含锰离子重组蛋白的大肠杆菌表达系统及其应用方法与流程

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及含锰离子重组蛋白的大肠杆菌表达系统及其应用方法。
背景技术：
大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉，可以快速大规模地生产目的蛋白等优点，一直是基因工程中应用最为广泛的表达系统(戎晶晶等.大肠杆菌表达系统的研究进展.药物生物技术,2005,12(6):416-420；解庭波,大肠杆菌表达系统的研究进展.长江大学学报(自然科学版),2008,5(3):77-83)。近年来的研究表明，在科研和工业上被广泛应用的大肠杆菌表达载体主要有pge系列、pqe系列和pet系列，其中目前被广泛应用的高效表达载体是pet，此系统是在大肠杆菌中表达外源蛋白最高效、产量最高、成功率最高的表达载体。它最初是利用与启动子配套并且能高效转录特定基因的外源rna聚合酶构建的t7rna聚合酶/启动子系统，可以从各种基因(包括原核细胞、真核细胞)生产大量的目的蛋白(祁浩等.大肠杆菌表达系统和酵母表达系统的研究进展.安徽农业科学,2016,44(17):4-6)。pet系统有11种不同de3溶原化宿主菌，其中使用最广泛的为bl21及其衍生菌株。rosetta宿主菌从bl21衍生而来，可增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达，从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致的表达限制。尽管大肠杆菌表达系统作为目前应用最广泛的蛋白质表达系统具有较多的优点，但也存在一些不足，常常出现表达的蛋白质形成包涵体或被蛋白酶降解的情况，原因大多是表达的蛋白质没能进行正确的折叠。另外，包涵体蛋白纯化困难，且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。目前有助于提高目的蛋白在大肠杆菌表达系统中可溶性表达的实验方案主要有：(1)降低蛋白合成的速度；(2)改变培养基；(3)与分子伴侣或折叠酶共蛋白表达。大肠杆菌中常用的分子伴侣有：groes-groel、dnak-dnaj-grpe和clpb；大肠杆菌中常用的折叠酶有:ppi's、dsba、dsbc和pdi；(4)分泌表达，使目的蛋白分泌到周质空间。周质空间有折叠酶dsba和dsbc的存在，帮助蛋白正确折叠；(5)使用特定的菌株，如ad494或origami菌株；(6)与可溶性标签蛋白融合表达；(7)体外去折叠，重新折叠。商业化的分子伴侣质粒中应用最多的是takara公司的chaperoneplasmidset，含有五种类型的质粒，每一种质粒都能有效表达不同类型的伴侣蛋白组，各伴侣蛋白组协同作用、共同参与蛋白质折叠。据报道，目的蛋白质与其中一种“chaperoneteam”共同表达，便可增加可溶性蛋白质的回收率而使用通常方法，由于包涵体的形成，这些表达蛋白质常常是不可回收的。以上促进目的蛋白在大肠杆菌表达系统中可溶性表达的实验方案，单独或联合使用对许多在大肠杆菌中形成包涵体的蛋白的可溶性表达是有促进作用的，不同的蛋白适用的方法不一样，需要摸索和优化。对于某些以锰离子为活性中心的复杂酶蛋白，尤其是多亚基的酶，如锰超氧化物歧化酶、精氨酸酶、锰过氧化氢酶、丙酮酸羧化酶、草酸分解酶类(包括有草酸氧化酶、草酸脱羧酶和草酰辅酶a脱羧酶/甲酰辅酶a转移酶等)几乎都是含有2-8个相同亚基的多聚体酶，其中锰超氧化物歧化酶是2聚体(原核生物)或4聚体(真核生物)，精氨酸酶、锰过氧化氢酶和丙酮酸羧化酶都是4亚基，草酸氧化酶多数是6聚体，草酸脱羧酶有3聚体和6聚体，草酰辅酶a脱羧酶是4聚体，甲酰辅酶a转移酶是2聚体。上述聚合物分子量多数在120kda以上，在大肠杆菌中表达通常都形成包涵体，单独使用或联合使用以上方法并不一定能得到可溶表达的蛋白，即使可溶也不一定有酶活性或着活性低。对这些复杂蛋白，找到一种在大肠杆菌中可溶且有活性的表达方案并非易事。利用分子伴侣共表达改善目的蛋白可溶表达所得到的实验结果并不一致，而且迄今为止，伴侣分子的共表达对基因表达的影响似乎都具有蛋白质特异性。目前尚不清楚在基因过度表达的情况下，分子伴侣的体内水平是否受到限制，正常情况下，蛋白质的折叠最终达到一种热力学的稳定状态。特别不稳定的蛋白即使在伴侣分子存在的情况下，或许也不能正确折叠。现在已经明白不同类型的伴侣分子正常情况下是协同发挥作用的。因此，只过度表达单一的伴侣分子可能不太有效。金属蛋白是指以金属离子或者其金属团簇为辅基或辅因子的蛋白质。在蛋白质的整体框架中，有近一半属于金属蛋白。它们的功能多种多样，涉及生物体内稳态调节、电子传递、氧化应激、基因调控、信号转导和物质/能量代谢等各个方面。结构复杂的多聚体活性酶，其活性中心往往带有金属离子或辅因子，这些活性中心的金属离子的正确和充分的与活性中心附近的蛋白亚基结合是保持其完整结构和活性的重要条件。如来源于枯草芽胞杆菌中的草酸脱羧酶(oxdc)是一种含锰离子的单亚基的六聚体酶蛋白，催化草酸脱羧，生成甲酸和co2，每个亚基含有0.86-1.14个锰离子。锰离子主要是mn2+，结合于由3个组氨酸构成的簇上，能够识别和结合草酸阴离子。oxdc每个亚基均有2个结构域和2个锰离子结合位点。oxdc在大肠杆菌中表达时，形成包涵体，在表达和复性过程中调节培养基和buffer中的锰离子浓度对获得有活性的oxdc至关重要。由于大肠杆菌中存在一套完整且精确调控胞内锰离子浓度的锰离子通道蛋白系统，这就会导致随着胞外锰离子浓度增加，胞内的锰离子依然维持一个平衡。金属离子在生命体细胞内的转运、代谢、稳态平衡调控及其相关疾病的研究是生物无机化学、化学生物学和生物医学等研究领域的一个前沿热点。锰被称作“细胞护卫”或“生命体保镖”，在生物体中发挥重要的作用，体内锰离子的含量必须维持在一个恰当的水平，锰缺少或过量都会导致疾病或生物毒性(adilanjemetal..manganeseimportisakeyelementoftheoxyrresponsetohydrogenperoxideinescherichiacoli,molecularmicrobiology(2009)72(4),844–858)。因此，生物体内锰离子的稳态平衡调控对维持体内锰离子的正常生理功能至关重要。锰的内稳态平衡主要涉及四类蛋白质(李威，谭相石.锰离子转运、代谢与稳态平衡调控.生命科学,2012,24(8):867-880)：膜转运蛋白(transporter)、伴侣蛋白(metallochaperone)、锰储存或者利用蛋白(storageormetalloenzyme)、锰转录调节蛋白(regulatoryprotein)。在大肠杆菌中共表达分子伴侣和含锰离子的酶蛋白，同时过表达或抑制锰离子通道相关蛋白表达或影响胞内锰离子浓度相关的蛋白，以促进含锰离子的酶蛋白的可溶且有活性表达的研究，目前尚未有文献报道。技术实现要素：针对现有技术中，在大肠杆菌中表达含锰离子重组蛋白常常得到无活性的包涵体，且复性工艺复杂，成本高的问题，本发明的目的之一是提供含锰离子重组蛋白的大肠杆菌表达系统，该系统包含大肠杆菌菌株和对应的质粒，利用该系统可以生产可溶且有活性的含锰离子的酶蛋白。本发明的另一目的在于提供所述大肠杆菌表达系统高效表达含锰离子酶蛋白的方法。本发明提供的技术方案与现有的技术相比具有以下优势：(1)大肠杆菌表达的含锰离子重组蛋白大部分是可溶且有活性的；(2)含锰离子重组蛋白分离纯化工艺简单；(3)总生产成本低。为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：本发明提供含锰离子重组蛋白的大肠杆菌表达系统，所述大肠杆菌表达系统中的重组表达质粒为以下几种情形之一或其组合：(1)至少包含大肠杆菌分子伴侣基因和含锰离子的酶蛋白基因；(2)包含大肠杆菌分子伴侣基因、含锰离子的酶蛋白基因，以及过表达或抑制锰离子通道相关蛋白基因，即过表达促进锰离子泵入相关的通道蛋白/调控蛋白基因中的任意一种或多种组合，或，敲除或抑制或失活锰离子泵出蛋白/锰离子负反馈抑制调控相关蛋白基因中的任意一种多种组合；(3)包含大肠杆菌分子伴侣基因、含锰离子的酶蛋白基因，以及过氧化氢酶蛋白基因。所述锰离子通道相关蛋白包含有：锰离子泵入蛋白mnth，锰离子泵出蛋白mntp，锰离子伴侣蛋白mnts，锰转录调节蛋白mntr、oxyr(大肠杆菌抗氧化系统的调节因子)和fur(与mn2+结合抑制fe2+转运通道蛋白feo表达)等；此外，胞内h2o2浓度，清除氧自由基的超氧化物歧化酶活力、过氧化物酶和过氧化氢酶活力，胞内和胞外fe2+浓度等，都会影响胞内锰离子浓度。目前的大肠杆菌表达系统常常出现表达的蛋白质形成包涵体或被蛋白酶降解的情况，表达产物的生物活性较低。尤其是对于某些以锰离子为活性中心的多亚基酶，为了目的蛋白的可溶性表达，在某些情况下，共表达与靶蛋白来源相同的伴侣分子可能是必要的。本发明还发现过表达促进胞内锰离子浓度升高的相关蛋白基因(如锰离子泵入蛋白基因等)或抑制使胞内锰离子浓度降低的相关蛋白基因(如锰离子泵出蛋白等)有助于提高含锰离子重组蛋白的可溶性表达。优选的，所述促进锰离子泵入相关的通道蛋白基因为来源于大肠杆菌的mnth蛋白或所述mnth蛋白来源于其他物种的同源蛋白；所述促进锰离子泵入相关的调控蛋白基因为来源于大肠杆菌的mnts/oxyr蛋白，或所述mnts/oxyr蛋白来源于其他物种的同源蛋白。为提高含锰离子酶蛋白的可溶且有活性的表达效果，更优选的，过表达所述促进锰离子泵入相关的调控蛋白基因mnts/oxyr蛋白基因；最优选的，过表达oxyr蛋白基因。优选的，所述锰离子泵出蛋白为来源于大肠杆菌的mntp蛋白或所述mntp蛋白来源于其他物种的同源蛋白；所述锰离子负反馈抑制调控相关蛋白为来源于大肠杆菌的锰离子转录调节蛋白mntr蛋白或所述mntr蛋白来源于其他物种的同源蛋白。为提高含锰离子酶蛋白的可溶且有活性的表达效果，更优选的，敲除/抑制/失活mntp蛋白基因。优选的，所述分子伴侣基因为dnak-dnaj-grpe、groes-groel、groes-groel-tig或tig中的任意一种或多种。更优选的，所述分子伴侣基因为groes-groel或/和groes-groel-tig，最优选的，所述分子伴侣基因为groes-groel。构建表达分子伴侣基因的大肠杆菌菌株，表达分子伴侣的质粒可以选用takara公司的chaperoneplasmidset系列质粒，包括pg-kje8、pgro7、pkje7、pg-tf2和ptf16；优选分子伴侣质粒为pg-kje8、pgro7或pg-tf2，最优选分子伴侣质粒为pgro7。大肠杆菌重组菌株的原始宿主菌株可选自商业化的菌株bl21(de3)、bl21trxb(de3)、rosetta(de3)、origami2(de3)、origamib(de3)、rosetta-gami2(de3)、rosetta-gamib(de3)等，优选bl21(de3)和origami2(de3)菌株，更优选origami2(de3)菌株。优选的，所述含锰离子的酶蛋白基因包括草酸分解酶类基因、精氨酸酶基因、锰超氧化物歧化酶基因或锰过氧化氢酶基因中的任意一种或多种。更优选的，所述含锰离子的酶蛋白基因为如序列seqidno.1所示的草酸脱羧酶基因a2，或如序列seqidno.2所示的草酸脱羧酶基因vl3，或如序列seqidno.3所示的草酸氧化酶基因b10，或如序列seqidno.4所示的人精氨酸酶基因arg1，或如序列seqidno.5所示的人锰超氧化物歧化酶基因hmn-sod中的任意一种或多种。上述基因均可通过全基因合成。优选的，所述分子伴侣基因/锰离子通道相关蛋白基因前的启动子采用相同或不同的中等强度的启动子或弱启动子；所述的启动子序列为如序列seqidno.6所示的p43启动子序列，或如序列seqidno.7所示的m1-93启动子，或如序列seqidno.8所示的arabad启动子，或如序列seqidno.9所示的lac启动子中的任意一种。上述基因均可通过全基因合成。为提高大肠杆菌重组菌株培养过程中胞内的锰离子浓度，容易想到的方案是增加重组菌株培养时培养基中锰离子浓度，但由于大肠杆菌胞内的锰离子受到多种调控蛋白和离子的精确调控，胞内的锰离子浓度达到平衡态以后不会随着胞外的锰离子浓度升高而上升，这种方法往往是不起作用的。当胞外环境中锰离子浓度足够高(大于胞内的锰离子稳态时浓度)的情况下，研究并获得了以下技术方案：本发明还提供所述大肠杆菌表达系统高效表达含锰离子酶蛋白的方法，所述大肠杆菌表达系统诱导表达含锰离子酶蛋白时，进行以下处理中的任意一种或多种组合：①过表达所述分子伴侣基因和含锰离子的酶蛋白基因；②过表达促进锰离子泵入相关的通道蛋白/调控蛋白基因；③敲除或抑制或失活锰离子泵出蛋白/锰离子负反馈抑制调控相关蛋白基因；④过表达过氧化氢酶基因或敲除某个基因降低胞内h2o2含量。更优选的，处理②具体包括：a、过表达来源于大肠杆菌的锰离子泵入蛋白mnth或与该蛋白有类似功能的其他物种的同源蛋白；b、过表达来源于大肠杆菌的锰离子伴侣蛋白mnts或与该蛋白有类似功能的其他物种的同源蛋白；c、过表达来源于大肠杆菌的oxyr蛋白或与该蛋白有类似功能的其他物种的同源蛋白；处理③具体包括：d、敲除或抑制或失活来源于大肠杆菌的锰离子泵出蛋白mntp；e、敲除或抑制或失活来源于大肠杆菌的锰转录调节蛋白mntr。上述方案中若采用单一方案，更优选的方案是处理②中a～c的任意一种，其中更优选方案为b或c，最优选方案为c；上述方案中若采用组合方案，更优选的方案是a+b、a+d、b+e、b+c组合中的任意一种，其中更优选的为a+b或b+c组合，最优选方案为b+c组合。优选的，所述大肠杆菌表达系统诱导表达含锰离子酶蛋白时，所使用培养基为lb培养基或jl培养基，所述jl培养基包含：酵母提取物0.5-1％(w/v)，胰蛋白胨1-2％(w/v)，kh2po410-25mm，(nh4)2so410-50mm，甘露醇1-3％(w/v)，丁二酸钠5-30mm，mgso40.1-0.6mm，起始ph6.5。优选的，所述大肠杆菌表达系统诱导表达含锰离子酶蛋白时，向所述培养基中补加mncl2或mnso4的终浓度为1-10mm。与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过选择理想的分子伴侣蛋白、优化提高大肠杆菌胞内的锰离子浓度的方法、三种蛋白共表达、优化培养基组成等手段，新构建了含锰离子重组蛋白的大肠杆菌表达系统，提供了多种可选择的更优化的大肠杆菌工程菌表达含锰离子的重组蛋白的生产工艺，这同时也为最终找到表达含锰离子的重组蛋白的最优组合提供了一个可能的发展方向和技术路线。与传统的大肠杆菌表达体系相比较，本发明所发展的表达体系将含锰离子的重组蛋白的活力提高了数十倍以上，为含锰离子的重组蛋白在大肠杆菌中的大规模工业化生产提供了有益的理论及实践依据。附图说明图1为含锰离子的酶蛋白基因重组表达质粒的设计示意图。图2为草酸脱羧酶a2基因表达质粒pet28a-a2图谱。图3为草酸脱羧酶a2基因表达质粒pet28a-a2-mnth图谱。图4为实施例5不同菌株表达草酸脱羧酶a2的对比；样品编号说明如下：1#pet28a-a2/bl21(de3)全液2#pet28a-a2/bl21(de3)上清3#pet28a-a2-mnth/bl21(de3)全液4#pet28a-a2-mnth/bl21(de3)上清5#(pet28a-a2-mnthpg-kje8)/bl21(de3)全液6#(pet28a-a2-mnthpg-kje8)/bl21(de3)上清7#(pet28a-a2-mnthpgro7)/bl21(de3)全液8#(pet28a-a2-mnthpgro7)/bl21(de3)上清9#(pet28a-a2-mnthpkje7)/bl21(de3)全液10#(pet28a-a2-mnthpkje7)/bl21(de3)上清11#(pet28a-a2-mnthpg-tf2)/bl21(de3)全液12#(pet28a-a2-mnthpg-tf2)/bl21(de3)上清13#(pet28a-a2-mnthptf16)/bl21(de3)全液14#(pet28a-a2-mnthptf16)/bl21(de3)上清15#(pet28a-a2pg-kje8)/bl21(de3)全液16#(pet28a-a2pg-kje8)/bl21(de3)上清17#(pet28a-a2pgro7)/bl21(de3)全液18#(pet28a-a2pgro7)/bl21(de3)上清19#(pet28a-a2pkje7)/bl21(de3)全液20#(pet28a-a2pkje7)/bl21(de3)上清21#(pet28a-a2pg-tf2)/bl21(de3)全液22#(pet28a-a2pg-tf2)/bl21(de3)上清23#(pet28a-a2ptf16)/bl21(de3)全液24#(pet28a-a2ptf16)/bl21(de3)上清。图5为实施例6不同菌株表达草酸脱羧酶a2的对比；样品编号说明如下：1#(pet28a-a2-mnthpgro7)/bl21(de3)全液2#(pet28a-a2-mnthpgro7)/bl21(de3)上清3#(pet28a-a2-mntspgro7)/bl21(de3)全液4#(pet28a-a2-mntspgro7)/bl21(de3)上清5#(pet28a-a2-oxyrpgro7)/bl21(de3)全液6#(pet28a-a2-oxyrpgro7)/bl21(de3)上清7#pgro7/bl21(de3)全液8#pgro7/bl21(de3)上清。图6为实施例7不同菌株表达草酸脱羧酶a2的对比；样品编号说明如下：1#pgro7/origami2(de3)全液2#pgro7/origami2(de3)上清3#(pet28a-a2pgro7)/origami2(de3)全液4#(pet28a-a2pgro7)/origami2(de3)上清5#(pet28a-a2pgro7)/origami2(de3mntp::bleor)全液6#(pet28a-a2pgro7)/origami2(de3mntp::bleor)上清7#(pet28a-a2pgro7)/origami2(de3mntr::bleor)全液8#(pet28a-a2pgro7)/origami2(de3mntr::bleor)上清。图7为草酸脱羧酶a2基因表达质粒pgel-mnth-a2图谱。图8为草酸脱羧酶a2基因表达质粒pgel-mnth-mnts-a2图谱。图9为实施例9不同菌株破碎液上清草酸脱羧酶活力的对比；样品编号说明如下：1#pgel-mnth-a2/origami2(de3)上清2#pgel-mnth-mnts-a2/origami2(de3)上清3#pgel-mnth-a2/bl21(de3)上清4#pgel-mnth-mnts-a2/bl21(de3)上清。具体实施方式下面将结合本发明中的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，以下实施例是为了更好地说明阐述本发明的内容。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本发明将含锰离子的酶蛋白基因插入到大肠杆菌表达载体中，所述大肠杆菌表达载体可以是pet系列、pcold系列、pgex系列载体或其他能用于大肠杆菌系统中表达蛋白的载体。下述实施例中以pet系列载体中常用的pet-28a(+)载体和a2基因为例来构建表达锰离子蛋白重组质粒，用其它基因作为测试该大肠杆菌表达系统的效果。所述a2基因对应的氨基酸序列如seqidno.16所示，vl3基因对应的氨基酸序列(来源于金针菇的草酸脱羧酶vel)如seqidno.17所示，草酸氧化酶基因b10对应的氨基酸序列如seqidno.18所示，agr1基因对应的氨基酸序列如seqidno.19所示，hmn-sod基因对应的氨基酸序列如seqidno.20所示。本发明实施例中表达分子伴侣的质粒和分别转化一种伴侣蛋白质粒的escerichiacolibl21制成的感受态细胞来自takara公司，本发明中用到的其它大肠杆菌菌株和质粒通过国内外出售常规生物材料的公司购买；本发明中用到的分子生物学试剂从thermofisher公司和toyobo公司购买；无缝克隆试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司(http://www.vazyme.com/)；其它常用生化试剂均是市售分析纯；pcr产物回收和胶回收dna的方法均采用omega公司的试剂盒的方法。实施例中草酸氧化酶活力的测定方法采用hplc检测方法，具体步骤如下：用50mm柠檬酸-naoh(ph5.0)与100mm草酸储备液按比例混合，分别配制成0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1mm草酸标准溶液；取10-20μl的含草酸氧化酶的溶液(蛋白浓度0.1-0.2mg/ml)，加入1ml的2.5mm草酸溶液中(ph5.5)中，37℃，800rpm恒温混匀仪反应20min，加入50μl的2.5mh2so4终止反应。样品处理：①将终止反应后的样品12000rpm离心10min，取上清转入液相进样瓶；②将样品12000rpm离心10min取上清用0.45μm膜过滤至液相进样瓶中。检测条件：进样量20μl；柱温：55℃；流动相：2.5mmh2so4；流速0.6ml/min；色谱柱：sepaxcarbomixh-np10:0.5％；采样时间22min。测定草酸标准样品，通过液相图谱得出相应浓度的样品对应的相应积分面积绘制标准曲线。将处理后的样品通过hplc进行检测，并对得到的数据图谱进行处理，得出相对应的草酸面积，计算酶活单位可根据草酸的减少量来衡量。酶活力单位定义为每分钟消耗1μmol的草酸或生成1μmol的甲酸所需的酶量定义为1个活力单位。实施例中精氨酸酶活力的测定采用脂肪酸试剂法测定该酶催化精氨酸时释放出的尿素量，计算出精氨酸酶，37℃下每分钟催化产生1μmol尿素的酶量为1个活力单位(郑迎迎.人i型精氨酸酶基因的克隆及表达,南京理工大学，2006)。实施例中hmn-sod活力的测定方法采用改良的连苯三酚自氧化测定超氧化物歧化酶活性(邓碧玉,袁勤生,李文杰.改良的连苯三酚自氧化测定超氧化物歧化酶活性的方法.生化与生物物理进展,1991,18(2):89),蛋白浓度测定采用bsa试剂盒，hmn-sod活力除以蛋白浓度即得到比活力的数据。实施例1含锰离子的酶蛋白基因表达框的设计本实施例中构建的共表达大肠杆菌分子伴侣基因、含锰离子的酶蛋白基因和促进锰离子泵入相关的通道蛋白基因的通用型载体的模式图如图1所示。其中的启动子1和启动子2为可以在大肠杆菌中启动分子伴侣基因和锰离子通道相关蛋白基因表达的中等强度启动子或弱启动子，例如p43启动子序列(seqidno.6，来自枯草芽胞杆菌)，m1-93启动子(seqidno.7)，arabad启动子(seqidno.8)和lac启动子(seqidno.9)。启动子1和启动子2可以为相同的启动子，也可以选用不同的启动子。所述的分子伴侣基因为dnak-dnaj-grpe，groes-groel，groes-groel-tig或tig中的一种或多种。锰离子通道相关蛋白为来自于mnth，mnts，oxyr和过氧化氢酶蛋白等中的一种或几种的组合。实施例2草酸脱羧酶a2基因表达质粒pet28a-a2构建以全基因合成的a2基因(seqidno.1)为模版，设计引物对f1/r1，对该基因进行扩增，对扩增产物进行胶回收纯化，方法参照市售dna小量纯化试剂盒说明书的方法，最终得到dna片段1(即a2基因片段)。pcr体系为：10×pcrbuffer5μl，2mmdntp5μl，25mmmgso45μl，10μmprimerf/r各1.5μl，模版dna0.5μl，kod-plus-neo1μl，ddh2o32.5μl；pcr反应条件如下：94℃3min,30个循环(98℃10s，60℃30s，68℃35s)，68℃5min，4℃保温10min；以下载体构建的叙述中pcr体系与上述叙述都是一致的，下面不再赘述，pcr反应条件略有不同，主要是退火温度和延伸时间不同。以商业化购买的pet-28a质粒为模版，设计引物对f2/r2对，对质粒进行扩增，pcr反应条件中退火温度55℃，延伸时间5min，其它条件与上述a2基因扩增的pcr条件一样，扩增产物用限制性内切酶dpni在37℃消化2h(50μl体系，反应条件参照说明书)，对消化后的扩增产物进行胶回收纯化，最终得到dna片段2(即pet-28a片段)。通过无缝克隆试剂盒的方法，采用无缝克隆试剂盒说明书的方法，于冰水浴中配制如下表的反应体系，将上述dna片段1和dna片段2连接起来，转化大肠杆菌dh5α。ddh2oupto20μl5xbuffer4μldna片段2(即pet-28a片段)80ngdna片段1(即a2基因片段)50ng重组酶2μl用inoue法制备dh5α超级感受态，方法参考《分子克隆实验指南(第3版)》，涂布到含有50μg/ml卡那霉素的抗性lb固体培养基平板上筛选，通过pcr验证和测序验证阳性克隆子，测序正确的重组质粒命名为pet28a-a2(图2)；上述所用引物序列如下：f1：5’-agaaggagatataccatggctccagcaccttccag-3’r1：5’-gttagcagccggatcctaagcaggaccgaccacaat-3’f2：5’-gatccggctgctaacaaagc-3’r2：5’-ggtatatctccttcttaaag-3’实施例3分子伴侣过表达菌株构建将5种商业化的分子伴侣质粒pg-kje8、pgro7、pkje7、pg-tf2和ptf16转化商业化的菌株，在含20μg/ml的lb固体培养基平板上筛选阳性克隆子，以bl21(de3)和origami2(de3)表达菌株为宿主菌进行构建分子伴侣过表达菌株。感受态细胞制备和大肠杆菌转化参考《分子克隆实验指南(第3版)》，得到系列菌株：pg-kje8/bl21(de3)，pgro7/bl21(de3)，pkje7/bl21(de3)，pg-tf2/bl21(de3)，ptf16/bl21(de3)，pg-kje8/origami2(de3)，pgro7/origami2(de3)，pkje7/origami2(de3)，pg-tf2/origami2(de3)和ptf16/origami2(de3)。实施例4a2蛋白和锰离子通道相关蛋白共表达载体的构建以合成的p43启动子dna(seqidno.6)片段为模板，设计引物对f3/r3进行扩增，产物纯化后得到dna片段3；采用细菌基因组dna提取试剂盒提取大肠杆菌jm109的基因组dna，以大肠杆菌k12mg1655菌株的基因组dna为模板，设计引物对f4/r4扩增mnth基因(seqidno.10)，扩增产物经过dna纯化试剂盒的方法纯化后得到dna片段4；以合成的终止子(seqidno.11)为模板，设计引物对f5/r5进行扩增，产物纯化后得到dna片段5；以质粒pet28a-a2为模板，设计引物f6/r6进行扩增，产物纯化后得到dna片段6；通过无缝克隆试剂盒的方法将上述dna片段3、4、5和6连接起来，转化大肠杆菌dh5α，涂布到含有50μg/ml卡那霉素的抗性lb固体培养基平板上筛选，通过pcr验证和测序验证阳性克隆子，测序正确的载体命名为pet28a-a2-mnth(图3)。本实例中所用pcr扩增和无缝克隆的体系和方法与实施例2类似，此处不在赘述。上述所用引物序列如下：f3：5’-ggatctcaactcgagtgataggtggtatgttttcg-3’r3：5’-gcgatagttcgtcatcgttcatgtctcctttttta-3’f4：5’-aaggagacatgaacgatgacgaactatcgcgttga-3’r4：5’-tagtgctcgaattcattacaatcccagtgccgtac-3’f5：5’-gcactgggattgtaatgaattcgagcactagtgca-3’r5：5’-aggatcttcaagcttggaaggaaatgatgacctcg-3’f6：5’-aagcttgaagatcctttgatc-3’r6：5’-ctcgagttgagatcctttttttc-3’以大肠杆菌k12mg1655菌株的基因组dna为模板，设计引物对f7/r7扩增mnts基因(seqidno.12)，扩增产物经过dna纯化试剂盒的方法纯化后得到dna片段7；以pet28a-a2-mnth质粒为模版，设计引物对f8/r8进行扩增，产物纯化后得到dna片段8；通过无缝克隆试剂盒的方法将上述dna片段7和8连接起来，转化大肠杆菌dh5α，涂布到含有50μg/ml卡那霉素的抗性lb固体培养基平板上筛选，通过pcr验证和测序验证阳性克隆子，测序正确的载体命名为pet28a-a2-mnts。上述所用引物序列如下：f7：5’-aaggagacatgaacgatgaatgagttcaagaggtg-3’r7：5’-tagtgctcgaattcattatttatcggaaggtttat-3’f8：5’-taatgaattcgagcactagtgcagc-3’r8：5’-catcgttcatgtctccttttttatg-3’以大肠杆菌k12mg1655菌株的基因组dna为模板，设计引物对f9/r9扩增oxyr基因(seqidno.13)，扩增产物经过dna纯化试剂盒的方法纯化后得到dna片段9；以pet28a-a2-mnth质粒为模版，设计引物对f8/r8进行扩增，扩增产物纯化后得到dna片段10；通过无缝克隆试剂盒的方法将上述dna片段9和10连接起来，转化大肠杆菌dh5α，涂布到含有50μg/ml卡那霉素的抗性lb固体培养基平板上筛选，通过pcr验证和测序验证阳性克隆子，测序正确的载体命名为pet28a-a2-oxyr。上述所用引物序列如下：f9：5’-aaggagacatgaacgatgaatattcgtgatcttgag-3’r9：5’-tagtgctcgaattcattaaaccgcctgttttaaaac-3’实施例5a2蛋白、分子伴侣蛋白和mnth蛋白共表达测试按照质粒小提试剂盒方法提取pet28a-a2和pet28a-a2-mnth质粒dna，分别转化大肠杆菌bl21(de3)菌株，涂布到含有50μg/ml卡那霉素的抗性lb固体培养基平板上筛选，通过pcr验证阳性克隆子，得到重组菌株pet28a-a2/bl21(de3)和pet28a-a2-mnth/bl21(de3)。将pet28a-a2和pet28a-a2-mnth质粒分别转化实施例3获得的分子伴侣过表达菌株pg-kje8/bl21(de3)，pgro7/bl21(de3)，pkje7/bl21(de3)，pg-tf2/bl21(de3)和ptf16/bl21(de3)，涂布到含有20μg/ml氯霉素和50μg/ml卡那霉素的抗性lb固体培养基平板上筛选，通过pcr验证阳性克隆子，得到重组菌株(pet28a-a2-mnthpg-kje8)/bl21(de3)，(pet28a-a2-mnthpgro7)/bl21(de3)，(pet28a-a2-mnthpkje7)/bl21(de3)，(pet28a-a2-mnthpg-tf2)/bl21(de3)，(pet28a-a2-mnthptf16)/bl21(de3)，(pet28a-a2pg-kje8)/bl21(de3)，(pet28a-a2pgro7)/bl21(de3)，(pet28a-a2pkje7)/bl21(de3)，(pet28a-a2pg-tf2)/bl21(de3)和(pet28a-a2ptf16)/bl21(de3)。将抗性平板上的单克隆接种到lb液体种子培养基(酵母提取物0.5％(w/v),胰蛋白胨1％(w/v),nacl1％(w/v),20μg/ml氯霉素,50μg/ml卡那霉素)中培养至od600＝1.0-1.2，以2％(v/v)的接种量接种到jl培养基(酵母提取物0.75％(w/v)，胰蛋白胨1.5％(w/v)，kh2po415mm，(nh4)2so425mm，甘露醇1.8％(w/v)，丁二酸钠20mm，mgso40.25mm,起始ph6.5.)中，培养温度37℃，摇床转速150转每分钟，培养至od600达到1.0开始诱导，并补加诱导物，所有菌株均需要补加终浓度为0.5mm的iptg和终浓度为5mm的mncl2或mnso4，表达分子伴侣的菌株还需额外补加l-阿拉伯糖0.6mg/ml或5ng/ml四环素或两者都要加(具体参照分子伴侣质粒说明书)，诱导时降低温度到28℃，培养至od600到8.0左右停止培养，取1.5ml菌液13000g离心5min，去上清，加入1.5ml0.9％生理盐水清洗菌体一次，13000g离心5min，去上清，加入1.5ml50mmtris-hcl(8.0)的buffer，充分悬浮菌体后超声裂解。取细胞裂解液全液和上清酶活力检测。草酸脱羧酶酶活力测定方法采用hplc法(mkesarwanietal.thejournalofbiologicalchemistry,2000,275:7230-7238)。摇瓶发酵结果发现，a2基因单独表达以及a2基因与mnth共表达的菌株，无论是细胞破碎液全液还是细胞破碎液上清都没有草酸脱羧酶活力(图4)；a2基因与mnth共表达的质粒转入过表达分子伴侣的菌株pg-kje8/bl21(de3)、pgro7/bl21(de3)和pg-tf2/bl21(de3)，才能在细胞破碎液全液和上清中检测到活性；a2基因和分子伴侣共表达的菌株，同样也是只有含有pg-kje8、pgro7和pg-tf2的菌株的细胞破碎液全液和上清有较弱的活性。由酶活力数据可以看出，不可溶的蛋白几乎是没有活性的，分子伴侣质粒pgro7的表达效果最好，故本发明所述的分子伴侣基因优选为来自pgro7质粒的groes-groel，即大肠杆菌中mnth的过表达和groes-groel分子伴侣的适量表达有助于草酸脱羧酶形成可溶和有活性的蛋白。实施例6mnth、mnts和oxyr过表达对a2蛋白表达的影响按照质粒小提试剂盒方法提取实施例4获得的pet28a-a2-mnth、pet28a-a2-mnts和pet28a-a2-oxyr质粒dna，分别转化分子伴侣表达菌株pgro7/bl21(de3)，涂布到含有50μg/ml卡那霉素和20μg/ml氯霉素的抗性lb固体培养基平板上筛选，通过pcr验证阳性克隆子，得到重组菌株(pet28a-a2-mnthpgro7)/bl21(de3),(pet28a-a2-mntspgro7)/bl21(de3)和(pet28a-a2-oxyrpgro7)/bl21(de3)。采用与实施例5中相同的培养基和表达条件进行表达，pgro7/bl21(de3)菌株作为对照，酶活力结果如图5所示。由图5可知oxyr过表达对促进a2蛋白可溶且有活性的表达效果最好，mnts次之。实施例7mntp和mntr基因的失活大肠杆菌中基因敲除的方法很多，本实施例中选择最简单的插入失活方法，通过将mntp和mntr基因的上游和下游150bp的片段与抗性基因融合，得到融合片段，将其转化大肠杆菌既可以通过抗性平板筛选，筛选到mntp和mntr基因的失活的阳性克隆子。方便起见，采用全基因合成的方法合成mntp基因的上游100bp片段(mntpup100)，来自于毕赤酵母表达载体ppiczαa的zeocin抗性基因(bleor)和mntp基因的下游100bp片段(mntpdown100)这三个dna片段的融合dna片段(mntpup100-bleor-mntpdown100)，同样的方法合成(mntrup100-bleor-mntrdown100)融合dna片段。将融合片段mntpup100-bleor-mntpdown100(如序列seqidno.14所示)和mntrup100-bleor-mntrdown100(如序列seqidno.15所示)分别转化pgro7/origami2(de3)菌株，涂布到固态lb培养基(酵母提取物0.5％(w/v)，蛋白胨1％(w/v)，nacl0.5％((w/v)，zeocin浓度25μg/ml，琼脂糖2％，ph7.5)平板上，筛选阳性菌株，通过菌液pcr和测序验证，最终得到的阳性菌株命名为：pgro7/origami2(de3mntp::bleor)和pgro7/origami2(de3mntr::bleor)。验证mntp基因的引物为：f10：5’-tgcatcaatcggtaaaggtg-3’r10：5’-gaagtgcgtccagaggatct-3’验证mntr基因的引物为：f11：5’-aagtgacgcagttagtgaacg-3’r11：5’-caccgtgtttctgggtaaac-3’按照质粒小提试剂盒的方法提取pet28a-a2质粒dna转化pgro7/origami2(de3)，pgro7/origami2(de3mntp::bleor)和pgro7/origami2(de3mntr::bleor)菌株，涂布到含有50μg/ml卡那霉素的抗性lb固体培养基平板上筛选，通过pcr验证阳性克隆子，得到重组菌株(pet28a-a2pgro7)/origami2(de3)，(pet28a-a2pgro7)/origami2(de3mntp::bleor)和(pet28a-a2pgro7)/origami2(de3mntr::bleor)菌株。采用与实施例5中相同的培养基和表达条件进行表达，pgro7/origami2(de3)菌株作为对照，酶活力结果如图6所示。mntp基因和mntr基因的失活均有助于提高a2蛋白在大肠杆菌中的表达活性，且mntp基因失活时的表达活性好于mntr基因失活时的表达活性，但效果差于过表达mnth，mnts和oxyr对a2蛋白的提高。实施例8pgel-mnth-a2和pgel-mnth-mnts-a2载体构建为了进一步优化a2蛋白在大肠杆菌中的表达，提高重组菌株的稳定性，降低质粒的丢失率，促进a2的表达，将分子伴侣基因、a2基因和锰离子通道相关蛋白(mnth、mnts、oxyr等)基因构建在同一个载体上，并尝试不同锰离子通道蛋白组合对a2表达的影响。以pgro7质粒dna为模板，设计引物对f12/r12扩增分子伴侣基因簇groes-groel，扩增产物经过dna纯化试剂盒的方法纯化后得到dna片段11；以pet28a-a2-mnth质粒为模版，以引物f8/r8进行扩增，产物纯化后得到dna片段12；将上述dna片段11和12通过无缝克隆试剂盒的方法连接起来，转化大肠杆菌dh5α，涂布到含有50μg/ml卡那霉素的抗性lb固体培养基平板上筛选，通过pcr验证阳性克隆子，测序正确的载体命名为pgel-a2。以合成的m1-93启动子序列(seqidno.7)为模版，设计引物对f13/r13扩增,扩增产物经过dna纯化试剂盒的方法纯化后得到dna片段13；pet28a-a2-mnth质粒为模版，设计引物对f14/r14扩增包含mnth和终止子的dna片段，产物纯化后得到dna片段14；以pgel-a2质粒dna为模版，设计引物对f15/r15扩增线性化的载体，产物纯化后得到dna片段15；通过无缝克隆试剂盒的方法将上述dna片段13、14和15连接起来，转化大肠杆菌dh5α，涂布到含有50μg/ml卡那霉素的抗性lb固体培养基平板上筛选，通过pcr验证和测序验证阳性克隆子，测序正确的载体命名为pgel-mnth-a2(图7)。以pet28a-a2-mnts质粒为模版，以引物f16/r16进行扩增，产物纯化后得到dna片段16；以pgel-mnth-a2质粒dna为模版，设计引物对f17/r17扩增线性化的载体，产物纯化后得到dna片段17；通过无缝克隆试剂盒的方法将上述dna片段16和17连接起来，转化大肠杆菌dh5α，涂布到含有50μg/ml卡那霉素的抗性lb固体培养基平板上筛选，通过pcr验证和测序验证阳性克隆子，测序正确的载体命名为pgel-mnth-mnts-a2(图8)。上述所用引物序列如下：f12：5’-aaggagacatgaacgatgaatattcgtccattgc-3’r12：5’-tagtgctcgaattcattacatcatgccgcccatg-3’f13：5’-ggattggcgaatgggttatctctggcggtgttgac-3’r13：5’-gcgatagttcgtcatatgagctgtttcctggtttaaac-3’f14：5’-caggaaacagctcatatgacgaactatcgcgttgag-3’r14：5’-gaaaagtgccacctgggaaggaaatgatgacctcg-3’f15：5’-caggtggcacttttcggggaaatg-3’r15：5’-cccattcgccaatccggatatag-3’f16：5’-gcactgggattgtagtaagaaggagatatacatatgaatgagttcaag-3’r16：5’-tagtgctcgaattcactatttatcggaaggtttatctt-3’f17：5’-tgaattcgagcactagtgc-3’r17：5’-ctacaatcccagtgccgtac-3’实施例9重组表达质粒pgel-mnth-a2和pgel-mnth-mnts-a2的表达测试按照质粒小提试剂盒方法提取pgel-mnth-a2和pgel-mnth-mnts-a2质粒dna，分别转化origami2(de3)和bl21(de3)菌株，涂布到含有50μg/ml卡那霉素的抗性lb固体培养基平板上筛选，通过pcr验证阳性克隆子，得到重组菌株pgel-mnth-a2/origami2(de3)，pgel-mnth-mnts-a2/origami2(de3)，pgel-mnth-a2/bl21(de3)和pgel-mnth-mnts-a2/bl21(de3)，采用与实施例5中相同的培养基和表达条件进行表达，pgro7/origami2(de3)菌株作为对照，酶活力结果如图9所示，重组菌株pgel-mnth-mnts-a2/origami2(de3)的破碎液上清的草酸脱羧酶活力最高，重组时转化origami2(de3)菌株好于bl21(de3)菌株。实施例10草酸脱羧酶vl3在大肠杆菌中的表达以全基因合成的vl3基因(seqidno.2)为模版，设计引物对f18/r18，对该基因进行扩增，对扩增产物进行胶回收纯化，方法参照市售dna小量纯化试剂盒说明书的方法，最终得到dna片段18(即vl3基因片段)。以实施例8中构建的pgel-mnth-a2质粒为模版，设计引物对f19/r19对，对质粒进行扩增，pcr反应条件中退火温度55℃，延伸时间5min，其它条件与实施例2所述a2基因扩增的pcr条件一样，扩增产物用限制性内切酶dpni在37℃消化2h(50μl体系，反应条件参照说明书)，对消化后的扩增产物进行胶回收纯化，最终得到dna片段19。通过无缝克隆试剂盒的方法，采用无缝克隆试剂盒说明书的方法，于冰水浴中配制如下的反应体系，将上述dna片段18和dna片段19连接起来，转化大肠杆菌dh5α，涂布到含有50μg/ml卡那霉素的抗性lb固体培养基平板上筛选，通过pcr验证和测序验证阳性克隆子，测序正确的载体命名为pgel-mnth-vl3。上述所用引物序列如下：f18：5’-agaaggagatataccatgaacgaaacttccgatcca-3’r18：5’-gttagcagccggatcctattagttaactggaccaac-3’f19：5’-ggtatatctccttcttaaag-3’r19：5’-ggtatatctccttcttaaag-3’采用实施例2中类似的方法构建pet28a-vl3载体。将pgel-mnth-vl3和pet28a-vl3载体转化origami2(de3)菌株，涂布到含有50μg/ml卡那霉素的抗性lb固体培养基平板上筛选，通过pcr验证阳性克隆子，得到重组菌株pgel-mnth-vl3/origami2(de3)和pet28a-vl3/origami2(de3)，采用与实施例5中相同的培养基和表达条件进行表达，结果发现重组菌株pgel-mnth-vl3/origami2(de3)的上清和全液中的草酸脱羧酶活力分别为4,820u/l和5,120u/l，而重组菌株pet28a-vl3/origami2(de3)的上清和全液均没有检测到草酸脱羧酶活力。实施例11草酸氧化酶b10在过表达锰离子通道蛋白和分子伴侣蛋白的大肠杆菌中的表达以全基因合成的b10基因(seqidno.3)为模版，设计引物对f20/r20，对该基因进行扩增，对扩增产物进行胶回收纯化，方法参照市售dna小量纯化试剂盒说明书的方法，最终得到dna片段20(即b10基因片段)。以实施例8中构建的pgel-mnth-a2质粒为模版，设计引物对f19/r19对，对质粒进行扩增，扩增产物用限制性内切酶dpni在37℃消化2h(50μl体系，反应条件参照说明书)，反应条件参照说明书，对消化后的扩增产物进行胶回收纯化，最终得到dna片段21。通过无缝克隆试剂盒的方法，采用无缝克隆试剂盒说明书的方法，于冰水浴中配制如下的反应体系，将上述dna片段20和dna片段21连接起来，转化大肠杆菌dh5α，涂布到含有50μg/ml卡那霉素的抗性lb固体培养基平板上筛选，通过pcr验证和测序验证阳性克隆子，测序正确的载体命名为pgel-mnth-b10。所用引物序列如下：f20：5’-agaaggagatataccatgtctgatcctggtctcct-3’r20：5’-gttagcagccggatcttaagcaacatcagttaagag-3’采用实施例2中类似的方法构建pet28a-b10载体。将pgel-mnth-b10和pet28a-b10载体转化origami2(de3)菌株，pet28a-b10载体转化pgro7/origami2(de3)，涂布到含有50μg/ml卡那霉素的抗性lb固体培养基平板上筛选，通过pcr验证阳性克隆子，得到重组菌株pgel-mnth-b10/origami2(de3)、pet28a-b10/origami2(de3)和(pet28a-b10pgro7)/origami2(de3)。采用与实施例5中相同的培养基和表达条件进行表达，结果发现重组菌株pgel-mnth-b10/origami2(de3)的上清和全液中的草酸氧化酶活力分别为46.5u/ml和47.1u/ml，而重组菌株pet28a-b10/origami2(de3)和(pet28a-b10pgro7)/origami2(de3)的上清和全液均没有检测到草酸氧化酶活力。实施例12精氨酸酶在过表达锰离子通道蛋白和分子伴侣蛋白的大肠杆菌中的表达以全基因合成的arg1基因(seqidno.4)为模版，设计引物对f21/r21，对该基因进行扩增，对扩增产物进行胶回收纯化，方法参照市售dna小量纯化试剂盒说明书的方法，最终得到dna片段22，以实施例8中构建的pgel-mnth-mnts-a2质粒为模版，设计引物对f19/r19对，对质粒进行扩增，扩增产物用限制性内切酶dpni在37℃消化2h(50μl体系，反应条件参照说明书)，反应条件参照说明书，对消化后的扩增产物进行胶回收纯化，最终得到dna片段23。通过无缝克隆试剂盒的方法，采用无缝克隆试剂盒说明书的方法，于冰水浴中配制如下的反应体系，将上述dna片段22和dna片段23连接起来，转化大肠杆菌dh5α，涂布到含有50μg/ml卡那霉素的抗性lb固体培养基平板上筛选，通过pcr验证和测序验证阳性克隆子，测序正确的载体命名为pgel-mnth-mnts-agr1。上述所用引物序列如下：f21：5’-agaaggagatataccatgagcgccaagtccagaac-3’r21：5’-gttagcagccggatcttacttaggtgggttaaggt-3’采用实施例2中类似的方法构建pet28a-agr1载体。将pgel-mnth-mnts-agr1和pet28a-agr1载体转化origami2(de3)菌株，pet28a-agr1载体转化pgro7/origami2(de3)，涂布到含有50μg/ml卡那霉素的抗性lb固体培养基平板上筛选，通过pcr验证阳性克隆子，得到重组菌株pgel-mnth-mnts-agr1/origami2(de3)，pet28a-agr1/origami2(de3)和(pet28a-agr1pgro7)/origami2(de3)采用与实施例5中相同的培养基和表达条件进行表达，结果发现重组菌株pgel-mnth-mnts-agr1/origami2(de3)的上清的精氨酸酶活力分别为16.53u/ml，而重组菌株pet28a-agr1/origami2(de3)和(pet28a-agr1pgro7)/origami2(de3)的上清的精氨酸酶活力分别为4.16u/ml和6.54u/ml。实施例13超氧化物歧化酶在过表达锰离子通道蛋白和分子伴侣蛋白的大肠杆菌中的表达以全基因合成的hmn-sod基因(seqidno.5)为模版，设计引物对f21/r21，对该基因进行扩增，对扩增产物进行胶回收纯化，方法参照市售dna小量纯化试剂盒说明书的方法，最终得到dna片段24，以实施例8中构建的pgel-mnth-mnts-a2质粒为模版，设计引物对f19/r19对，对质粒进行扩增，扩增产物用限制性内切酶dpni在37℃消化2h(50μl体系，反应条件参照说明书)，反应条件参照说明书，对消化后的扩增产物进行胶回收纯化，最终得到dna片段25。通过无缝克隆试剂盒的方法，采用无缝克隆试剂盒说明书的方法，于冰水浴中配制如下的反应体系，将上述dna片段24和dna片段25连接起来，转化大肠杆菌dh5α，涂布到含有50μg/ml卡那霉素的抗性lb固体培养基平板上筛选，通过pcr验证和测序验证阳性克隆子，测序正确的载体命名为pgel-mnth-mnts-hmn-sod。上述所用引物序列如下：f22：5’-agaaggagatataccatgcagctgcaccacagcaag-3’r22：5’-gttagcagccggatcttactttttgcaagccatgt-3’采用实施例2中类似的方法构建pet28a-hmn-sod载体。将pgel-mnth-mnts-hmn-sod和pet28a-hmn-sod载体转化origami2(de3)菌株，pet28a-hmn-sod载体转化pgro7/origami2(de3)，涂布到含有50μg/ml卡那霉素的抗性lb固体培养基平板上筛选，通过pcr验证阳性克隆子，得到重组菌株pgel-mnth-mnts-hmn-sod/origami2(de3)，pet28a-hmn-sod/origami2(de3)和(pet28a-hmn-sodpgro7)/origami2(de3)采用与实施例5中相同的培养基和表达条件进行表达，结果发现重组菌株pgel-mnth-mnts-hmn-sod/origami2(de3)的上清hmn-sod比酶活力为1254u/mg，而重组菌株pet28a-hmn-sod/origami2(de3)和(pet28a-hmn-sodpgro7)/origami2(de3)的上清hmn-sod比酶活力为358u/mg和629u/mg，过表达mnth和mnts使得hmn-sod酶的比活力提高2倍。本发明通过筛选和测试不同的分子伴侣、不同的宿主菌、不同的锰离子通道相关蛋白的过表达或敲除，最终找到优化的组合，实现了目的蛋白的高效表达，均得到可溶且有活性的酶，相比传统的表达方式相比效率高，纯化工艺简单，成本低，有利于这类酶的工业化生产和应用。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。序列表<110>武汉康复得生物科技股份有限公司<120>含锰离子重组蛋白的大肠杆菌表达系统及其应用方法<160>20<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1359<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1atggctccagcaccttccagcgcagcttcctccatcgttgtctccgctacttcatcatcg60actgtttcgagtgcacccgtgagcgtttcgagcttcctgcccactacctccattgctgct120gcaactcctagttcaatcgctgtggctttatcatccacagctacggttcccttcatcgac180ttgaatcctaatggacctctgtgggacccgtctgtgagcggtgtacctcaggctgaacgt240ggttccttgggagcaactatcatgggacctacagatgtggacacgacaaaggcaaatcca300gacctgttggcaccacctactactgaccacggttctgtagataatgcaaaatgggcattt360tccttatcccataacagattgcaaactggcggttgggccagggagcaaaacataggtgcc420atgccaattgcaactgaaatggcatctgtcaacatgaggcttgaaccaggtgctattaga480gaattgcactggcataagacagcagagtgggcttacgtcctaaagggaaatactcaggtg540actgctgttgatcaaaatggtaaaaactttatcggtactgtaggaccaggtgatctttgg600tacttcccaccgggtattcctcattcgctacaagctacaggtgatgacccagaaggctca660gagttcatactggttttcgattctggtgctttttctgaggattccacctttttgttgact720gattggatgagtcatgttccagtggaagtcttggccaaaaacttccagaccgatatctca780gcatttgccagaatcccagctgaggagttgtatatctttcccgctgccgttccacctgat840tctcaacaagaccctacatctcctgaaggaaccgtcccaaatccttttacttttgcttta900tccaaggtcccacctatgcaattgtctggaggtaccgcaaaaatcgttgactcaacaact960tttaccgtttctaaggccatcgcagctgccgaggtaactatagaaccaggcgctatcaga1020gaacttcattggcaccccacacaagacgagtggtcatttttcatcgagggtagagctaga1080atgacaattttcgccgctcagtctaatgctcgtacattcgactaccaagccggtgacatt1140ggttacgttcccgcaactatgggacattatgtggagaatattggaaacacaacagtgcgt1200tatctggagattttcaacacggctgtttttgaagatatttccctcagtaattggttagcc1260ttaacgccaccagaattggttaaagcacacttgggtttcgatgacgctacaatggctcac1320ttggctaaggtaaaaccaattgtggtcggtcctgcttag1359<210>2<211>1176<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2atgaacgaaacttccgatccagctttggttaagccagagagaaaccagttgggagctact60attcaaggtccagacaacttgccaatcgacttgcaaaacccagatttgttggctccacca120actactgatcacggtttcgttggtaacgctaagtggccattctcattctccaagcagaga180ttgcaaactggtggatgggctagacaacagaacgaagttgttttgccattggctacaaac240ttggcttgtacaaacatgagattggaggctggtgctattagagaattgcactggcacaag300aacgctgaatgggcttacgttttgaagggttccactcagatttctgctgttgacaacgag360ggtagaaactacatctccactgttggtcctggtgatttgtggtacttcccaccaggtatt420ccacattccttgcaggctactgctgatgatccagaaggttccgagttcatcttggttttc480gactccggtgctttcaacgatgacggtactttcttgttgactgattggttgtcccacgtt540ccaatggaagttatcttgaagaacttcagagctaagaaccctgctgcttggtcacatatt600ccagctcaacagttgtacatcttcccatctgaacctccagctgataaccaaccagaccca660gtttctccacaaggtactgttccattgccatactcattcaacttctcatccgttgagcca720actcaatactctggtggtactgctaagattgctgactccactactttcaacatctccgtt780gctattgctgttgctgaggttacagttgaacctggtgctttgagagagttgcattggcat840ccaactgaagatgagtggactttcttcatctccggtaacgctagagttactatcttcgct900gctcaatccgttgcttccactttcgattaccagggtggtgacattgcttacgttccagct960tctatgggacactacgttgagaacatcggtaacactactttgacttacttggaggttttc1020aacactgacagattcgctgacgtttctttgtctcagtggcttgctttgactccaccatct1080gttgttcaggctcacttgaacttggacgacgaaactttggctgagttgaagcagtttgct1140actaaggctactgttgttggtccagttaactaatag1176<210>3<211>653<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3atgtctgatcctggtctcctacaggatttttgtgtgggtgt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