本发明属于药物化学领域，具体涉及一种含3-甲基-3-丁烯-2-醇结构的查尔酮类化合物及其旋光异构体的制备方法和应用。
背景技术：
炎症是机体对致病因素及其损害作用产生的一种反应，通常可依病程经过分为两大类：急性炎症(acuteinflammation)和慢性炎症(chronicinflammation)。大量研究表明炎症与肿瘤、冠心病、动脉粥样硬化和糖尿病在内的多种疾病的发生、发展密切相关，因此，炎症已成为人类多种疾病的一个标志性特征。在炎症发生发展过程中，与其密切相关的炎症因子主要包括肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-alpha，tnf-α)、白介素-6(interleukin-6，il-6)和白介素-1β等(interleukin-1β，il-1β)。这些炎症因子不仅可以激活放大炎症反应，还可以诱导细胞的凋亡，在炎症反应过程中起着至关重要重要的作用。目前，随着炎症信号传导途径研究的不断深入，tnf-α和il-6已经成为急慢性炎症有效的治疗靶点，在炎症性疾病治疗过程中扮演着重要角色。
查尔酮类化合物是广泛存在于自然界中的一种黄酮类化合物，具有抗癌、抗炎、抗寄生虫、抗病毒等生物活性。如黄腐酚(xanthohumol，xan))是啤酒花中特有的一种异戊烯类查尔酮化合物，研究表明黄腐酚也可有效抑制脂多糖(lipopolysaccharides，lps)诱导的炎症因子tnf-α和il-6，从而具有较好的抗炎活性。
技术实现要素：
本发明提供了一种含3-甲基-3-丁烯-2-醇结构的查尔酮类化合物及其旋光异构体的合成与应用，该3-甲基-3-丁烯-2-醇结构的查尔酮类化合物具有较好的抗炎活性。
一种含3-甲基-3-丁烯-2-醇结构的查尔酮类化合物，结构如式(i)所示：
本发明以天然产物sanjuanolide结构为基础，设计合成了其消旋体与对映异构体。体外抗炎活性测试结果表明，本发明设计合成的查尔酮类化合物具有较高的抗炎活性。
作为优选，该查尔酮类化合物具有旋光性，结构分别如式(ⅱ)或(ⅲ)所示：
本发明还提供了一种所述的含3-甲基-3-丁烯-2-醇结构的查尔酮类化合物的合成方法，包括以下步骤：
(1)在nah的作用下，2,4-二羟基苯乙酮与氯甲基甲醚发生取代反应，然后再用nabh4还原得到化合物7；
(2)在咪唑的作用下，化合物7与叔丁基二甲基氯硅烷发生取代反应，得到化合物8；
(3)在正丁基锂的作用下，化合物8发生脱羰基反应，得到化合物5；
(4)化合物5与wittig试剂发生wittig反应，得到化合物9；
(5)化合物9依次与硼烷二甲硫醚络合物和双氧水发生反应，得到化合物10；
(6)化合物10在氧化剂的作用下发生氧化反应，得到化合物4；
(7)化合物4与格氏试剂发生取代反应，反应结束后经过后处理得到化合物11；
(8)化合物11在氧化剂的作用下得到化合物3；
(9)化合物3在手性催化剂和还原剂的作用下，发生手性还原反应，得到化合物r-12；
(10)在碱性条件下，化合物r-12与醋酸酐发生酰化反应，得到化合物r-13；
(11)化合物r-13在tbaf的作用下，发生脱保护反应，然后再进行氧化反应得到化合物r-2；
(12)化合物r-2在苯甲醛和碱的作用下，发生羟醛缩合反应，得到化合物r-14；
(13)在碱性条件下，化合物r-14与醋酸酐发生酰化反应，得到化合物r-15；
(14)在酸性条件下，化合物r-15在甲醇中脱去保护基，得到化合物r-1；
反应路线如下：
本发明还提供了一种所述的含3-甲基-3-丁烯-2-醇结构的查尔酮类化合物及其旋光异构体的应用，所述的含3-甲基-3-丁烯-2-醇结构的查尔酮类化合物及其旋光异构体用于制备抗炎药物。结果表明，对于该查尔酮类化合物，其外消旋体和r型异构体都具有较好的抗炎活性，而s型异构体基本上不具有抗炎活性。
作为优选，所述的含3-甲基-3-丁烯-2-醇结构的查尔酮类化合物及其旋光异构体通过抑制tnf-α和il-6的分泌来治疗炎症以及与炎症相关的疾病。
作为优选，所述与炎症相关的疾病包括脓毒血症、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮及相关综合征、骨关节炎、消化道炎症、多发性肌炎、皮肌炎、血管炎性综合征、痛风性关节炎、神经炎症、风湿性关节炎、化学性疼痛、炎性疼痛、肉芽肿、肉芽肿性血管炎、动脉炎、皮肤炎症、自身免疫性疾病、脂膜炎、腹膜后纤维化、肝炎、肺炎、胰腺炎、过敏性炎症、全身炎症反应综合症、败血症、感染性休克。
本发明还提供了一种药物制剂，包括有效成分和药用辅料，所述的有效成分包括所述的含3-甲基-3-丁烯-2-醇结构的查尔酮类化合物作为优选，所述的药物制剂为注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、软膏剂、控释剂、缓释剂或纳米制剂的任一种。
同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
本研究设计合成了含3-甲基-3-丁烯-2-醇结构的查尔酮类化合物，是该类化合物的首次全合成。体外抗炎活性测试结果表明，本发明的化合物对促炎因子tnf-α和il-6具有较好的抑制能力，其中消旋体ic50值分别达到1.101m和1.625m，而r构型ic50值分别达到1.060m和1.233m，可为进一步设计合成活性更高、选择性更强的新型抗炎药物提供参考。
附图说明
图1为测试例1得到的各种化合物对脂多糖lps诱导的tnf-α和il-6的分泌的抑制数据。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的描述。
仪器和试剂：核磁共振氢谱采用brukeravanceiii500核磁共振仪测定(cdcl3为溶剂，tms为内标)；质谱采用agilent1100四级杆液相色谱质谱联用仪测定。薄层色谱用硅胶gf254购于阿拉丁试剂公司(aladdin，上海晶纯生化科技股份有限公司)；柱色谱用硅胶fcp(200～300目)购于国药集团化学试剂有限公司；其他所用试剂和溶剂均为国产分析纯，根据需要经无水干燥处理后使用。
(±)-sanjuanolide,r-sanjuanolide,s-sanjuanolide的合成
反应路线如下：
化合物7的合成
将2.00g(13.14mmol)2,4-二羟基苯乙酮溶于25ml无水中，于0℃搅拌条件下缓慢加入1.26g(52.58mmol)氢化钠，反应30min后加入momcl3.14ml(78.88mmol),反应体系室温下搅拌过夜。反应结束后，向体系中加入过量冰水，旋蒸除去四氢呋喃溶剂，随后加乙酸乙酯溶解，萃取，饱和氯化钠溶液水洗，无水硫酸镁干燥，旋蒸除去溶剂得1.52g粗品。将1.52g粗品溶于乙醇20ml，于0℃加入708.06mg(18.98mmol)硼氢化钠，室温搅拌3h反应完全，加水淬灭，旋去乙醇，随后加入乙酸乙酯溶解，萃取，饱和氯化钠溶液水洗，无水硫酸镁干燥，旋蒸除去有机溶剂，粗品经柱层析纯化得1.48g产物，收率76％。
化合物8的合成
将1.50g(6.18mmol)化合物7溶于无水二氯甲烷20ml，加入2.33g(15.48mmol)咪唑，再加入1.26g(18.57mmol)叔丁基二甲基氯硅烷，室温搅拌，tlc监测，6h反应完全。向反应体系中加入饱和氯化铵溶液淬灭，随后加入二氯甲烷，萃取，无水硫酸镁干燥，旋蒸除去有机溶剂，粗品经柱层析纯化得2.21g产物，收率100％。
化合物5的合成
将500mg(1.4mmol)化合物8溶于无水四氢呋喃12ml，氮气保护，于-78℃加入正丁基锂1.30ml(1.5mol/lin四氢呋喃，1.96mmol)，缓慢升温至0℃反应1h，再加入无水n,n二甲基甲酰胺164.01mg(2.24mmol)，于室温下反应1h。向反应体系中加入饱和氯化铵溶液淬灭，旋蒸除去四氢呋喃溶剂，加入乙酸乙酯，萃取，饱和氯化钠溶液水洗，无水硫酸镁干燥，旋蒸除去有机溶剂，粗品经柱层析纯化得420.42mg产物，收率78％。
化合物9的合成
向2.78g三苯基膦中加入无水四氢呋喃30ml，氮气保护，于-78℃下缓慢滴加正丁基锂3.33ml(2.5minhexane，8.32mmol)，于0℃反应1h，再将1g(2.6mmol)原料溶于四氢呋喃，滴加至反应体系中，2h反应完全。反应结束后，加入饱和氯化铵溶液淬灭，旋蒸除去四氢呋喃溶剂，加入乙酸乙酯萃取，饱和氯化钠溶液水洗，无水硫酸镁干燥，旋蒸除去有机溶剂，粗品经柱层析纯化得815.79mg产物，收率82％。
化合物10的合成
将化合物9(1g，2.61mmol)溶于15ml无水四氢呋喃，氮气保护，于0℃滴加硼烷二甲硫醚络合物2.62ml(794.31mg,10.46mmol)，缓慢恢复至室温反应4h，再缓慢滴加naoh溶液2.6ml(2mol/l，5.2mmol)以及30％过氧化氢溶液1ml。反应搅拌3h后，加入甲醇以及饱和氯化铵溶液淬灭，旋去四氢呋喃等有机溶剂，加入乙酸乙酯萃取，饱和氯化钠溶液水洗，无水硫酸镁干燥，旋蒸除去有机溶剂，粗品经柱层析纯化得420mg产物，收率40％。
化合物4的合成
将原料(1g，2.50mmol)溶于15ml二氯甲烷，于0℃缓慢加入2.10g(5.0mmol)戴斯马丁氧化剂，缓慢恢复至室温反应4h，随后分别加入饱和碳酸氢钠溶液20ml以及nas2o3溶液4ml(2mol/l)，加入乙酸乙酯萃取，饱和碳酸氢钠溶液水洗，无水硫酸镁干燥，旋蒸除去有机溶剂，粗品经柱层析纯化得792mg产物，收率80％。
化合物11的合成
向氮气保护的双颈瓶中加入异丙烯基溴化镁3.76ml(0.5msolutioninthf,1.88mmol)，将原料500mg(1.25mmol)溶于8ml无水四氢呋喃，于-30℃缓慢滴加入双颈瓶，于0℃反应2h。反应结束后，加入冰水淬灭，加入乙酸乙酯萃取，饱和氯化铵溶液水洗，无水硫酸镁干燥，旋蒸除去有机溶剂，粗品经柱层析纯化得375.9mg产物，收率68％。
化合物3的合成
将原料(350mg,794.3μmol)溶于8ml二氯甲烷，于0℃缓慢加入1.01g(2.38mmol)戴斯马丁氧化剂，缓慢恢复至室温反应4h，随后分别加入饱和碳酸氢钠溶液10ml以及nas2o3溶液2.5ml(2mol/l)，加入乙酸乙酯萃取，饱和碳酸氢钠溶液水洗，无水硫酸镁干燥，旋蒸除去有机溶剂，粗品经柱层析纯化得275.23mg产物，收率79％。
化合物r-12的合成
取r-me-cbs催化剂(102.6μl，1msolutionintoluene，102.6μmol)溶于5ml无水四氢呋喃，氮气保护下于0℃滴加硼烷二甲硫醚络合物(341.97μl,2.0mindiethylether,683.95μmol)，搅拌30min后，将150mg(341.95μmol)化合物3溶于无水四氢呋喃，于-30℃下缓慢滴加至反应体系中，缓慢恢复至0℃反应。反应2h后，向反应体系中加入甲醇以及饱和氯化铵溶液淬灭，旋蒸除去有机溶剂后，加入乙酸乙酯萃取，饱和碳酸氢钠溶液水洗，无水硫酸镁干燥，旋蒸除去有机溶剂，粗品经柱层析纯化得62.39mg产物，收率42％。
化合物r-13的合成
将350mg(950μmol)化合物r-12溶于10ml二氯甲烷，随后加入472μl(3.40mmol)三乙胺，214μl(2.27mmol)乙酸酐，15mg(113.47μmol)4-二甲氨基吡啶，于室温下搅拌反应2h。反应结束后，加入饱和氯化铵溶液淬灭，加入乙酸乙酯萃取，1mol/l柠檬酸水洗,无水硫酸镁干燥，旋蒸除去溶剂，得471.04mg产物，收率92％。
化合物r-2的合成
将420mg(870.12μmol)化合物r-13溶于6ml无水四氢呋喃，滴加716l(2.61mmol)四丁基氟化铵，于室温下搅拌5h。反应结束后，加入冰水淬灭，加入乙酸乙酯萃取，饱和氯化钠水溶液水洗，无水硫酸镁干燥，旋蒸除去溶剂。将所得产物(350mg，950.0μmol)溶于8ml二氯甲烷，于0℃缓慢加入1.20g(2.85mmol)戴斯马丁氧化剂，缓慢恢复至室温反应4h，随后分别加入饱和碳酸氢钠溶液以及nas2o3溶液，加入乙酸乙酯萃取，饱和碳酸氢钠溶液水洗，无水硫酸镁干燥，旋蒸除去有机溶剂，粗品经柱层析纯化得285.40mg产物，收率76％。
化合物r-14的合成
将200mg(545.8μmol)化合物r-2和115.90mg(1.09mmol)苯甲醛溶于8ml乙醇，加入45.95m(81.875μmol)氢氧化钾，于室温下搅拌过夜。反应完成后，加入饱和氯化铵淬灭，稀盐酸调节ph至中性，旋去乙醇，加入乙酸乙酯，萃取，饱和氯化钠溶液水洗，无水硫酸镁干燥，旋蒸除去有机溶剂，粗品经柱层析纯化得202.59mg产物，收率90％。
化合物r-15的合成
将200mg(484.88μmol)化合物r-14溶于8ml二氯甲烷，随后加入201.63l(1.45mmol)三乙胺，98.01l(969.75μmol)乙酸酐，11.85mg(96.98μmol)4-二甲氨基吡啶，于室温下搅拌反应2h。反应结束后，加入饱和氯化铵溶液淬灭，加入乙酸乙酯，萃取，1mol/l柠檬酸水洗,无水硫酸镁干燥，旋蒸除去溶剂，得202.75mg产物，收率92％。
化合物r-1的合成
将200mg(444.03mol)化合物r-15溶于6ml甲醇，加入4mol/l盐酸1ml，于70℃反应1.5h。反应结束后，加入饱和氯化铵溶液淬灭，加入乙酸乙酯，萃取，饱和氯化钠溶液水洗，无水硫酸镁干燥，旋蒸除去有机溶剂，粗品经柱层析纯化得88.49mg产物，收率62％，纯度为97.2％，ee值为90.2％。
消旋体的合成与上述步骤不同之处，在于不需要经过化合物11到化合物r-12的步骤；s型异构体的合成与上述步骤不同之处，在于形成化合物r-12的催化剂构型不同。
所得化合物的表征数据如下：
化合物7：
1hnmr(500mhz,(cd2)co)δ7.32(d,j＝5.0hz,1h),6.80(s,1h),6.72(d,j＝5.0hz,1h),5.21(s,2h),5.16(s,2h),5.13-5.10(m,1h),3.50(s,3h),3.48(s,3h),2.67(s,1h),1.49(d,j＝6.5hz,3h)；
13cnmr(125mhz,cdcl3)δ157.51,155.06,128.04,126.74,109.00,103.51,94.68,94.63,65.64,56.27,56.00,23.11.
化合物8：
1hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.42(d,j＝10hz,1h),6.74(s,1h),6.70(d,j＝10hz,1h),5.18-5.15(m,5h),3.49(s,3h),3.48(s,3h),1.35(d,j＝5.0hz,3h),0.91(s,9h),0.05(s,3h),0.02(s,3h).
13cnmr(125mhz,cdcl3)δ157.33,155.43,127.16,112.95,109.19,103.58,94.82,69.14,65.84,56.16,26.06,25.80,18.12,-0.05,-0.02.
化合物5：
1hnmr(500mhz,cdcl3)δ10.46(s,1h),7.73(d,j＝5.0hz,1h),7.01(d,j＝10hz,1h),5.26(dd,j＝12.2,6.7hz,3h),5.11(t,j＝7.3hz,1h),5.00(d,j＝6.6hz,1h),3.58(s,3h),3.52(s,3h),1.38(d,j＝5.0hz,3h),0.90(s,9h),0.06(s,3h),-0.03(s,3h).
13cnmr(125mhz,cdcl3)δ189.50,159.69,154.69,134.97,133.44,118.58,111.13,102.35,95.22,65.20,57.38,56.66,26.18,25.94,18.27,0.07,-3.49,-4.82,-4.87.
化合物9：
1hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.37(d,j＝10hz,1h),6.91(d,j＝10hz,1h),6.79(dd,j＝5.0,10.0hz,1h),5.99(d,j＝10.0hz,1h),5.49(d,j＝10hz,1h),5.24-5.17(m,4h),4.93(dd,j＝25.0,5.0hz,2h),3.56(s,3h),3.49(s,3h),1.63(s,3h),0.90(s,9h),0.05(s,3h),-0.03(s,3h).
13cnmr(125mhz,cdcl3)δ154.95,152.47,134.26,128.58,125.90,120.36,119.65,111.14,99.89,94.93,65.59,57.34,56.25,26.32,25.92,25.68,18.25,-3.56,-4.81,-4.91.
化合物10：
1hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.35(d,j＝10hz,1h),6.91(d,j＝5.0hz,1h),5.18(q,j＝5.0hz,2h),5.12(dd,j＝10,5.0hz,1h),4.98(q,j＝5.0hz,2h),3.83(t,j＝5.0hz,2h),3.62(s,3h),3.48(s,3h),3.00-2.98(m,2h),2.19(s,1h),1.37(d,j＝5.0hz,3h),0.88(s,9h),0.04(s,3h),-0.05(s,3h).
13cnmr(125mhz,cdcl3)δ155.17,153.68,133.85,125.50,120.87,110.61,100.42,94.70,65.83,62.62,57.10,56.18,28.15,26.27,25.85,18.19,-4.84,-4.92.
化合物4：
1hnmr(500mhz,cdcl3)δ9.66(s,1h),7.44(d,j＝10hz,1h),6.96(d,j＝10hz,1h),5.18-5.12(m,3h),4.89-4.88(m,2h),3.72(d,j＝10hz,2h),3.56(s,3h),3.44(s,3h),1.39(d,j＝5.0hz,3h),0.89(s,9h),0.05(s,3h),-0.04(s,3h).
13cnmr(125mhz,cdcl3)δ200.27,155.10,153.72,133.90,126.66,115.70,110.40,100.46,94.61,65.71,57.15,39.85,26.30,25.86,18.19,-4.83,-4.89.
化合物11：
1hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.36(d,j＝5.0hz,1h),6.92(d,j＝5.0hz,1h),5.19(s,2h),5.10(q,j＝5.0hz,1h),5.02(d,j＝5.0hz,1h),4.98(s,2h),4.82(s,1h),4.33(d,j＝10hz,1h),4.12(q,j＝5.0hz,1h),3.61(s,3h),3.49(s,3h),2.99-2.87(m,3h),2.03(s,3h),1.84(s,3h),1.37(d,j＝5.0hz,3h),1.25(t,j＝5.0hz,3h),0.88(s,9h),0.04(s,3h),-0.05(s,3h).
13cnmr(125mhz,cdcl3)δ200.31,155.09,153.71,133.89,126.65,115.68,110.38,100.46,94.59,65.71,57.15,56.22,39.84,26.30,25.86,25.64,18.19,-0.03,-3.59,-4.84,-4.90.
化合物3：
1hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.38(d,j＝5.0hz,1h),6.90(d,j＝5.0hz,1h),6.05(s,1h),5.75(s,1h),5.17-5.08(m,5h),4.85(s,2h),4.09(d,j＝5.0hz,2h),3.52(s,3h),3.41(s,3h),1.91(s,3h),1.38(d,j＝10hz,3h),0.89(s,9h),0.04(s,3h),-0.05(s,3h).
13cnmr(125mhz,cdcl3)δ199.38,154.84,153.33,125.83,123.74,118.50,110.39,100.20,94.61,65.72,57.06,56.04,34.78,26.39,25.89,25.65,17.86,-4.80,-4.93.
化合物r-12：
1hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.36(d,j＝5.0hz,1h),6.92(d,j＝5.0hz,1h),5.19(s,2h),5.10(q,j＝5.0hz,1h),5.02(d,j＝5.0hz,1h),4.98(s,2h),4.82(s,1h),4.33(d,j＝10hz,1h),4.12(q,j＝5.0hz,1h),3.61(s,3h),3.49(s,3h),2.99-2.87(m,3h),2.03(s,3h),1.84(s,3h),1.37(d,j＝5.0hz,3h),1.25(t,j＝5.0hz,3h),0.88(s,9h),0.04(s,3h),-0.05(s,3h).
13cnmr(125mhz,cdcl3)δ200.31,155.09,153.71,133.89,126.65,115.68,110.38,100.46,94.59,65.71,57.15,56.22,39.84,26.30,25.86,25.64,18.19,-0.03,-3.59,-4.84,-4.90.
化合物r-13：
1hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.33(d,j＝10hz,1h),6.89(d,j＝10hz,1h),5.59(s,1h),5.16(d,j＝15hz,3h),4.96(d,j＝15hz,2h),4.81(d,j＝15hz,3h),3.59(d,j＝10hz,3h),3.49(d,j＝10hz,3h),3.03-2.97(m,2h),1.92(d,j＝15hz,3h),1.77(d,j＝15hz,3h),1.35(d,j＝5.0hz,3h),0.88(s,9h),0.03--0.09(m,6h).
13cnmr(500mhz,cdcl3)δ169.92,155.45,153.64,143.67,133.97,125.71,120.12,112.12,110.31,100.32,94.81,65.72,65.51,57.14,57.08,56.15,26.37,25.88,25.65,21.05,18.16,-4.79,-4.85,-4.96,-5.01.
化合物r-2：
1hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.50(d,j＝10.0hz,1h),6.91(d,j＝10.0hz,1h),5.61-5.58(m,1h),5.23(s,2h),4.97(q,j＝5.0hz,2h),4.88(s,1h),4.84(s,1h),3.53(s,1h),3.51(s,1h),3.16-3.06(m,2h),2.55(s,3h),1.94(s,3h),1.82(s,3h).
13cnmr(125mhz,cdcl3)δ199.29,169.96,159.47,156.55,143.51,129.65,127.50,121.12,112.34,109.34,101.53,94.52,76.06,57.81,56.35,29.88,28.30,20.99,18.18.
化合物r-14：
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.67–7.52(m,3h),7.40-7.26(m,3h),6.99(d,j＝10hz,1h),5.27(s,2h),5.03-4.97(m,3h),4.87(s,1h),4.37(s,1h),3.50(s,6h),3.10-3.03(m,2h),1.88(s,3h).
13cnmr(125mhz,cdcl3)δ192.26,158.99,148.06,144.05,129.02,128.95,128.57,128.42,110.04,109.82,105.19,101.68,94.57,75.16,57.83,56.42,31.02,18.20.
化合物r-15：
1hnmr(500mhz,cdcl3)δ7.61-7.59(m,3h),7.50(d,j＝10hz,1h),7.40(s,2h),7.31-7.27(m,2h),6.97(d,j＝10hz,1h),6.88(dd,j＝10,5.0hz,1h),5.67-5.64(m,1h),5.24(d,j＝15hz,2h),4.94-4.93(m,2h),4.87(s,1h),3.53(s,3h),3.46(s,3h),3.22-3.18(m,1h),3.11-3.07(m,1h),1.98(s,3h),1.85(s,3h).
13cnmr(125mhz,cdcl3)δ192.26,169.99,159.23,156.46,143.79,143.59,130.35,129.80,129.71,128.93,128.38,128.13,126.49,112.36,109.64,101.44,94.59,76.16,57.88,56.35,28.30,21.05,18.23.
化合物r-1：
1hnmr(400mhz,cdcl3)δ13.83(s,1h),7.88(d,j＝16.0hz,1h),7.77(d,j＝8.0hz,1h),7.65-7.63(m,2h),7.61(d,j＝16.0hz,1h),7.43-7.42(m,3h),6.54(d,j＝8.0hz,1h),5.01(s,1h),4.89(s,1h),4.43(d,j＝8.0hz,1h),3.23(d,j＝16.0,1h),2.91(dd,j＝16.0,8.0hz,1h),1.88(s,3h).
13cnmr(500mhz,cdcl3)δ192.2,164.51,163.54,146.82,144.06,134.97,130.52,129.97,128.48,120.72,113.68,110.43,109.34,77.61,28.56,18.50.
测试例1化合物抑制脂多糖lps诱导的tnf-α和il-6的分泌
采用酶联免疫吸附实验(elisa)的方法测试目标化合物(±)-1((±)-sanjuanolide)，r-1(r-sanjuanolide)，s-1(s-sanjuanolide)对脂多糖lps诱导的tnf-α和il-6的分泌的抑制活性。小鼠巨噬细胞raw264.7培养于含有10％fbs，1％青链霉素混合液的dmem高糖培养基中，并放在37℃5％co2的恒温培养箱培养。细胞加药后2h加lps(0.5ug/ml)，继续孵育22h后收集培养基。促炎细胞因子tnf-α和il-6的表达用elisa试剂盒通过双抗夹心elisa检测，实验步骤简述如下：先用coatingbuffer包被elisa板，4℃过夜，加入吐温-20的磷酸盐缓冲液(pbst)洗3次甩干，加入assaydiluent封闭后加入收集的培养基，pbst洗去没有与包被抗体结合的样品，加入detectionantibody孵育后加avidin标记的hrp，最后加入酶作用底物tmb进行显色，15min后加2mh2so4终止反应并在450nm处测od值。
为了评价所合成的化合物抑制lps刺激的小鼠巨噬细胞raw264.7释放促炎因子tnf-α和il-6的能力。我们用lps刺激存在或不存在化合物的巨噬细胞。细胞用化合物(1μm，2.5μm，5μm，10μm)及dmso(作为对照)预孵育2h后加lps(0.5μg/ml)刺激22h，收集细胞的培养基和总蛋白。培养基内的tnf-α和il-6的总量用酶联免疫吸附试验法(elisa)检测同时用同一培养皿的总蛋白浓度作为标准。结果见图1，图1给出了3个已合成化合物的不同浓度下的相对抗炎数值。由图1可以看到这些化合物都可以不同程度地抑制炎症因子的释放，其中r-1对tnf-α和il-6的ic50分别达到1.060μm和1.233μm，而消旋体对tnf-α和il-6的ic50分别达到1.101μm和1.625μm。