本发明涉及微藻筛选技术领域，具体为一种利用尼罗红筛选高产生物柴油微藻的方法。
背景技术：
随着经济的发展，人类对能源的要求越来越高，微藻被认为是制备生物柴油燃料的理想原料。藻类具有光合效率高、零净碳值、易培养、生长周期短、油烃含量高等优点，且不与农争地，不与人争粮，不影响全球能源分配，其作为生物能源，已引起各国政府和学者的高度关注。微藻制备生物柴油的研究工艺包括产油微藻的筛选、微藻培养系统、微藻的收集分离、藻油的提取、微藻油脂制取生物柴油等过程。其中微藻油脂含量的测定是研究和开发高产油微藻的关键环节。传统的称重法来测量藻种含量需要的藻细胞量大且处理过程复杂繁琐，势必要耗费大量的空间与时间，测量数据不准确，筛选效率低。为此，我们提出一种利用尼罗红筛选高产生物柴油微藻的方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种利用尼罗红筛选高产生物柴油微藻的方法，以解决上述背景技术中提出的传统的称重法来测量藻种含量需要的藻细胞量大且处理过程复杂繁琐，势必要耗费大量的空间与时间，测量数据不准确，筛选效率低的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种利用尼罗红筛选高产生物柴油微藻的方法，该利用尼罗红筛选高产生物柴油微藻的方法包括如下步骤：
s1：将已知od680nm的对数期末期的微藻藻液加入96孔黑色酶标板中用多功能酶标仪读取藻液的初始荧光值x0；
s2：用丙酮将尼罗红染料配置成尼罗红染液，将尼罗红染液加入步骤s1中的微藻藻液中，混匀，在黑暗中孵育后测其荧光强度x；
s3：根据公式y＝(x-x0)/od680计算相对油脂含量，式中od680为680nm下藻液的吸光度。
优选的，所述尼罗红染液的浓度为0.025mg/ml-0.4mg/ml。
优选的，所述尼罗红染液的染色时间为5min-25min。
优选的，所述尼罗红染液的染色温度25℃-45℃。
优选的，所述微藻藻液od680nm的稀释倍数为0.1-0.8。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：该发明提出的一种利用尼罗红筛选高产生物柴油微藻的方法，提高了高产生物柴油微藻的筛选效率，简化了筛选方法，筛选速度快，便于操作，筛选成本低廉。
附图说明
图1为本发明尼罗红染料浓度对染色结果影响的折线图；
图2为本发明染色时间对染色结果的影响的折线图；
图3为本发明染色温度对染色结果的影响的折线图；
图4为本发明藻液浓度对染色结果的影响的折线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：一种利用尼罗红筛选高产生物柴油微藻的方法，该利用尼罗红筛选高产生物柴油微藻的方法包括如下步骤：
s1：将已知od680nm的对数期末期的微藻藻液加入96孔黑色酶标板中用多功能酶标仪读取藻液的初始荧光值x0；
s2：用丙酮将尼罗红染料配置成尼罗红染液，将尼罗红染液加入步骤s1中的微藻藻液中，混匀，在黑暗中孵育后测其荧光强度x；
s3：根据公式y＝(x-x0)/od680计算相对油脂含量，式中od680为680nm下藻液的吸光度。
其中，所述尼罗红染液的浓度为0.025mg/ml-0.4mg/ml，所述尼罗红染液的染色时间为5min-25min，所述尼罗红染液的染色温度25℃-45℃，所述微藻藻液od680nm的稀释倍数为0.1-0.8。
尼罗红荧光染色法条件优化
请参阅图1，尼罗红染液的浓度在0.025ug/ml到0.2ug/ml的范围内，选取的六株藻种的相对荧光强度的走势大致相同，大部分均在0.05ug/ml或0.1ug/ml时相对荧光强度达到最大，考虑到0.05ug/ml和0.1ug/ml的相对荧光强度相差不大，且节省染料决定选取0.05ug/ml作为后续大批量筛选的染料浓度。
请参阅图2，尼罗红染液的染色时间对于六种藻细胞的相对荧光强度的走势基本一致，相对荧光强度在5min到10min有升高的趋势，但超过10min后呈现缓慢下降的态势，因而决定选取10min作为后续大批量筛选的染色时间。
请参阅图3，在25-45℃的范围内，尼罗红染液的染色温度对于六种藻细胞的相对荧光强度的影响不是非常显著，走势也大致相同，选取35℃作为后续大批量筛选的染色温度。
请参阅图4，六种微藻的细胞密度对染色结果的影响，在藻液浓度在od680nm处于0.1-0.4的范围内，各种藻株的相对荧光强度与其藻液的浓度存在良好的线性关系(各r2均可达到0.99以上)。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。