，色谱柱c18柱，流动相为甲醇：20mmol/l乙酸铵，ph10，梯度洗脱，梯度为：初始比例为2：98，0～2min，甲醇维持2％，2～3min，甲醇从2％升至100％，3～6min，甲醇比例维持100％。质谱条件：esi离子源，负离子模式。离子源参数如下：干燥气温度：325℃，干燥气流速：5l/min，雾化气压力：45psi，鞘气温度：350℃，鞘气流速：11l/min，毛细管电压：3000v(-)。
记录6-磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖酸的质谱峰面积用于定量。
实施例10
(1)工作曲线和质控样制备：
在预包被有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶g6pd校准品a～f和质控品q1、q2的96孔孵育板相应的孔中，以每孔加40μl水，复溶，准备孵育。
(2)加样：
用3.2mm打孔器将干血斑样本打入96孔孵育板中，准备孵育。
(3)孵育：
将所有样本孔、校准品和质控品孔中各加40μl稀释液，浸润滤纸片，再加50μl孵育液，加膜覆盖后放入恒温孵育震荡器中，在37℃温度中100rpm震荡孵育30min，加入酶淬灭剂乙腈100μl，用贴膜密封后震荡5min，在冷冻离心机上20℃3000rpm离心30分钟。
(4)上机检测：揭去封膜，用移液器每孔移出20μl上清液，顺序置入洁净的96孔检测板中，每孔加水180μl，用封膜密封96孔板，震荡混匀后放入质谱自动进样器中供质谱检测，进样10μl，采用串联质谱仪电喷雾负离子方式，色谱柱c18柱，流动相为乙腈：10mmol/l乙酸铵，ph10，梯度洗脱，梯度为：初始比例为2∶98，0～2min，乙腈维持2％，2～3min，乙腈从2％升至95％，3～6min，乙腈比例维持95％。质谱条件：esi离子源，负离子模式。离子源参数如下：干燥气温度：325℃，干燥气流速：5l/min，雾化气压力：45psi，鞘气温度：350℃，鞘气流速：11l/min，毛细管电压：3000v(-)。
记录6-磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖酸的质谱峰面积用于定量。
实施例11
(1)工作曲线和质控样制备：
在预包被有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶g6pd校准品a～f和质控品q1、q2的96孔孵育板相应的孔中，以每孔加40μl水，复溶，准备孵育。
(2)加样：
将5μl全血加入96孔孵育板中，准备孵育。
(3)孵育：
将所有样本孔、校准品和质控品孔中各加40μl稀释液，浸润滤纸片，再加50μl孵育液，加膜覆盖后放入恒温孵育震荡器中，在37℃温度中100rpm震荡孵育30min，加入酶淬灭剂乙醇100μl，用贴膜密封后震荡5min，在冷冻离心机上20℃3000rpm离心30分钟。
(4)上机检测：揭去封膜，用移液器每孔移出20μl上清液，顺序置入洁净的96孔检测板中，每孔加水180μl，用封膜密封96孔板，震荡混匀后放入质谱自动进样器中供质谱检测，进样10μl，采用串联质谱仪电喷雾负离子方式，色谱柱c18柱，流动相为乙腈：10mmol/l醋酸铵，ph10，梯度洗脱，梯度为：初始比例为2∶98，0～2min，乙腈维持2％，2～3min，乙腈从2％升至95％，3～6min，乙腈比例维持95％。质谱条件：esi离子源，负离子模式。离子源参数如下：干燥气温度：325℃，干燥气流速：5l/min，雾化气压力：45psi，鞘气温度：350℃，鞘气流速：11l/min，毛细管电压：3000v(-)。
记录6-磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖酸的质谱峰面积用于定量。
实施例12
(1)工作曲线和质控样制备：
在预包被有葡萄糖-6-磷酸脱氢酶g6pd校准品a～f和质控品q1(0.05u/ml)、q2(0.05u/ml)、q3(0.05u/ml)和q4(0.05u/ml)的96孔孵育板相应的孔中，以每孔加40μl水，复溶，准备孵育。
(2)孵育：
将校准品和质控品孔中各加40μl稀释液，浸润滤纸片，所有孔中均加50μl孵育液，加膜覆盖后放入恒温孵育震荡器中，在37℃温度中100rpm震荡孵育30min，加入酶淬灭剂乙腈100μl，用贴膜密封后震荡5min，在冷冻离心机上20℃3000rpm离心30分钟。
(3)上机检测：揭去封膜，用移液器每孔移出20μl上清液，顺序置入洁净的96孔检测板中，每孔加水180μl，用封膜密封96孔板，震荡混匀后放入质谱自动进样器中供质谱检测，进样10μl，采用串联质谱仪电喷雾负离子方式，色谱柱c18柱，流动相为乙腈：10mmol/l醋酸铵，ph10，梯度洗脱，梯度为：初始比例为2∶98，0～2min，乙腈维持2％，2～3min，乙腈从2％升至95％，3～6min，乙腈比例维持95％。质谱条件：esi离子源，负离子模式。离子源参数如下：干燥气温度：325℃，干燥气流速：5l/min，雾化气压力：45psi，鞘气温度：350℃，鞘气流速：11l/min，毛细管电压：3000v(-)。
记录6-磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖酸的质谱峰面积用于定量。
以校准品a～f的6-磷酸葡萄糖酸与6-磷酸葡萄糖的峰面积比值为x轴，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶浓度为y轴，做线性回归，得到y＝7.0666x-0.0129，r2＝0.9954。
质控品测得比值后，代入上述方程，得质控品的浓度平均值为0.043u/ml，rsd为3.78％。
该检测方法的回收率在80％～120％之间，符合检测要求，多次测量的rsd小于5％，符合分析测试要求。
对20个预先收集并使用不记名过量样品来组织相关性研究，将样品点渍于whatman903滤纸上，干燥并运用本发明所述的方法检测结果，其中18个样品的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性值在12～20u/ml左右，2个样品小于1u/ml，该方法与临床紫外速率法结果一致。