本发明涉及工程菌技术领域，尤其涉及重组微生物源天然虾青素基因工程菌及其产物的制备方法。
背景技术
虾青素，是广泛存在于自然界和海洋环境中的天然类胡萝卜素，也是类胡萝卜素合成的最高级别产物，呈深粉红色，素有“类胡萝卜素之王”的称誉。在过去的几十年，虾青素的市场价值主要体现在食品着色、家禽和水产养殖领域。最近，虾青素因为其潜在的抗氧化能力，在人类消费品领域引起了极大的关注和重视。它独特的化学结构可以跨越生物膜，作为抗氧化剂消除自由基，从而稳定细胞组织和结构。研究表明，虾青素对人体还具有增强免疫，进而抵抗炎症，延迟衰老，降低糖尿病和癌症发病风险的功能。在氧自由基吸收和淬灭单线氧能力上，虾青素的潜力远高于其他类胡萝卜素。正是因为虾青素在水产养殖、食品、化妆品和医药行业的应用极具扩张，它的市场价值被广泛看好。
目前，虾青素的生产有人工合成和生物获取两种方式。人工合成虾青素不仅价格昂贵，而且同天然虾青素在结构、功能、应用及安全性等方面差别显著。目前，最有前景的一种生产方式是微生物发酵，其中研究最为广泛的是红法夫酵母和雨生红球藻。雨生红球藻的虾青素含量可达细胞干重的3%，较红法夫酵母产量高，但是，由于其培养条件苛刻且提取困难，限制了其生产应用。红发夫酵母作为自然界中存在的天然生产虾青素的微生物，因为培养周期短细胞密度大等优势引起了人们的注意。天然存在的红发夫酵母中虾青素含量极低，受菌种的影响，产量在0.16~1.1mg/g之间浮动。gerhardsandmann等通过传统突变和代谢工程结合的办法，产生了一株虾青素干重达到9mg/g的菌株，是已知的产量最高的红发夫酵母。然而，由于红发夫酵母产生的虾青素为（3r,3′r）构型，抗氧化能力较低，限制了其在商业规模上的使用。因此，制备重组虾青素基因工程菌势在必行。
酵母的同源重组效率远远高于细菌或是其他的高等真核生物，酵母已作为一种工程菌操作平台，在途径工程和代谢工程领域被广泛用于生物化学途径的异源表达，同时染色体重组获得工程菌，具有遗传稳定，避免外源基因丢失的优点。ken等使用酿酒酵母作为宿主菌，制备包含虾青素表达所需基因的多个质粒，然后导入宿主菌并生产虾青素（kenukibe,keisukehashida,nobuyukiyoshida,andhiroshitakagi.metabolicengineeringofsaccharomycescerevisiaeforastaxanthinproductionandoxidativestresstolerance.appliedandenvironmentalmicrobiology，2009:7205-7211）。然而，这种虾青素基因工程菌构建的方法需要依次将虾青素表达相关的基因整合于酵母菌染色体上，涉及多级克隆，且依赖于合适的酶切位点选择，操作繁琐，周期长。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种重组微生物源天然虾青素基因工程菌及其产物的制备方法，该工程菌生长繁殖迅速、能成功表达出重组虾青素蛋白，表达量高、产量高，得到的重组虾青素为3s,3's构型，工程菌发酵制备重组虾青素的产量高、效率高，大大节省人力物力成本。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：
酿酒酵母invsc1购于上海北诺生物科技有限公司。
重组微生物源天然虾青素基因工程菌，其制备方法包括基因扩增、制备克隆质粒、制备重组表达质粒、制备重组微生物源天然虾青素基因工程菌，具体步骤为：
基因扩增：提取p.agglomerans的基因组dna，采用pcr扩增crte、crtb、crti、crty基因编码框，同时用trizol提取红法夫酵母的总rna，然后用逆转录试剂盒将总rna进行逆转录成cdna模版，然后以此cdna为模板，设计上、下游引物，采用pcr扩增crts、crtr基因编码区；
制备克隆质粒：将crte、crtb、crti、crty、crts、crtr的扩增产物分别与克隆载体pmd18t连接、转化大肠杆菌dh5α，筛选出阳性克隆，发酵后提取得到pmd18t-crte、pmd18t-crtb、pmd18t-crti、pmd18t-crty、pmd18t-crts和pmd18t-crtr克隆质粒；
制备重组表达质粒：利用同尾酶双酶切克隆质粒，验证基因序列与载体连接的方向，连接得到pmd18t-crtebiysr，然后将pmd18t-crtebiysr和pyes2载体经hindiii和xhoi双酶切连接，转化大肠杆菌dh5α，筛选出阳性克隆，得到携带有虾青素合成酶基因的重组质粒；
制备重组微生物源天然虾青素基因工程菌：将重组质粒电转化导入酿酒酵母invsc1菌株中，获得酵母工程菌，该步骤中克隆质粒具有与出发株相同的形态，相同的繁殖过程，因此该工程菌能成功表达出重组虾青素蛋白，表达量高、产量高，得到的重组虾青素为3s,3's构型，该工程菌制备方法具有简单快速高效的优点，同源重组效率高，制备时间短，具有良好的工业应用前景。
作为优选，基因扩增步骤中pcr反应体系为5×phusionhfbuffer5.0ul、template0.1ug、dntp(10mm)0.4ul、phusion/q5dnapolymerase(2.5u/ul)0.25ul、模板dna2.5ng、上下游引物(10um)各1ul、n,n-二甲基乙酰胺0.008-0.012ul、脂肪酸二乙醇酰胺0.002-0.004ul、灭菌蒸馏水加至25ul，pcr反应参数为：98℃预变性30s，98℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃终延伸5min。该pcr反应体系中n,n-二甲基乙酰胺和脂肪酸二乙醇酰胺的特殊存在能够破坏dna分子内碱基对之间的氢键，缩短dna序列的变性时间，降低对酶活性的损害，最大限度地激活taqdna聚合酶的催化活性，进而提高聚合酶的延伸速率，从而有效扩增dna片段，同时能够避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构，避免非特异扩增，提高pcr扩增产物的得率和稳定性，进而保证工程菌能成功、高效表达出虾青素重组蛋白，phusion酶和q5dna聚合酶属于热启动聚合酶，因此预变性和变性温度都选择98℃。
重组微生物源天然虾青素基因工程菌产物的制备方法，其具体步骤为：
步骤1：将活化后工程菌接种至ypd种子培养基中，在温度为28-32℃、转速为200-300r/min的条件下培养10-14h得一级种培养物，然后将一级种培养物按8-12%（v/v）的接种量接种至发酵培养基中，在温度为28-32℃、转速为200-300r/min的条件下培养10-14h，即得二级种，备用，该步骤培养条件和发酵生产的培养条件相近，在细菌细胞培养时，可改善与培养基成分的接触和氧的供应，繁殖比较均一，而且效率也高，不会形成菌膜，也不会形成长菌丝所形成的小球，为发酵罐培养做准备；
步骤2：将二级种按8-12%（v/v）的接种量接种到发酵罐中，在28-32℃的条件下培养3-5d，然后在4000-6000r/min的条件下离心15-25min收集菌体，蒸馏水洗净，即得酵母菌体，备用，该步骤可为菌种提供充足的营养物质和良好的生存繁殖条件，保证菌种的快速繁殖，得到酵母菌体，同时可诱导外源基因鱼干扰素重组蛋白的表达，使其表达量增高，产物稳定，易纯化；
步骤3：在避光的条件下，将酵母菌体中加入stet缓冲液，在1000-1500r/min的条件下磁力搅拌20-30min，然后加入新鲜配制的溶菌酶至其终浓度为100-120μg/ml，搅拌均匀后置于35-40℃的水浴中20-30min，随后加入细胞裂解液于沸水浴中加热10-20min，迅速冷却至室温，然后在10000-15000r/min的条件下离心25-35min，再将上清加入到0.5-0.8倍体积的预冷的异丙醇中，混匀后在-6至-2℃的条件下沉降15-25min，然后在10000-15000r/min的条件下离心10-20min，弃掉上清，用无菌水溶解沉淀，冷冻干燥，即得重组虾青素，上述溶菌酶中含有溶菌酶重量0.30-0.35%的β-环糊精和溶菌酶重量0.01-0.02%的腺嘌呤核苷，溶菌酶的活性部位能够催化分解细菌细胞壁多糖的主要成分n-乙酰氨基葡糖-n-乙酰氨基葡糖乳酸的共聚物，溶菌酶活性部位所在的裂缝能够被6个糖残基装满，只有第四个糖残基的d环因空间原因必须由正常的椅式变为能量较高的半椅式构象，因此该处糖苷键较为脆弱，容易断裂，而组成环糊精的d型吡喃葡萄糖单元都是椅式构象，有助于把半椅式构象转变为椅式构象，提高溶菌酶的稳定性，且腺嘌呤核苷分子结合到溶菌酶表面如芳香族氨基酸等具有较强疏水尾链的氨基酸残基上，阻止溶菌酶蛋白之间的相互作用，避免溶菌酶聚合而使得活性部位被占，使得底物能够顺利进入溶菌酶蛋白的活性部位，最终提高重组虾青素的提取效率和产量，从而降低重组虾青素的成本，该工程菌发酵生产重组虾青素的产量高，生产虾青素的工作效率高，大大节省人力物力成本，且得到的重组虾青素为3s,3's构型，具有较强的抗氧化能力。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：1）本发明工程菌生长繁殖迅速、不具致病性、不会产生毒素、安全可靠、能成功表达出重组虾青素蛋白，表达量高、产量高，得到的重组虾青素为3s,3's构型；2）该工程菌制备方法具有简单快速高效的优点，同源重组效率高，制备时间短，具有良好的工业应用前景；3）该工程菌制备方法用pcr反应体系能够缩短dna序列的变性时间，最大限度地激活taqdna聚合酶的催化活性，同时能够避免序列内有较长的回文结构，提高pcr扩增产物的得率和稳定性；4）该工程菌发酵制备重组虾青素的产量高，生产虾青素的工作效率高，大大节省人力物力成本。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
重组微生物源天然虾青素基因工程菌，其制备方法包括基因扩增、制备克隆质粒、制备重组表达质粒、制备重组微生物源天然虾青素基因工程菌，具体步骤为：
1）基因扩增：提取p.agglomerans的基因组dna，采用pcr扩增crte、crtb、crti、crty基因编码框，同时用trizol提取红法夫酵母的总rna，然后用逆转录试剂盒将总rna进行逆转录成cdna模版，然后以此cdna为模板，设计上、下游引物，采用pcr扩增crts、crtr基因编码区；
2）制备克隆质粒：将crte、crtb、crti、crty、crts、crtr的扩增产物分别与克隆载体pmd18t连接、转化大肠杆菌dh5α，筛选出阳性克隆，发酵后提取得到pmd18t-crte、pmd18t-crtb、pmd18t-crti、pmd18t-crty、pmd18t-crts和pmd18t-crtr克隆质粒；
3）制备重组表达质粒：利用同尾酶双酶切克隆质粒，验证基因序列与载体连接的方向，连接得到pmd18t-crtebiysr，然后将pmd18t-crtebiysr和pyes2载体经hindiii和xhoi双酶切连接，转化大肠杆菌dh5α，筛选出阳性克隆，得到携带有虾青素合成酶基因的重组质粒；
4）制备重组微生物源天然虾青素基因工程菌：将重组质粒电转化导入酿酒酵母invsc1菌株中，获得酵母工程菌，该步骤中克隆质粒具有与出发株相同的形态，相同的繁殖过程，因此该工程菌能成功表达出重组虾青素蛋白，表达量高、产量高，得到的重组虾青素为3s,3's构型，该工程菌制备方法具有简单快速高效的优点，同源重组效率高，制备时间短，具有良好的工业应用前景。
上述基因扩增步骤中pcr反应体系为5×phusionhfbuffer5.0ul、template0.1ug、dntp(10mm)0.4ul、phusion/q5dnapolymerase(2.5u/ul)0.25ul、模板dna2.5ng、上下游引物(10um)各1ul、n,n-二甲基乙酰胺0.012ul、脂肪酸二乙醇酰胺0.0023ul、灭菌蒸馏水加至25ul，pcr反应参数为：98℃预变性30s，98℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃终延伸5min。该pcr反应体系中n,n-二甲基乙酰胺和脂肪酸二乙醇酰胺的特殊存在能够破坏dna分子内碱基对之间的氢键，缩短dna序列的变性时间，降低对酶活性的损害，最大限度地激活taqdna聚合酶的催化活性，进而提高聚合酶的延伸速率，从而有效扩增dna片段，同时能够避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构，避免非特异扩增，提高pcr扩增产物的得率和稳定性，进而保证工程菌能成功、高效表达出虾青素重组蛋白，phusion酶和q5dna聚合酶属于热启动聚合酶，因此预变性和变性温度都选择98℃。
重组微生物源天然虾青素基因工程菌产物的制备方法，其具体步骤为：
步骤1：将活化后工程菌接种至ypd种子培养基中，在温度为32℃、转速为200r/min的条件下培养14h得一级种培养物，然后将一级种培养物按8%（v/v）的接种量接种至发酵培养基中，在温度为32℃、转速为200r/min的条件下培养14h，即得二级种，备用，该步骤培养条件和发酵生产的培养条件相近，在细菌细胞培养时，可改善与培养基成分的接触和氧的供应，繁殖比较均一，而且效率也高，不会形成菌膜，也不会形成长菌丝所形成的小球，为发酵罐培养做准备；
步骤2：将二级种按8%（v/v）的接种量接种到发酵罐中，在32℃的条件下培养3d，然后在6000r/min的条件下离心15min收集菌体，蒸馏水洗净，即得酵母菌体，备用，该步骤可为菌种提供充足的营养物质和良好的生存繁殖条件，保证菌种的快速繁殖，得到酵母菌体，同时可诱导外源基因鱼干扰素重组蛋白的表达，使其表达量增高，产物稳定，易纯化；
步骤3：在避光的条件下，将酵母菌体中加入stet缓冲液，在1500r/min的条件下磁力搅拌20min，然后加入新鲜配制的溶菌酶至其终浓度为120μg/ml，搅拌均匀后置于35℃的水浴中30min，随后加入细胞裂解液于沸水浴中加热10min，迅速冷却至室温，然后在15000r/min的条件下离心25min，再将上清加入到0.8倍体积的预冷的异丙醇中，混匀后在-6℃的条件下沉降25min，然后在10000r/min的条件下离心20min，弃掉上清，用无菌水溶解沉淀，冷冻干燥，即得重组虾青素，上述溶菌酶中含有溶菌酶重量0.30%的β-环糊精和溶菌酶重量0.02%的腺嘌呤核苷，溶菌酶的活性部位能够催化分解细菌细胞壁多糖的主要成分n-乙酰氨基葡糖-n-乙酰氨基葡糖乳酸的共聚物，溶菌酶活性部位所在的裂缝能够被6个糖残基装满，只有第四个糖残基的d环因空间原因必须由正常的椅式变为能量较高的半椅式构象，因此该处糖苷键较为脆弱，容易断裂，而组成环糊精的d型吡喃葡萄糖单元都是椅式构象，有助于把半椅式构象转变为椅式构象，提高溶菌酶的稳定性，且腺嘌呤核苷分子结合到溶菌酶表面如芳香族氨基酸等具有较强疏水尾链的氨基酸残基上，阻止溶菌酶蛋白之间的相互作用，避免溶菌酶聚合而使得活性部位被占，使得底物能够顺利进入溶菌酶蛋白的活性部位，最终提高重组虾青素的提取效率和产量，从而降低重组虾青素的成本，该工程菌发酵生产重组虾青素的产量高，生产虾青素的工作效率高，大大节省人力物力成本，且得到的重组虾青素为3s,3's构型，具有较强的抗氧化能力。
实施例2：
重组微生物源天然虾青素基因工程菌，其制备方法包括基因扩增、制备克隆质粒、制备重组表达质粒、制备重组微生物源天然虾青素基因工程菌，具体步骤为：
1）基因扩增：提取p.agglomerans的基因组dna，采用pcr扩增crte、crtb、crti、crty基因编码框，同时用trizol提取红法夫酵母的总rna，然后用逆转录试剂盒将总rna进行逆转录成cdna模版，然后以此cdna为模板，设计上、下游引物，采用pcr扩增crts、crtr基因编码区；
2）制备克隆质粒：将crte、crtb、crti、crty、crts、crtr的扩增产物分别与克隆载体pmd18t连接、转化大肠杆菌dh5α，筛选出阳性克隆，发酵后提取得到pmd18t-crte、pmd18t-crtb、pmd18t-crti、pmd18t-crty、pmd18t-crts和pmd18t-crtr克隆质粒；
3）制备重组表达质粒：利用同尾酶双酶切克隆质粒，验证基因序列与载体连接的方向，连接得到pmd18t-crtebiysr，然后将pmd18t-crtebiysr和pyes2载体经hindiii和xhoi双酶切连接，转化大肠杆菌dh5α，筛选出阳性克隆，得到携带有虾青素合成酶基因的重组质粒；
4）制备重组微生物源天然虾青素基因工程菌：将重组质粒电转化导入酿酒酵母invsc1菌株中，获得酵母工程菌。
上述基因扩增步骤中pcr反应体系为5×phusionhfbuffer5.0ul、template0.1ug、dntp(10mm)0.4ul、phusion/q5dnapolymerase(2.5u/ul)0.25ul、模板dna2.5ng、上下游引物(10um)各1ul、n,n-二甲基乙酰胺0.008ul、脂肪酸二乙醇酰胺0.004ul、灭菌蒸馏水加至25ul，pcr反应参数为：98℃预变性30s，98℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃终延伸5min。
重组微生物源天然虾青素基因工程菌产物的制备方法，其具体步骤为：
步骤1：将活化后工程菌接种至ypd种子培养基中，在温度为28℃、转速为300r/min的条件下培养10h得一级种培养物，然后将一级种培养物按12%（v/v）的接种量接种至发酵培养基中，在温度为28℃、转速为300r/min的条件下培养10h，即得二级种，备用；
步骤2：将二级种按12%（v/v）的接种量接种到发酵罐中，在28℃的条件下培养5d，然后在4000r/min的条件下离心25min收集菌体，蒸馏水洗净，即得酵母菌体，备用；
步骤3：在避光的条件下，将酵母菌体中加入stet缓冲液，在1000r/min的条件下磁力搅拌30min，然后加入新鲜配制的溶菌酶至其终浓度为100μg/ml，搅拌均匀后置于40℃的水浴中20min，随后加入细胞裂解液于沸水浴中加热20min，迅速冷却至室温，然后在10000r/min的条件下离心35min，再将上清加入到0.5倍体积的预冷的异丙醇中，混匀后在-2℃的条件下沉降15min，然后在15000r/min的条件下离心10min，弃掉上清，用无菌水溶解沉淀，冷冻干燥，即得重组虾青素，上述溶菌酶中含有溶菌酶重量0.35%的β-环糊精和溶菌酶重量0.01%的腺嘌呤核苷。
实施例3：
重组微生物源天然虾青素基因工程菌，其制备方法包括基因扩增、制备克隆质粒、制备重组表达质粒、制备重组微生物源天然虾青素基因工程菌，具体步骤为：
1）基因扩增：提取p.agglomerans的基因组dna，采用pcr扩增crte、crtb、crti、crty基因编码框，同时用trizol提取红法夫酵母的总rna，然后用逆转录试剂盒将总rna进行逆转录成cdna模版，然后以此cdna为模板，设计上、下游引物，采用pcr扩增crts、crtr基因编码区；
2）制备克隆质粒：将crte、crtb、crti、crty、crts、crtr的扩增产物分别与克隆载体pmd18t连接、转化大肠杆菌dh5α，筛选出阳性克隆，发酵后提取得到pmd18t-crte、pmd18t-crtb、pmd18t-crti、pmd18t-crty、pmd18t-crts和pmd18t-crtr克隆质粒；
3）制备重组表达质粒：利用同尾酶双酶切克隆质粒，验证基因序列与载体连接的方向，连接得到pmd18t-crtebiysr，然后将pmd18t-crtebiysr和pyes2载体经hindiii和xhoi双酶切连接，转化大肠杆菌dh5α，筛选出阳性克隆，得到携带有虾青素合成酶基因的重组质粒；
4）制备重组微生物源天然虾青素基因工程菌：将重组质粒电转化导入酿酒酵母invsc1菌株中，获得酵母工程菌。
上述基因扩增步骤中pcr反应体系为5×phusionhfbuffer5.0ul、template0.1ug、dntp(10mm)0.4ul、phusion/q5dnapolymerase(2.5u/ul)0.25ul、模板dna2.5ng、上下游引物(10um)各1ul、n,n-二甲基乙酰胺0.01ul、脂肪酸二乙醇酰胺0.003ul、灭菌蒸馏水加至25ul，pcr反应参数为：98℃预变性30s，98℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃终延伸5min。
重组微生物源天然虾青素基因工程菌产物的制备方法，其具体步骤为：
步骤1：将活化后工程菌接种至ypd种子培养基中，在温度为30℃、转速为250r/min的条件下培养12h得一级种培养物，然后将一级种培养物按10%（v/v）的接种量接种至发酵培养基中，在温度为30℃、转速为250r/min的条件下培养12h，即得二级种，备用；
步骤2：将二级种按10%（v/v）的接种量接种到发酵罐中，在30℃的条件下培养4d，然后在5000r/min的条件下离心20min收集菌体，蒸馏水洗净，即得酵母菌体，备用；
步骤3：在避光的条件下，将酵母菌体中加入stet缓冲液，在1200r/min的条件下磁力搅拌25min，然后加入新鲜配制的溶菌酶至其终浓度为110μg/ml，搅拌均匀后置于38℃的水浴中25min，随后加入细胞裂解液于沸水浴中加热15min，迅速冷却至室温，然后在13000r/min的条件下离心30min，再将上清加入到0.6倍体积的预冷的异丙醇中，混匀后在-4℃的条件下沉降20min，然后在13000r/min的条件下离心15min，弃掉上清，用无菌水溶解沉淀，冷冻干燥，即得重组虾青素，上述溶菌酶中含有溶菌酶重量0.32%的β-环糊精和溶菌酶重量0.016%的腺嘌呤核苷。
重组虾青素产量可达到163.5mg/mg。
对比例1：
基因扩增步骤中pcr反应体系为5×phusionhfbuffer5.0ul、template0.1ug、dntp(10mm)0.4ul、phusion/q5dnapolymerase(2.5u/ul)0.25ul、模板dna2.5ng、上下游引物(10um)各1ul、灭菌蒸馏水加至25ul，pcr反应参数为：98℃预变性30s，98℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃终延伸5min。其余条件和实施例3完全一致。
重组虾青素产量可达到153.8mg/g。
由实施例3和对比例1可知，实施例3中重组虾青素产量高于对比例1，说明pcr反应体系中n,n-二甲基乙酰胺和脂肪酸二乙醇酰胺的特殊存在能够提高重组虾青素产量的表达量，进而提高重组虾青素产量。
实施例4：
重组微生物源天然虾青素基因工程菌产物检测
对实施例3提取的产物进行高相液相色谱(hplc)分析检测，选用的色谱柱为bdshypersilc18(150mm×4.6mm,5μm,thermo)，测定波长为470nm，流速为1ml/min，柱温设置为25℃。流动相为溶剂a：乙腈-水（9:1）；溶剂b：甲醇-异丙醇（3:2），测定条件为：0-15min，0-90%b；15-30min，90%b；30-35min，90-0%b。和标品对比后发现虾青素的出峰时间为5.8min左右，在出峰时间内接出经过c18柱分离的流动相，经过gc-ms质谱esi扫描得到分子量为595.6842的物质，与虾青素的分子量596接近，因此确定为虾青素。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。