一种来源于坚强芽孢杆菌的发酵产物免疫蛋白及其制备工艺的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，设及微生物发酵产物及其提取分离和纯化方法， 特别设及一种来源于坚强芽抱杆菌的发酵产物免疫蛋白及其制备工艺。
【背景技术】
[0002] 人可W通过自身锻炼表现（短跑、跳高等）或注射丙种球蛋白药物增强抗性（免 疫力）或接种疫苗（肝炎、结核、天花、麻疹、水痘等）都控制一些流行疾病的发生，同样植 物体内也存在抗性物质，在植物遭到攻击时也能表现出抗性。1963年匈牙利科学家发现在 研究植物抗性时发现运种现象，但直到1992年才由美国康乃尔大学华裔科学家韦忠民博 ±从梨火疫病蛋白细菌中发现运种物质，并命名为超敏蛋白化arpin)。运一现象的发现，掲 示了植物体内抗性秘密，国际权威科学刊物美国的《Science(科学）》杂志对运一科研成果 做了突出报导，被认为是科学上的重大突破，并得到美国政府的特别资助。1997年，韦忠民 博±与伊甸生物技术公司的专家们共同努力，将运种物质开发成能大面积应用在农作物上 的农用生物技术产品一一超敏蛋白。
[0003] 超敏蛋白是一种新型结构的免疫蛋白，它能调节植物的新陈代谢，启动植物体内 的一系列代谢反应，激活植物自身的免疫系统和生长系统，同时通过诱导和激活植物体内 的抗病基因而增强抗病能力，从而增强农作物抵御病虫侵害和不良环境影响的能力。目前， 世界上已发现可用于防治病、虫、草害等具有农药作用的细菌100余种、真菌500余种、病毒 700余种、再加上微生物代谢的抗生素，其数量真是不计其数，运也为新微生物制剂的开发 提供无穷的生物资源。由于微生物制剂高效、安全、环境相容性好及符合农业可持续发展的 要求，因此，微生物制剂必将成为21世纪农业发展的热点之一，其在农药中所占比重也将 越来越大。
[0004] 芽抱杆菌能够产生广谱的抗菌代谢物质，是±壤和植物微生态的优势微生物种 群，具有很强的抗逆能力和抗菌防病防虫作用，许多性状优良的天然分离株已成功地应用 于植物病害生物防治。截止目前研究发现，因为其结构的多样性，决定了该抗生菌代谢产物 已达到24种之多。芽抱杆菌能分泌多种括抗性物质，包括抗生素、细菌素、细胞壁降解酶类 和其他抗菌蛋白及挥发性抗菌物质等，使其能抵抗多种病原菌的生长和繁殖。因此，对芽抱 杆菌抗菌蛋白的分离纯化具有广阔的市场前景和可行性。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种来源于坚强芽抱杆菌的发酵产物免疫蛋白及其制备 工艺，该免疫蛋白是发明人采用多种生物化学技术，从坚强芽抱杆菌SSL065菌株的发酵产 物中分离纯化而得，可开发成能大面积应用、批量生产的农用植物免疫剂。
[0006] 为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究工艺及其技术参数，最终获得 了如下技术方案：
[0007] 一种来源于坚强芽抱杆菌的发酵产物免疫蛋白的制备工艺，该工艺利用坚强芽抱 杆菌SSL065菌株，通过液体发酵培养出含有免疫蛋白的发酵液，依次采用离屯、、浓缩、硫酸 锭沉淀、低压离子交换层析和液相色谱纯化步骤，从发酵液中分离提纯出免疫蛋白；具体步 骤如下：
[0008] ①发酵上清液提取：发酵液在4°C条件下，W7500-850化/min的转速离屯、，得发酵 上清液；
[0009] ②免疫蛋白的粗提取：向发酵上清液加入硫酸锭粉末，使溶液中的硫酸锭饱和度 达到65%-72%，揽匀，于4°C冰箱中沉淀过夜，然后在140(K)r/min、4°C的条件下离屯、，分离 出沉淀和上清液，将沉淀烘干，W0. 05mol/LpH7. 5的Tris-HCl缓冲液溶解，再用0. 05mol/ LTris-HCl缓冲液透析过夜，得免疫蛋白粗提液；
[0010] ③免疫蛋白的分离纯化：将免疫蛋白粗提液浓缩至原体积的1/5后，采用低压层 析系统做离子交换层析并W紫外检测仪在280nm检测，W25nmol/LpH7. 5的化is-HCl缓 冲液为A液充分溶胀并开始装柱，在W流动率1. 5ml/min洗脱A液来使平衡A280值保持为 0,将免疫蛋白粗提液上样并WA液洗脱，W30s/管收集洗脱液，浓缩后进行HPLC分离纯 化；采用LC-6AD半制备液相色谱仪对低压离子层析分离组分进一步分离纯化，液相色谱仪 的色谱柱型号为250X10mm、5ymKromaislC-18柱，柱溫为25°C，W乙腊/0. 01%S氣乙 酸为流动相，流速为4ml/min，检测波长为230nm，按色谱峰收集洗脱液，真空冷冻干燥后得 到免疫蛋白。
[0011] 优选地，如上所述来源于坚强芽抱杆菌的发酵产物免疫蛋白的制备工艺，其中坚 强芽抱杆菌的液体发酵培养步骤为：取斜面菌种一环到基础培养基中，于37°C、160r/min 的条件下震荡培养18-24小时后，W1:50的接种量接种于装有100mL发酵培养基的250ml S角瓶中，在28°C，280r/min的摇床上培养2d。
[0012] 进一步优选地，如上所述来源于坚强芽抱杆菌的发酵产物免疫蛋白的制备工艺， 其中的基础培养基配方为：牛肉膏0.8%，蛋白腺1%，化Cl0.5%，葡萄糖1.4%，pH7. 5 ;发 酵培养基配方为甘油3 %，膜蛋白腺1 %，聚腺2 %，牛肉浸膏0. 5 %，M拆04. 7肥0 0. 15 %，葡 萄糖 1. 4%，pH7. 5。
[0013] 进一步优选地，如上所述来源于坚强芽抱杆菌的发酵产物免疫蛋白的制备工艺， 其中的步骤③中采用4(TC旋转蒸发的方法进行浓缩。
[0014] 需要说明的是，本发明所采用的坚强芽抱杆菌SSL065菌株公开于中国发明专利 CN101993843A(发明名称：一种坚强芽抱杆菌菌株及其应用），其形态特征描述如下：
[0015] 菌落特征：在普通营养平板上菌落近圆形，较平坦，呈淡灰黄色、半透明、表 面较湿润、较光滑、边缘裂片状。TCBS培养基上可生长，菌落呈绿色，在副溶血弧菌检 测培养基上不生长。细胞特征：革兰氏染色阳性，杆状，两端稍纯圆，无芙膜，大小为 0. 6-0. 7JimXO. 8-1. 0Jim，周生鞭毛。芽抱特征：卵圆形，近中生，抱囊不膨大。
[0016] 另外经测序，本发明分离纯化得到的发酵产物免疫蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO. 1所示。显而易见，对该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而 获得的保守性变异体，也可W实现本发明的技术目的。另外，本发明也提供了编码上述免疫 蛋白的DNA分子。优选地，该DNA分子的核巧酸序列为SEQIDNO. 2。
[0017] 试验研究发现，本发明获得的免疫蛋白能诱发植物自发抵御病虫害，不改变植物 的DM。当免疫蛋白用于植物时，能诱导植物产生防卫反应，具有明显的防病、抗虫、增产效 果，可开发成能大面积应用、批量生产的农用植物免疫剂。因此，本发明还提供了该免疫蛋 白的新用途，即：上述的免疫蛋白在制备抵御病原物的植物免疫剂中的应用。
[001引本发明免疫蛋白一般配制成10%免疫蛋白原液后作为产品分装，使用方法如下： (1)10%免疫蛋白稀释后直接喷雾在叶片，能产生很好效果，特别对作物顶端、新叶、新梢重 点喷雾；将产品原液用清水稀释600-1000倍，产品原液与清水混匀后喷雾使用；(2)作物根 部处理可灌根、沾根；将产品原液用清水稀释300-600倍使用；（3)苗床及疫苗处理：将产 品原液用清水稀释500-800倍，与清水混匀后喷雾使用。
[0019] 与现有技术相比，本发明利用坚强芽抱杆菌SSL065菌株，通过液体发酵培养出含 有免疫蛋白的发酵液，采用离屯、、浓缩、硫酸锭沉淀法、低压层析、液相色谱纯化等技术，从 发酵液中分离提纯出具有防病抗虫的植物免疫蛋白。该工艺制备的免疫蛋白热稳定性好， 能耐受蛋白酶的水解作用等，纯度> 98%。本发明的制备工艺，操作方便，免疫蛋白纯度高， 坚强芽抱杆菌生长速度快，代谢产物产量高，发酵周期短，培养基质消耗少成本低