本发明涉及微生物领域，具体涉及多功能溶藻链霉菌streptomycesamritsarensis及其应用。
背景技术：
近年来，随着社会和经济的发展，因为人类生活及生产活动向自然水体中排放大量的氮、磷等营养元素，导致我国大到淡水湖泊、河流及沿海海岸，小到各类景观水体都出现了中到重度的水体富营养化。据估计，全球约有75％以上的淡水湖泊均处于不同程度的富营养化状态。水体富营养化导致某些有害优势藻类异常增殖，形成水华，致使水体腥臭难闻，透明度下降，溶氧量降低，水生生物大量死亡的现象，严重影响水体功能和生态健康，造成巨大的经济损失。随着水体富营养化的加重及全球气候的变化，全球范围内水生态系统藻类水华的爆发频率和影响程度逐年递增，尤其是有害蓝藻水华发生范围最广，造成的危害最大。水环境是人类赖以生存和发展的重要要素，探索经济有效且安全的防治方法和手段去除水华藻，对于保护水体环境、维护人类健康和发展具有非常重要的科学意义和应用前景。
目前，水华藻控制技术主要有物理、化学和生物三种方法。传统的物理打捞除藻方法见效快，但由于技术问题及实施成本问题很难大面积实施，同时将蓝藻打捞后的处置和利用也是一个亟待解决的问题。化学方法除藻不能从根本上解决富营养化问题，而且添加的除藻化学物质容易造成二次污染，可能非选择性的杀死其他水生生物，破坏水体生态平衡，造成难以消除的负面效应。生物除藻主要有生物操纵技术、植物化感作用抑藻和微生物控藻等方法。生物操纵技术是利用浮游动物、鱼类等水生动物摄食水体中的有害藻类来控制藻类水华的方法。由于生物操纵受湖泊营养化状态影响很大，而且这种治理方法往往受到水体的规模、环境条件的变化、原有的生态群落结构、合理的放养量及放养时间的限制。目前，利用植物化感作用抑藻还主要集中在大型水生植物，通过种间竞争或者释放化感物质以达到抑制藻类生长和促进其他水生生物代谢的目的，但大型植物生长相对缓慢，短时间内难以抑制蓝藻水华，同时它们的残体可能会成为水体营养物质的再生源或者大型植物的后续处理工艺处理不当会对环境造成二次污染。因此，寻求环境友好型、高效廉价的应急蓝藻水华控制方法仍然是当前水环境和水资源保护研究中亟待解决的重要问题之一。
一些对蓝藻有杀灭作用的微生物，包括噬藻体、细菌、真菌及原生动物可用于有害藻类水华的控制。微生物除藻利用自然生态环境中藻-菌的天然相互作用关系来控藻除藻，具有成本低、操作简单、见效快和环境友好等特点，是水华藻治理技术发展的趋势所在。这一类能杀灭有害蓝藻或抑制其生长的微生物被称为溶藻菌。溶藻菌可通过间接或直接的方式溶藻，间接溶藻指溶藻菌合成和释放活性物质抑制水华藻的生长或杀死藻细胞，直接溶藻指溶藻菌细胞直接攻击藻细胞达到抑制藻生长或杀灭藻细胞的作用。目前已经报道的多数溶藻菌存在溶藻谱窄，功能单一的问题，应用过程中难以同时解决水华爆发伴随的一些问题，如藻毒素。
很多种类蓝藻水华爆发后期会释放大量的微囊藻毒素，微囊藻毒素是一类环七肽物质，可影响各类水生生物的生长发育和存活，具有肝毒性，还有致癌、干扰人内分泌、影响儿童发育的风险，是世界各国用水安全重点控制指标之一。各类以裂解蓝藻细胞的水华控制措施会导致微囊藻毒素短时间内大量释放，而藻毒素比较稳定，自然分解速率慢，部分微生物能降解微囊藻毒素，但是降解往往需要数天到数十天时间(lezcanoetal.,2018；suetal.,2016)，这就使得微囊藻毒素在被降解前危害水生生物，并通过用水途径危害人类健康。虽然有分离微囊藻毒素降解菌来去除水体中毒素的报道，但是这些降解菌往往需要提前暴露在微囊藻毒素环境下，才能诱导其降解能力的表达(lezcanoetal.,2018；zhuetal.,2016)，有的微囊藻毒素降解菌甚至诱导蓝藻合成微囊藻毒素(lietal.,2016；zhangetal.,2016；kangetal.,2012)。且利用降解菌降解微囊藻毒素还会受到藻细胞裂解后释放的大量营养物的影响。
禾谷镰孢菌(fusariumgraminearum)是引起小麦赤霉病的病原菌，是我国小麦生产中常见的病害，可危害小麦的各生长期。主要感染小麦麦穗，导致小麦产量严重下降。此外，赤霉菌还会产生真菌毒素，这些毒素随着感染的病原菌直接存留在小麦籽粒中，严重威胁人类健康。因长期使用用化学制剂，如多菌灵等防治赤霉病，病原菌产生了抗药性，防效降低，并且化学制剂污染导致的生态环境问题不得不重视。开发杀灭和防治禾谷镰孢菌(fusariumgraminearum)的新型、高效、对环境安全的拮抗菌，对于有效防控小麦赤霉病具有重要意义。很多爆发蓝藻水华的富营养化淡水水体也是农田的灌溉用水的重要资源，在水华治理后，具有拮抗禾谷镰孢菌(fusariumgraminearum)的多功能溶藻菌可随着农业灌溉过程浇灌到农田，从而达到防治禾谷镰孢菌(fusariumgraminearum)病害的目的。
技术实现要素：
为解决上述问题本发明提供一种多功能溶藻链霉菌，该溶藻链霉菌不仅能够杀灭微囊藻、抑制微囊藻毒素合成和降解微囊藻毒素，还可拮抗禾谷镰孢菌(fusariumgraminearum)。
多功能溶藻链霉菌(streptomycesamritsarensis)hg-16，其保藏编号为cctccm2018237。
该菌株已于2018年4月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内武汉大学保藏中心，邮编430072)，保藏号为cctccm2018237。该菌株的分类命名为阿姆利则链霉菌(streptomycesamritsarensis)，菌株名称为hg-16。
上述溶藻链霉菌(streptomycesamritsarensis)、上述溶藻链霉菌(streptomycesamritsarensis)的发酵液或上述溶藻链霉菌(streptomycesamritsarensis)的活性分泌物在治理水华中的应用也属于本发明的保护范围；
优选的，所述水华是微囊藻(microcystis)、鱼腥藻(anabeana)、颤藻(oscillatoria)和席藻(phormidium)中的一种或多种引起的水华。
优选的，所述微囊藻(microcystis)为铜绿微囊藻(microcystisaeruginosa)和惠氏微囊藻(microcystiswesenbergii)中的一种或多种。
优选的，所述鱼腥藻(anabeana)为水华鱼腥藻(anabeanaflos-aquae)。
优选的，所述颤藻(oscillatoria)为浮游颤藻(oscillatoriaplanctonica)。
优选的，所述席藻(phormidium)为泥褐席藻(phormidiumluridum)。
上述溶藻链霉菌(streptomycesamritsarensis)、溶藻链霉菌(streptomycesamritsarensis)的发酵液或溶藻链霉菌的活性分泌物在制备禾谷镰孢菌(fusariumgraminearum)的拮抗剂中的应用也属于本发明的保护范围。
上述溶藻链霉菌(streptomycesamritsarensis)、溶藻链霉菌(streptomycesamritsarensis)发酵液或溶藻链霉菌(streptomycesamritsarensis)的活性分泌物在抑制微囊藻毒素合成或/和降解微囊藻毒素中的应用同属于本发明的保护范围。
上述微囊藻毒素是指微囊藻(microcystis)、鱼腥藻(anabeana)和颤藻(oscillatoria)产生的微囊藻毒素。
本发明的有益效果在于：
1.溶藻链霉菌、其发酵液、和活性分泌物均能够有效杀灭微囊藻，同时还对禾谷镰孢菌具有拮抗作用；
2.溶藻链霉菌、其发酵液和活性分泌物均能够在短时间内有效抑制微囊藻毒素的产生，加入该链霉菌9h内即可抑制90％的微囊藻毒素的合成基因的表达，36h后可完全抑制微囊藻毒素基因的表达，加入该链霉菌3天后，藻毒素的合成抑制率为93％，而已报道的具有抑制微囊藻毒素合成的溶藻菌需要3天以上才能够抑制的微囊藻毒素的产生，有的溶藻菌还促进微囊藻毒素的合成；
3.溶藻链霉菌还可利用杀灭的蓝藻进行生长，对微囊藻毒素进行降解，使得采用溶藻链霉菌处理蓝藻水华时，不仅能控制微囊藻毒素的浓度水平，还能降低微囊藻毒素的浓度水平至安全水平之下，同时还能用菌丝缠绕蓝藻细胞或蓝藻细胞碎片，形成絮状沉淀沉降，减少二次污染然。
4.溶藻链霉菌的发酵液能够在ph3-11，25-75℃内稳定存在，有利于在多变的自然环境中保持溶藻、抑制毒素合成及拮抗禾谷镰孢菌的功能。
本发明提供的多功能溶藻链霉菌(streptomycesamritsarensis)hg-16保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内武汉大学保藏中心，邮编：430072，保藏日期：2018年4月26日)，保藏号为cctccm2018237。
附图说明
图1是链霉溶藻菌hg-16的菌落形态图，其中，a为菌落倒置显微镜显微照片，b为菌丝和孢子丝光学显微镜显微照片，c为菌丝和孢子丝扫描电镜显微照片；
图2是hg-16无菌滤液破坏微囊藻细胞的扫描电镜照片，其中，a为对照组的扫描电镜照片，b为hg-16无菌滤液处理的扫描电镜照片；
图3是hg-16杀灭颤藻光学显微镜图片，其中，a为对照组的光学显微镜图片，b为hg-16处理的光学显微镜图片；
图4是hg-16杀灭鱼腥藻光学图片，其中，a为对照组的光学显微镜图片，b为hg-16处理的光学显微镜图片；
图5是hg-16对微囊藻毒素合成基因mcyb表达抑制效图，其中纵坐标为相对表达量，横坐标为处理时间；
图6是hg-16发酵液和上清液处理铜绿微囊藻3天对微囊藻毒素产率的抑制效果图；
图7是hg-16发酵液处理铜绿微囊藻6天对微囊藻毒素浓度的影响；
图8是hg-16拮抗禾谷镰孢菌生长形成的拮抗圈，其中，a为hg-16菌落分泌活性物拮抗禾谷镰孢菌形成的拮抗圈，b为hg-16裂解微囊藻培养液拮抗禾谷镰孢菌形成的拮抗圈；
图9是不同酸碱度对hg-16无菌菌发酵液溶藻活性的影响；
图10是不同温度处理对hg-16无菌发酵液溶藻活性的影响；
图11是采用neighborjoining方法构建系统发育树。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明进行进一步的说明。
本发明所用的材料、试剂等无特殊说明，均可通过商业途获得；所用操作方法无特殊说明均参考《农业微生物学实验技术》(李阜棣、喻子牛、何绍江主编)。
实施例1菌株的分离与筛选
(1)放线菌的分离：采集重庆紫色土监测站的红壤200g，取10g土用90ml无菌水重悬，梯度稀释后涂布高氏一号培养基，28℃培养至长出单菌落，根据孢子丝和基内菌丝颜色和菌落形态差异挑取不同的放线菌纯化保藏。
(2)拮抗禾谷镰孢菌的放线菌筛选：在pda固体培养基中央接种禾谷镰孢菌的菌块，在其周围接种放线菌，28℃培养3天后观察拮抗圈，挑选能拮抗禾谷镰孢菌放线菌产生拮抗圈的放线菌做溶藻菌筛选。
(3)溶藻放线菌的筛选：将具有拮抗禾谷镰孢菌的放线菌接种至装有30ml高氏一号培养基的三角瓶中，培养3天后按5％的体积比加入到装有30ml的铜绿微囊藻nies-843藻液(初始叶绿素a分别为0.5mg/l)中；同时添加等体积的液体培养基到铜绿微囊藻nies-843藻液中作为空白对照；在温度为28℃，光照强度为50μem-2s-1，光暗周期为14:10的人工气候箱中，每组处理分别设置三个平行样本。培养一段时间后，观察藻液黄化的，取样品测定叶绿素a(chlorophylla,chl-a)的含量并计算其溶藻效率。溶藻率最高的菌株即为本发明的链霉菌。
溶藻效率(ae)可以通过公式(1)进行计算：
ae＝(c0-ct)/c0×100％(1)
其中，c0和ct分别为对照组和处理组中叶绿素a的含量。
实施例2菌株的培养
种子培养基，高氏一号培养基：可溶性淀粉20g，kno31.0g，nacl0.5g，k2hpo40.5g，mgso4·7h2o0.5g，feso4·7h2o0.01g，去离子水添至1l，琼脂粉2％(m/v，固体时添加)，ph7.4-7.6。
发酵培养基，稀释5倍的luria-bertani(lb)培养基：胰蛋白胨2g，酵母抽提物1g，nacl1g，琼脂粉2％(m/v，固体时添加)，去离子水添至1l，ph6.8-7.0。
拮抗pda培养基：土豆200g，加水煮沸30分钟，2层纱布过滤，取过滤液用于培养基配制，葡萄糖20g，琼脂粉2％(m/v，固体时添加)，去离子水添至1l，ph值自然。
藻培养基bg11培养基(blue-greenmedium)：nano31.5g，k2hpo40.04g，mgso4·7h2o0.075g，cacl2·7h2o0.036g，na2co30.02g，柠檬酸0.006g，柠檬酸铁0.006g，edtana2.001g，微量元素溶液a51ml(a5:h3bo32.86g,mncl2·4h2o1.86g,znso4·7h2o0.22g,namoo4·2h2o0.39g,cuso4·5h2o0.08g,去离子水添至1l),去离子水添至1l。
固体平板培养：将菌株划线接种到高氏一号固体平板上，28℃培养5-6天至长出灰粉色的孢子。
种子液培养：重悬在高氏一号固体平板上长出的菌株孢子，接种于100ml发酵培养基，28℃，180rpm振荡培养36h得到发酵液，在需要无菌发酵液上清的时候，12000×g，25℃离心去除菌体，上清用孔径为0.22μm的滤膜过去去除残余的菌体，即得到含有菌体分泌的活性物质的无菌发酵液上清。
平板对峙实验测对禾谷镰孢菌的拮抗活性：将禾谷镰孢菌接种于pda固体培养基，28℃培养4-5天，待菌丝长满平板。用打孔器取直径为1cm的带菌丝的琼脂块，置于pda固体平板的中央，然后在离琼脂块2.5cm处接种待测定的拮抗菌或拮抗菌菌液，然后在28℃培养4-5天，即可在接种菌或菌液的周围观察到因拮抗菌抑制禾谷镰孢菌菌丝生长所形成的透明圈。
与水华藻共培养测溶藻活性：将上述的发酵液或无菌发酵液上清，以5％(v/v)的比例接种于初始细胞数为106个细胞/ml的藻细胞培养液中，在28℃，3000lux，光/暗循环为14h/10h的条件下培养，不同时间点取样，离心收集菌体测定叶绿素含量，按前文所述方法计算溶藻率。
实施例3菌株的鉴定
该菌株的特征如下：
菌落形态：菌株hg-16在改良高氏一号培养基上生长，产白色的气生菌丝，灰粉色的孢子丝，培养时间延长后，菌落老化呈黄色，不产水溶性色素，显微镜观察孢子为直链节杆状(参见图1a)；在lb培养基和pda等营养丰富的培养基上生长菌落为褶皱状，淡黄色，不形成白色的气生菌丝，也不产孢子，形成与培养基紧密相连的基内菌丝，菌落无法全部挑取。
用上述种子液培养基培养溶藻链霉菌3天，然后10000×g离心收集菌体，弃上清，菌体细胞用试剂盒(fastdnaspinkit，美国)抽提总dna，然后用引物pcr扩增序列，正向引物27f:ggacgggtgagtaacgcgta；反向引物1492r:cccattgcggaaaattc，扩增条件为：95℃变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，然后72℃延伸90s,共循环30次；最后再在72℃延伸5min.。扩增获得的序列经过琼脂糖凝胶电泳检测条带大小和特异性后委托生工生物工程(上海)股份有限公司测定序列。测定的溶藻链霉菌的16srdna核苷酸序列如sediqno.1所示，其16srdna序列分析：从rdp数据库(ribosomaldatabaseproject)下载链霉菌典型菌株的16srdna序列，用mega6.0进行序列比对，采用neighborjoining方法构建系统发育树(参见图11)，结果表明，hg-16与streptomycesamritsarensis2a分类地位最接近，该菌是2014年新报道的一株新菌种。hg-16与streptomycesamritsarensis2a有明显不同的培养特征，如在isp2(酵母麦芽浸汁琼脂)培养基上，streptomycesamritsarensis2a生长良好、产生白色的孢子、浅灰色的气生菌丝、白色的基内菌丝和黑褐色的水溶性色素，而hg-16在isp2培养基上生长良好、产生灰粉色的孢子、白色的气生菌丝、黄色的基内菌丝和淡黄色的非水溶性色素，不产水溶性色素。且无streptomycesamritsarensis2a作为杀灭微囊藻、抑制微囊藻毒素合成和拮抗禾谷镰孢菌的报道。可见hg-16是一株新的具有杀灭微囊藻、抑制微囊藻毒素合成和拮抗禾谷镰孢菌的多功能放线菌。
综上所述，将菌株hg-16为streptomycesamritsarensis。
实施例4
1.溶藻链霉菌hg-16的溶藻效果
将实施例2的发酵液以5％(v/v)的比例接种于初始细胞数为106个细胞/ml的藻细胞培养液中(无法计数的藻按接种量体积比为10％)，设添加培养基代替发酵液的对照，然后在28℃，3000lux，光/暗循环为14h/10h的条件下培养。培养3天后取样用光学显微镜或扫描电镜观察藻细胞形态变化。培养5天和10天后取样，离心收集菌体测定叶绿素含量，按前文所述方法计算溶藻率。结果如表1所示，从表中可以看到，菌株hg-16对所测试的水华藻都有很强的溶藻活性，且溶藻活性随培养时间的增加而提高。
表1菌株hg-16对不同水华蓝藻的溶藻效果
*注：颤藻因为成团生长，部分藻细胞贴容器内壁，无法分析叶绿素含量，故未测具体的溶藻率，用“+”表示观察到藻变黄死亡的溶藻效果。
图2显示了hg-16无菌滤导致铜绿微囊藻nies-843细胞变形、破裂和释放胞内物质的扫描电镜照片，说明hg-16可分泌活性物质裂解铜绿微囊藻细胞。图4和图5显示了hg-16裂解颤藻和鱼腥藻的光学显微镜照片，从图中可以看出，hg-16导致颤藻细胞断裂，剩余的藻丝段明显呈中空状态，已经死亡，鱼腥藻细胞也大部分破裂，未破裂细胞呈透明状，表明细胞质已经被释放死亡。
2.溶藻链霉菌hg-16抑制微囊藻毒素合成
将hg-16发酵液无菌上清以5％的接种量5％(v/v)的比例接种于初始细胞数为106个细胞/ml的藻细胞培养液中，设用培养基代替发酵液上清的对照。然后置于然后在28℃，3000lux，光/暗循环为14h/10h的条件下培养。在培养9，18，36和72h后分别取样，收集藻细胞，提取藻细胞的rna，反转录成cdna，然后以16srdna为内参基因，通过rt-qpcr定量微囊藻毒素合成基因mcyb表达量的变化。采用基于微囊藻毒素抗体的方法，测定了培养0天，3天和6天的藻液中的微囊藻毒素含量，并以与0小时时微囊藻毒素为基数计算了微囊藻毒素在72h培养期间的增加率。结果如图5所示，经hg-16处理9h的藻微囊藻毒素合成基因的表达量就只有对照的11％，18h时只有对照的5％，36h后与对照相比几乎毒素合成基因几乎被完全抑制。图6显示了微囊藻毒素72小时的增加率，从图中可以看出，经hg-16无菌发酵液上清和发酵液处理的藻液中，微囊藻毒素增加率与对照相比非常低，表明hg-16通过分泌活性物质抑制微囊藻毒素基因合成最终使得微囊藻毒素合成量大幅度降低。3天时添加无菌上清和带菌发酵液处理的藻毒素增加率差异不显著，表明菌体初期对藻毒素没有明显的降解作用，但是从图7可以看到，经过6天的培养后，经培养物处理的藻毒素产率为负值，说明hg-16对微囊藻有降解活性。初期没有表现出降解活性可能是受裂解藻细胞释放出的营养物质干扰，后期营养物消耗后，开始降解利用藻毒素。
3.溶藻链霉菌hg-16拮抗禾谷镰孢菌
将禾谷镰孢菌接种于pda固体培养基，28℃培养4-5天，待菌丝长满平板。用打孔器取直径为1cm的带菌丝的琼脂块，置于pda固体平板的中央，然后在离琼脂块2.5cm处接种待测定的稀释5倍lb液体培养基培养36h的hg-16菌液20μl，同时接种相同体积的培养基作为对照，然后在28℃培养4-5天，即可在接种菌液的周围观察到因拮抗菌抑制禾谷镰孢菌菌丝生长所形成的透明圈(图8)，表明hg-16可分泌活性物质拮抗禾谷镰孢菌菌丝生长。
将hg-16发酵液无菌上清以5％的接种量5％(v/v)的比例接种于初始细胞数为106个细胞/ml的藻细胞培养液中，设用培养基代替发酵液上清的对照。然后置于然后在28℃，3000lux，光/暗循环为14h/10h的条件下培养6天，让藻细胞充分裂解。然后取藻菌共培养物，接种20μl到上述在中央接种了禾谷镰孢菌的pda平板上，同时接种未裂解的藻液和培养基为对照，然后在28℃培养4-5天，同样可见在接种hg-16和裂解藻液的培养物周围出现了明显的抑菌圈，而且hg-16的生长量并不大(图9)，可见hg-16在溶藻过程中可以以裂解藻细胞释放的营养物生长合成拮抗禾谷镰孢菌的活性物质。
4.溶藻链霉菌hg-16发酵液中溶藻活性物质的稳定性
将hg-16无菌发酵液用盐酸或者氢氧化钠溶液调整ph值至3，5，7，9，11，于4℃条件下放置2h，然后将处理后的溶液用盐酸或者氢氧化钠溶液调整ph值至未调整前的值，或将无菌发酵液在35、45、55、75、85和100℃条件下处理2h，或121℃条件下处理15min，然后恢复到常温。上述经过不同ph和温度处理的样品用0.22μm滤膜过滤除菌后，以5％的接种量5％(v/v)的比例接种于初始细胞数为106个细胞/ml的藻细胞培养液中，用未调整ph或常温处理的无菌上清为对照。然后置于然后在28℃，3000lux，光/暗循环为14h/10h的条件下培养6天，然后收集藻细胞，测定叶绿素，按上述方法计算溶藻率。图10显示了经不同酸碱度处理对hg-16无菌发酵液溶藻活性的影响，从图中可见在ph3-11范围内，hg-16的溶藻活性都保持稳定，说明该菌分泌的溶藻活性物质具有酸碱稳定性。图11显示了不同温度处理对hg-16无菌发酵液溶藻活性的影响，从图中可以看到，在温度小于85℃时，溶藻活性物质都很稳定，在85、100和121℃处理下，溶藻活性下降了约50％，说明溶藻活性物质有多种，包括耐75℃以下高温处理的，还包括耐121℃高温处理的。这些结果说明hg-16分泌的溶藻活性物质在自然环境条件下都会有很好的稳定性。
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