本发明涉及化学制药技术领域，具体地说涉及3-(5-氟-4-(4-甲基-2-(甲基氨基)噻唑-5-基)嘧啶-2-基氨基)-苯磺酰胺的盐形式及其稳定晶型，其为选择性的细胞周期蛋白依赖性激酶(cdk)如cdk9的抑制剂，可以用于治疗细胞增殖性疾病如癌症。
背景技术：
增殖性疾病如癌症的特征是不受控的和失调的细胞增殖。蛋白激酶家族已经成为在此方面的广泛研究的主题的一类重要的酶。蛋白激酶家族是人类基因组中最大的家族之一。大多数激酶含有具有保守核心结构的250-300个氨基酸残基的催化结构域。该结构域包含atp的结合袋，所述atp的末端磷酸基以共价方式转移至其大分子底物。蛋白激酶可通过它们进行磷酸化的底物而分类，例如蛋白-丝氨酸/苏氨酸、蛋白-酪氨酸。
蛋白激酶通过使磷酰基从三磷酸核苷转移至牵涉在信号通路中的蛋白质受体而介导细胞内信号发放。这些磷酸化事件响应于多种细胞外刺激和其它刺激而触发，作为可调整或调节靶蛋白质生物学功能的分子开关起作用。细胞外刺激可影响一种或多种与细胞生长、迁移、分化、激素分泌、转录因子活化、肌肉收缩、葡萄糖代谢、蛋白质合成控制和细胞周期调节有关的细胞应答。
多种疾病与由蛋白激酶介导事件触发的异常细胞应答相关。这些疾病包括但不限于变态反应和哮喘、阿尔茨海默病、自身免疫疾病、骨疾病、癌症、心血管疾病、炎性疾病、激素相关性疾病、代谢疾病、神经学疾病和神经变性疾病。因此，在药物化学领域为寻找有效作为治疗剂的蛋白激酶抑制剂已经做出了大量努力。
现有技术中已知众多能够通过对抗atp结合来抑制蛋白激酶功能的分子。细胞周期蛋白依赖性激酶(cdk)是与多种细胞周期蛋白亚单位相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在调节细胞周期过程和转录周期中起关键作用。在真核细胞中的多种重要调节途径、包括细胞周期控制、细胞凋亡、神经元生理学、分化和转录中牵涉10种不同的cdk(cdk1-9和11)。
cdk可被分为两个反映它们功能的主要类别。主要由cdk1、cdk2、cdk3、cdk4和cdk6组成的细胞周期调节物cdk与它们的细胞周期蛋白伴侣(包括细胞周期蛋白a、b、d1、d2、d3、e和f)一起作用以调节细胞周期的增进。包括cdk7、cdk8、cdk9和cdk11在内的转录调节物cdk与细胞周期蛋白c、h、k、l1、l2、t1和t2一起工作，倾向于在转录调节中起作用。cdk已经牵连在细胞增殖性紊乱、特别是癌症中。细胞增殖是细胞分裂周期直接或间接失控的结果，cdk在该周期的多个阶段的调节中起关键作用。因此，cdk及其相关细胞周期蛋白的抑制剂是癌症治疗的有用靶标。cdk还在细胞凋亡和t-细胞发育中起作用，这主要是由于cdk在转录调节中的功能。例如，最近使用cdk抑制剂黄酮吡多(flavopiridol)在慢性淋巴细胞白血病(cll)中已经获得了明确的临床活性。cll的特征是对经由抗细胞凋亡蛋白质的增量调节进行的细胞凋亡的细胞抗性。在cdk9水平上的转录的抑制(是mrna延伸所需的)在cll细胞中选择性地恢复细胞凋亡。然而，仍然需要有在药理学和药学方面较优的cdk抑制剂，它具有界限清楚的激酶选择性和细胞特异性性质以及抗-cll功效以及对抗其它cdk介导的疾病的功效。
而且，众多病毒的复制过程需要cdk、特别是cdk2、cdk7和cdk9。已经报道了限制病毒复制的cdk抑制剂，所述病毒包括人免疫缺陷病毒、人巨细胞病毒、疱疹病毒和水痘-带状疱疹病毒。cdk、特别是cdk9的抑制是心血管疾病、包括心脏肥大的潜在治疗的新策略。心脏肥大的特征是mrna和蛋白质合成的总体增加。cdk7和cdk9与心脏肥大密切相关，这是因为它们是转录的主要驱动物。因此，cdk9及其相关细胞周期蛋白的抑制是心血管疾病的相关的药物靶标。
cdk的抑制还可用于治疗神经变性紊乱如阿尔茨海默病。与阿尔茨海默病有关的双股螺旋形细丝(pairedhelicalfilaments)的出现是由于cdk5/p25使tau蛋白高度磷酸化而引起的。
公开号为cn103373994a(整体援引加入本文)的中国发明专利公开了一类具有cdk-9抑制功能的化合物及其制备方法，其中提及了该类化合物的可药用盐，但并未制备出具体化合物的盐，也未对成盐的种类、性能做出进一步的评价。
因此，仍然需要识别可用于治疗此类病症的新治疗剂。特别是需要识别作为蛋白激酶(和尤其是cdk)活性抑制剂起作用并且还具有一个或多个有利的药物性质的其它化合物。所述的一个或多个有利的药物性质可以选自：效能/靶标活性增加(例如抗增殖活性增加)；治疗功效增加(例如对抗某些癌细胞系的活性增加和/或针对癌细胞的选择性改善)；和/或生物利用度(例如口服生物利用度)改善等等。
技术实现要素：
本发明提供了3-(5-氟-4-(4-甲基-2-(甲基氨基)噻唑-5-基)嘧啶-2-基氨基)-苯磺酰胺的酒石酸盐形式，其如式ii所示：。
该酒石酸盐可以以一种或多种多晶型形式存在，包括形式a、形式b。各多晶型可以通过其粉末x射线衍射图样或拉曼光谱或dsc热谱图加以区分。
本发明一方面提供了被指定为形式a晶体的3-(5-氟-4-(4-甲基-2-(甲基氨基)噻唑-5-基)嘧啶-2-基氨基)-苯磺酰胺酒石酸盐，其特征在于下述中的一种或多种：具有位于大约为9.6、18.9、24.5、26.7的2θ值位置的峰，并且不具有8.1、10.6、14.9、16.1的2θ值位置的峰的粉末x射线衍射图样，或具有位于大约为1389cm-1、1503cm-1、1571cm-1、1597cm-1的拉曼位移值的峰，并且不具有位于大约为806cm-1、1569cm-1的拉曼位移值的峰的拉曼光谱，或者具有位于238.6℃的尖吸热峰的dsc热谱图。
本发明另一方面提供了被指定为形式b晶体的3-(5-氟-4-(4-甲基-2-(甲基氨基)噻唑-5-基)嘧啶-2-基氨基)-苯磺酰胺酒石酸盐，其特征在于下述中的一种或多种：具有位于大约为8.1、10.6、14.9、16.1的2θ值位置的峰的粉末x射线衍射图样，或具有位于大约为297cm-1、325cm-1、806cm-1、1569cm-1的拉曼位移值的峰的拉曼光谱，或者具有位于239.9℃的尖吸热峰的dsc热谱图，或者具有1641cm-1、3355cm-1位移的峰的红外光谱图。对于各种盐形式，粉末x射线衍射图样使用cukα辐射获得，dsc热谱图使用10℃/分钟的加热速率获得。
本发明还提供了制备3-(5-氟-4-(4-甲基-2-(甲基氨基)噻唑-5-基)嘧啶-2-基氨基)-苯磺酰胺酒石酸盐a晶型的方法。其特征在于：
(1)将3-(5-氟-4-(4-甲基-2-(甲基氨基)噻唑-5-基)嘧啶-2-基氨基)-苯磺酰胺和一定量的溶剂二甲基亚砜混合后加热溶解得到第一混合物；
(2)向第一混合物中加入一定量酒石酸和水，反应得到第二混合物；
(3)向第二混合物中加入一定量水混溶性溶剂，反应得到3-(5-氟-4-(4-甲基-2-(甲基氨基)噻唑-5-基)嘧啶-2-基氨基)-苯磺酰胺酒石酸盐，其为酒石酸盐形式a；
在上述方法中，第二混合物通过将摩尔比为1.1～1.3:1的酒石酸和3-(5-氟-4-(4-甲基-2-(甲基氨基)噻唑-5-基)嘧啶-2-基氨基)-苯磺酰胺混合而制备得到，水混溶性溶剂是醇类，其中的醇类是乙醇。
优选的，所述步骤(2)中反应时间为0.1～3小时；
优选的，所述步骤(3)中反应时间为1～10小时；
本发明还提供了上述3-(5-氟-4-(4-甲基-2-(甲基氨基)噻唑-5-基)嘧啶-2-基氨基)-苯磺酰胺酒石酸盐及其a晶型在制备用于治疗增殖性紊乱药物中的用途。其中，增殖性紊乱引起的病症是癌症；进一步的，所述癌症包括急性髓细胞白血病。
本发明还提供了上述3-(5-氟-4-(4-甲基-2-(甲基氨基)噻唑-5-基)嘧啶-2-基氨基)-苯磺酰胺酒石酸盐及其forma晶型在制备用于抑制蛋白激酶的药物中的应用。
相对于游离碱(式i)以及其他盐形式包括盐酸盐、马来酸盐、磷酸盐等，该酒石酸盐提供了诸多优势。与游离碱相比，该酒石酸盐的水溶性提高了40倍。然而与磷酸盐等不同的是，上述溶解性的提高并未同时伴随着吸湿性的显著提高，在初步的稳定性试验中，该酒石酸盐在高温、高湿及光照条件下表现出了更好的稳定性。并且，该酒石酸盐结晶性好，易于进行生产规模的放大。上述以及其他的优势将有助于克服开发含有式ⅰ的选择性cdk9激酶抑制剂药物产品所面临的各种挑战。
附图说明
通过参照下面的描述以及附图，本发明所具有的各种特征、优势以及其他应用将更加明显。
图1为3-(5-氟-4-(4-甲基-2-(甲基氨基)噻唑-5-基)嘧啶-2-基氨基)-苯磺酰胺酒石酸盐形式a晶型的x-射线粉末衍射图；
图2为3-(5-氟-4-(4-甲基-2-(甲基氨基)噻唑-5-基)嘧啶-2-基氨基)-苯磺酰胺酒石酸盐形式b晶型的x-射线粉末衍射图；
图3为3-(5-氟-4-(4-甲基-2-(甲基氨基)噻唑-5-基)嘧啶-2-基氨基)-苯磺酰胺酒石酸盐形式a晶型和形式b晶型的x-射线粉末衍射叠加图，所具有的2θ值0至40；
图4为3-(5-氟-4-(4-甲基-2-(甲基氨基)噻唑-5-基)嘧啶-2-基氨基)-苯磺酰胺酒石酸盐形式a晶型和形式b晶型的x-射线粉末衍射叠加图，所具有的2θ值0至20；
图5为3-(5-氟-4-(4-甲基-2-(甲基氨基)噻唑-5-基)嘧啶-2-基氨基)-苯磺酰胺酒石酸盐形式a晶型和形式b晶型的x-射线粉末衍射叠加图，所具有的2θ值20至40；
图6为3-(5-氟-4-(4-甲基-2-(甲基氨基)噻唑-5-基)嘧啶-2-基氨基)-苯磺酰胺酒石酸盐形式a晶型的拉曼光谱叠加图，所具有的拉曼位移为0cm-1至3000cm-1；
图7为3-(5-氟-4-(4-甲基-2-(甲基氨基)噻唑-5-基)嘧啶-2-基氨基)-苯磺酰胺酒石酸盐形式b晶型的拉曼光谱叠加图，所具有的拉曼位移为0cm-1至3000cm-1；
图8为3-(5-氟-4-(4-甲基-2-(甲基氨基)噻唑-5-基)嘧啶-2-基氨基)-苯磺酰胺酒石酸盐形式a晶型和形式b晶型的拉曼光谱叠加图，所具有的拉曼位移为0cm-1至3000cm-1；
图9为3-(5-氟-4-(4-甲基-2-(甲基氨基)噻唑-5-基)嘧啶-2-基氨基)-苯磺酰胺酒石酸盐形式a晶型和形式b晶型的拉曼光谱叠加图，所具有的拉曼位移为750cm-1至1750cm-1；
图10为3-(5-氟-4-(4-甲基-2-(甲基氨基)噻唑-5-基)嘧啶-2-基氨基)-苯磺酰胺酒石酸盐形式a晶型和形式b晶型的拉曼光谱叠加图，所具有的拉曼位移为100cm-1至800cm-1；
图11为3-(5-氟-4-(4-甲基-2-(甲基氨基)噻唑-5-基)嘧啶-2-基氨基)-苯磺酰胺酒石酸盐形式a晶型的dsc热谱图；
图12为3-(5-氟-4-(4-甲基-2-(甲基氨基)噻唑-5-基)嘧啶-2-基氨基)-苯磺酰胺酒石酸盐形式b晶型的dsc热谱图；
图13为3-(5-氟-4-(4-甲基-2-(甲基氨基)噻唑-5-基)嘧啶-2-基氨基)-苯磺酰胺酒石酸盐形式a晶型和形式b晶型的红外光谱叠加图，所具有的红外位移为500cm-1至3500cm-1；
图14为3-(5-氟-4-(4-甲基-2-(甲基氨基)噻唑-5-基)嘧啶-2-基氨基)-苯磺酰胺酒石酸盐形式a晶型和形式b晶型的红外光谱叠加图，所具有的红外位移为500cm-1至2000cm-1；
图15为3-(5-氟-4-(4-甲基-2-(甲基氨基)噻唑-5-基)嘧啶-2-基氨基)-苯磺酰胺酒石酸盐形式a晶型和形式b晶型的红外光谱叠加图，所具有的红外位移为2500cm-1至3000cm-1；
发明详述
定义
术语“癌症”包括但不限于下述癌症：白血病、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、睾丸癌、食道癌、胃癌、皮肤癌、肺癌、骨癌、结肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、胆道癌、咽癌、唇癌、舌癌、口腔癌、咽喉癌、小肠癌、结肠-直肠癌、大肠癌、直肠癌、脑和中枢神经系统癌症、恶性胶质瘤、膀胱癌、肝癌、肾癌、淋巴癌等。
3-(5-氟-4-(4-甲基-2-(甲基氨基)噻唑-5-基)嘧啶-2-基氨基)-苯磺酰胺酒石酸盐(式ⅱ)可以以一种或多种多晶型形式存在，包括形式a和形式b。如上所述，每种多晶型可以通过粉末x-射线衍射、或拉曼光谱、或红外光谱、或差式扫描量热法、或者这些表征方法的某些组合加以区分。该酒石酸盐(式ⅱ)可以是纯度很高的，即含有至少99％重量的特定多晶型物，或者也可以是两种多晶型物的混合物。
图1和图2提供了3-(5-氟-4-(4-甲基-2-(甲基氨基)噻唑-5-基)嘧啶-2-基氨基)-苯磺酰胺酒石酸盐(式ⅱ)的粉末-x射线衍射图，将这些多晶型形式定义为图1中的形式a和图2中的形式b。为了方便比较阅读，图3为晶体形式a和b的粉末x-射线衍射叠加谱图，图4和图5分别是该叠加谱图的局部放大图。通过放大图的比对，多晶型形式b在8.1、10.6、14.9、16.1等与形式a有明显差别，多晶型鉴定领域的普通技术人员，通过粉末-x射线衍射图的叠加比对，选择特征峰的组合，能够将一种晶型与另一种晶型区分开。
如图1-图5所示的各粉末-x射线衍射图是在使用cukα(40kv，40ma)辐射的brukerd8advance粉末x-射线衍射仪上获得的。在操作衍射仪设备时，将管电压和电流分别设置为40kv和40ma，样品到检测器距离：30cm，扫描步径：0.1s，扫描范围：3°～40°(2θ)。
图6-10提供了3-(5-氟-4-(4-甲基-2-(甲基氨基)噻唑-5-基)嘧啶-2-基氨基)-苯磺酰胺酒石酸盐(式ⅱ)的拉曼光谱。图6和图7分别提供了酒石酸盐晶体形式a和晶体形式b的拉曼光谱，其中拉曼位移为0cm-1至3000cm-1。为方便比较阅读，图8为晶体形式a和晶体形式b的叠加拉曼光谱图，图9和图10分别是该叠加谱图的局部放大图。通过放大图的比对，多晶型形式b在297cm-1、325cm-1、806cm-1、1569cm-1等与形式a有明显差别，多晶型领域的普通技术人员可以选择上述特征数据或者其他特征将一种多晶型与另一种多晶型区分开。
图11和图12分别提供了被指定为多晶型形式a和形式b的3-(5-氟-4-(4-甲基-2-(甲基氨基)噻唑-5-基)嘧啶-2-基氨基)-苯磺酰胺酒石酸盐(式ⅱ)的dsc热谱图。dsc数据是使用perkinelmerdsc8500获得的，温度范围50-280℃，扫描速率10℃/min，氮气流速：20ml/min。dsc的谱图显示，晶体形式a和形式b加热熔融并分解，两者的熔点相近，形式a具有位于238.6℃的尖吸热峰，形式b具有位于239.9℃的尖吸热峰。
图13-15提供了3-(5-氟-4-(4-甲基-2-(甲基氨基)噻唑-5-基)嘧啶-2-基氨基)-苯磺酰胺酒石酸盐(式ⅱ)的红外光谱。为方便比较阅读，图13-15均为晶体形式a和形式b的叠加比较图，其中图13所具有的红外位移为500cm-1至3500cm-1，图14所具有的红外位移为500cm-1至2000cm-1，图15所具有的红外位移为2500cm-1至3000cm-1。从红外叠加谱图比较可以看出，多晶型形式b在1641.1cm-1、3355.5cm-1等处于形式a有明显差别。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步作具体描述，但不局限于此。
实施例13-(5-氟-4-(4-甲基-2-(甲基氨基)噻唑-5-基)嘧啶-2-基氨基)-苯磺酰胺(代号为ls007)成盐性能
1.1成盐高通量筛选
结合ls007的pka值以及在不同ph中的溶解度可以确定，pka值约为3或更小的酸可作为成盐筛选的酸。因此，我们选择了8种酸：盐酸、硫酸、天冬氨酸、马来酸、磷酸、谷氨酸、酒石酸、富马酸。
将药物溶解后加入至96孔板中，按照加入药物的摩尔量和反离子官能团的数量来决定加入反离子的体积。加热时间和温度可以视具体情况而定(一般是40℃，1个小时)。为了保证瓶内反应时有一定的压力，在混匀、涡旋和加热过程中需保证样品的绝对密封性，在整个过程中至少要由硅树脂的内垫。具体操作步骤如下：
1)配制0.02m酸的thf溶液，其中谷氨酸、硫酸和磷酸为水溶液；
2)配制0.01m的ls007的thf/meoh(1:1)溶液；
3)加入盐酸1ml、硫酸0.25ml、天冬氨酸0.5ml、马来酸0.5ml、磷酸0.5ml、谷氨酸0.5ml、酒石酸0.5ml、富马酸0.5ml，然后添加ls007各1ml；
4)涡旋后在40℃油浴中反应1小时后，室温挥去有机溶剂，最后在50℃条件下减压干燥。
raman光谱比较显示：盐酸、硫酸、磷酸、马来酸、酒石酸和富马酸均与ls007成盐，天冬氨酸和谷氨酸没有成盐。
对上述6种盐进行放大实验，测定各种盐在不同ph缓冲液和去离子水中的溶解度，并与自由碱进行比较。结果如表1所示：
表1
选择溶解性较好的盐酸盐、磷酸盐和酒石酸盐，对自由碱ls007、盐酸盐、磷酸盐和酒石酸盐做全面的固态表征，比较结果列于表2：
表2
hplc测试的溶解度结果发现：在ph2.0缓冲液以及去离子水中，盐酸盐、磷酸盐和酒石酸盐溶解度相比原料有显著的增加。溶解度：酒石酸盐>磷酸盐>盐酸盐>自由碱。
通过对原料药的dvs实验可以看出，ls007的吸湿性很小，成盐后吸湿性增加，其中磷酸盐吸湿性最强，60％rh时吸收水分11.71％；盐酸盐其次；酒石酸盐吸湿性最小。
发明人惊奇的发现，在溶解度以及吸湿性方面酒石酸盐均具有突出的表现。
实施例23-(5-氟-4-(4-甲基-2-(甲基氨基)噻唑-5-基)嘧啶-2-基氨基)-苯磺酰胺酒石酸盐晶型
本研究针对ls007酒石酸盐的多晶型问题，采用不同的结晶条件和实验手段，系统性筛选了化合物ls007酒石酸盐可能的晶型。通过近300次的结晶实验发现，ls007酒石酸盐可以以两种不同的晶体形式存在，分别为晶型a、b。进一步的表征发现不同晶型之间不存在显著的物化性能方面的差别。在晶型之间的转变实验中，发现forma更为稳定晶型，formb在一定条件下可转化为forma晶型。
(1)forma
柱状晶体，药物熔融分解，分解峰值温度236.8℃。不具引湿性(在80％湿度条件下，引湿增重0.22％)，在常规储存湿度范围内，湿度变化幅度小。物化性能较为理想，样品结晶度最好，流动性大于formb，成药性优于formb，且在各模拟体内条件下(ph＝2.0，4.6，6.8)的平衡溶解度大于formb。
forma晶型的具体制备方法如下：
在四口瓶中，加入ls007游离碱、6倍质量二甲亚砜，升温至溶清(控制温度<60℃)，趁热过滤；将反应料液转至10l反应瓶中，加入0.494倍(游离碱重量，1.3当量)酒石酸和0.27倍(游离碱重量)水，搅拌，升温至60±2℃保温半小时；加入8.6倍(游离碱重量)的无水乙醇，60±2℃保温4小时；体系温度降至25±5℃，抽滤(或者离心甩干)，滤饼用适量无水乙醇淋洗。
烧瓶中加入上述固体、2-3倍质量无水乙醇，80℃搅拌1小时，趁热过滤，所得滤饼热风干燥80℃，得到产品黄色固体产品即为ls007酒石酸盐forma晶型。
(2)formb
颗粒状晶体，药物熔融分解，分解峰值温度240.5℃。不具引湿性(在80％湿度条件下，引湿增重0.11％)，在常规储存湿度范围内，湿度变化幅度小。50℃混悬实验中以nm：h2o(1：1)为溶剂时可以得到formb。
xrpd叠加图较可以看出：formb在8.08°、10.63°、14.85°、16.12°、22.30°、24.33°、26.50°等与forma有明显差别。
本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。