pSP107质粒及其应用、构建方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及psp107质粒及其应用、构建方法。

背景技术

菰黑粉菌（ustilagoesculenta）是一种独特的病原真菌，其侵染茭白植株（zizanialatifolia）后可抑制植株抽穗开花并刺激茎基部膨大形成可食用的茭白。在东亚及东南亚地区尤其是中国，茭白是一种营养很高的水生蔬菜，也是一种重要的药材。但是田间常出现充满冬孢子的灰茭和少量冬孢子形成的芝麻茭，误食后易形成肺炎，不利于茭白产业的发展。鉴于人工育种技术的成功开发，如何控制茭白中菰黑粉菌冬孢子的形成将是茭白人工育种的一大关键。

前期研究发现，菰黑粉菌与其他二型态真菌类似，存在酵母型和菌丝型两种型态，而由酵母型向菌丝型转换是此类真菌致病性的关键。在菰黑粉菌中，其二型态转换受到a，b基因的调控，需要两个性亲和单倍体融合形成双核菌丝，在侵染过程中受环境因子影响菌丝内两个细胞核核融形成一个二倍体的核从而产生二倍体的冬孢子。

申请人在长期研究过程中发现自龙茭2号灰茭中分离得到单倍体菌株uet1（交配基因型为a1b1，该菌株在cn105838616a的发明专利中已经公开，保藏号为cgmccno.11843）、uet2（交配基因型为：a2b2，该菌株在cn105838615a的发明专利中已经公开，保藏号为：cgmccno.11844）、uemt3（交配基因型为a3b3，该菌株在cn105838617a的发明专利中已经公开，保藏号为：cgmccno.11842）和uemt2（交配基因型为a2b2，该菌株在cn105838618a的发明专利中已经公开，保藏号为：cgmccno.11841）。当uet1与uet2或当uemt3与uemt2两个性亲和菰黑粉菌共培养时，两个性亲和菰黑粉菌共培养时，体外培养的菌落从酵母型向菌丝型转变，菌落生长气生菌丝，菌丝可以侵染茭白，使茭白孕茭，但是容易产生灰茭。

基于上述问题，申请人成功构建psp107质粒，经试验发现该质粒经原生质体转化，可获得单倍体的可产生菌丝的uetsp菌株和uemtsp菌株，该菌株可成功侵染茭白。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种psp107质粒及其应用、构建方法的技术方案。

所述的一种带有如seqidno.1所示核苷酸序列的psp107质粒。

所述的psp107质粒作为菰黑粉菌uet2或uemt2的原核表达载体的应用。

所述的psp107质粒作为菰黑粉菌uet2或uemt2的原核表达载体获得uetsp和uemtsp菌株的应用，所述的uetsp和uemtsp菌株能够侵染茭白使茭白孕茭。

所述的psp107质粒的构建方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1）获得菰黑粉菌uet1菌株基因组dna；

2）以菰黑粉菌uet1菌株基因组dna为模板，以mfa1.2f和mfa1.2r，be1f和be1r为引物进行pcr,获得mfa1.2和be1基因序列，所述的mfa1.2f的核苷酸序列如seqidno.2所示，mfa1.2r的核苷酸序列如seqidno.3所示，be1f的核苷酸序列如seqidno.4所示，be1r的核苷酸序列如seqidno.5所示；

3）用mfa1.2f和be1r引物，以mfa1.2和be1基因序列为模板，进行融合pcr，将mfa1.2和be1基因连接成一个长片段；

4）将融合pcr产物和puma932质粒经限制性内切酶ecorⅴ和hindⅲ双酶切2h后的产物，连接后转化到大肠杆菌dh5α感受态细胞中，挑取单克隆培养后提取重组质粒，即为原核表达质粒psp107。

本发明的质粒经酶切后，可以转化到uet2和uemt2原生质体中，获得uetsp菌株和uemtsp菌株，这两种菌株可以侵染茭白使茭白孕茭，为人工孕茭提供了一种新的思路。

附图说明

图1为mfa1.2和be1基因电泳扩增图；

图2为puma932质粒图谱；

图3为puma932质粒经双酶切图；

图4为mfa1.2和be1基因融合pcr结果图；

图5为psp107质粒图谱；

图6为构建的uetsp菌株在yeps平板上活化，观察12、24、36、48小时的菌（下）及菌落（上）形态显微观察图；

图7为构建的uemtsp菌株在yeps平板上活化，观察12、24、36、48小时的菌（上）及菌落（下）形态显微观察图；

图8为茭白经uetsp菌株侵染后共聚焦观察图（左图叶鞘，右图茎部）；

图9为茭白经uemtsp菌株侵染后共聚焦观察图（左图叶鞘，右图茎部）。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

实例1：菰黑粉菌uet1菌株中基因组dna的提取

1、提前半小时在65℃水浴锅内水浴加热ctab提取液；

2、用枪头取uet14菌体（厚度约5mm）于2.0ml离心管中，加入10颗左右不锈钢钢珠（直径1mm），标记；通风橱内，加入800ul预热的ctab提取液；震荡仪70hz，震荡150s，破碎菌体；

3、65℃水浴1h；

4、加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），混匀；

5、通风橱内，室温静置15min；室温，10000rpm离心10min；此时离心管内出现分层现象，上清中含有核酸，中间是蛋白层，底部为钢珠和杂质；小心吸取上清液至新的1.5ml离心管中（可一直重复4、5步，直至肉眼不可见中间蛋白层）；

8、向上清中加入等体积的异丙醇，温和地颠倒混匀，可直接离心或静置5-10min后离心；

9、预冷离心机至4℃，然后4℃，10000rpm离心10min；

10、倒上清，加1ml的75%乙醇，轻轻颠倒洗涤dna；4℃，10000rpm离心5min，弃上清；

11、弃去上清后，可置于37℃烘箱中或倒扣在纸巾上5-10min进行干燥，亦可采用其他干燥方式；若底部有残留乙醇也无碍；

12、加入30ul无菌水溶解dna，50℃水浴20min，去除挥发物；-20℃保存。

实例2：mfa1.2基因的克隆

以实例1中获得的uet1菌株中基因组dna为模板，根据设计的mfa1.2f和mfa1.2r引物，克隆mfa1.2基因。mfa1.2f的核苷酸序列如seqidno.2所示，mfa1.2r的核苷酸序列如seqidno.3所示。

pcr扩增体系：（50ul）

10×pcrbuffer（takara）5ul

dntpmix（takara）4ul

mfa1.2f1ul

mfa1.2r1ul

lataq（takara）0.5ul

ddh2o37.5ul

uet1uet1dna1ul

pcr反应条件如下：

1%琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物。切胶后用magen凝胶dna微量回收试剂盒回收产物。置于﹣20℃冰箱备用。

实例3：be1基因的克隆

以实例1中获得的uet1菌株中基因组dna为模板，根据设计的be1f和be1r引物进行pcr，克隆be1基因。be1f的核苷酸序列如seqidno.4所示，be1r的核苷酸序列如seqidno.5所示。

pcr扩增体系：（50ul）

10×pcrbuffer（takara）5ul

dntpmix（takara）4ul

be1f1ul

be1r1ul

lataq（takara）0.5ul

ddh2o37.5ul

uet1uet1dna1ul

pcr反应条件如下：

1%琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物。切胶后用magen凝胶dna微量回收试剂盒回收产物。置于﹣20℃冰箱备用。

mfa1.2和be1基因电泳扩增图如图1所示。

实例4：puma932质粒线性化

酶切体系（30ul）

puma932质粒dna4ul

hindⅲhf(neb)1ul

ecorⅴhf(neb)1ul

1xqcutbuffer3ul

ddh2o21ul

在37℃下，酶切2h。

1%琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物。切胶后用magen凝胶dna微量回收试剂盒回收。置于﹣20℃冰箱备用。puma932质粒图谱如图2所示。puma932质粒经双酶切如图3所示，使用ecorⅴ和hindⅲ将puma932质粒进行双酶切，得到两个片段，片段长度在4000左右的为我们需要的片段，进行割胶回收，得到目的片段。

实例5：融合pcr

一轮25ul体系

10×pcrbuffer（takara）2.5ul

dntpmix（takara）2ul

lataq（takara）0.25ul

mfa片段2ul

be1片段2ul

ddh2o16.25ul

pcr反应条件如下：

二轮50ul体系

10×pcrbuffer（takara）5ul

dntpmix（takara）4ul

lataq（takara）0.5ul

mfa1.2f2ul

be1r2ul

一轮产物3ul

ddh2o33.5ul

pcr反应条件如下：

1%琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物。切胶后用试剂盒回收。

mfa1.2和be1基因融合pcr结果如图4所示。mfa1.2的核苷酸序列如seqidno.6所示，be1的核苷酸序列如seqidno.7所示。

实例6：融合pcr产物与双酶切开的puma932载体连接

为完成此步骤，使用南京诺维赞生物科技有限公司生产的clonexpressiionestepcloningkit重组克隆试剂盒。具体步骤如下所示：

1）于冰上配制以下反应体系：

组分（20ul）

puma932线性化载体1.5ul

mfa1.2-be1融合片段1.5ul

5×ceⅱbuffer4ul

exnaseⅱ2ul

ddh2o11ul

(注：clonexpress®ii重组反应体系最适克隆载体使用量为0.03pmol，最适插入片段使用量为0.06pmol(载体与插入片段摩尔比为1:2)。这些摩尔数对应的dna质量可由以下公式粗略计算获得：最适克隆载体使用量=[0.02×克隆载体碱基对数]ng(0.03pmol)最适插入片段使用量=[0.04×插入片段碱基对数]ng(0.06pmol))。

2）使用移液器轻轻吹打混匀，（请勿震荡混匀），短暂离心反应液收集至管底。

3）37℃反应30min；降至4℃或立即置于冰上冷却。

实例7：重组产物转化

1）于-80℃冰箱取出大肠杆菌感受态细胞（100μl），冰上放置溶解，做好标记；

2）加入10μl连接产物，小心吹打混匀，冰上放置20~30min；（备注：该过程用于使连接产物充分吸附到感受态细胞表面）

3）42℃水浴热激90s，快速放置到冰上冷却，并保持3-5min；

4）加入800μllb培养基，37℃，200rpm培养1h；

5）8000rpm，2min离心；

6）移除约700μl培养基，剩余100μl培养基吹打混匀，涂相应抗性的平板，37℃倒置培养10-14h；

7）挑取单菌落，挑单菌落于2ml离心管，离心管中加入1ml加入抗生素的lb液体培养基，37℃，180rpm培养4-8h即可进行菌液pcr验证。

将菌液pcr条带相符的菌液送到上海桑尼测序公司进行测序。测序正确的菌液扩摇并提质粒，将其命名为psp107质粒。该psp107质粒图谱如图5所示，psp107质粒的核苷酸序列如seqidno.1所示。

实例8：psp107质粒的酶切

psp107质粒4ul

pvuⅰhf（neb）1ul

1xqcutbuffer3ul

ddh2o22ul

在37℃下，酶切2h。

1%琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物。用magen凝胶dna微量回收试剂盒回收产物。置于﹣20℃冰箱备用。

实例9：uet2原生质体的制备

1、菌株培养：

从平板上挑uet2单菌落接种到15-20mlyeps液体培养基中，28℃，180rpm摇床振荡预培养至od600为0.8-1.5之间（约24h）。

将小摇的菌液5ml接种到新的50mlyeps液体培养基中继续培养至od600为0.6～0.8，（6～8h），最长时间不超过12h。

2、原生质体制备

（1）取少许培养好的菰黑粉菌置于载玻片上在显微镜下观察，确认无污染；

（2）将50ml菌液收集到50ml的无菌管中，常温3000rpm，离心5min，弃上清；

（3）将菌体重悬于25mlscs中，常温3000rpm，离心5min，弃上清；

（4）加入配制好的2mlscs/lywallzyme重悬菌体（轻柔吹打，避免产生过多气泡）；

（5）室温（25℃左右）水平慢速摇床（50rpm以下）上酶解（mt型约40～50min），每隔约10分钟取样观察，最终时间以酶解效果为准，原生质体产生量约为50%，几乎所有细胞开始产生原生质体时进行下一步；

（6）在菌液中加10ml预冷的scs，4℃，2400rpm，离心10min，弃上清；

（7）再次加10ml预冷的scs，4℃，2400rpm，离心10min，弃上清；

（8）再次加10ml预冷的scs，4℃，2400rpm，离心10min，弃上清；

（9）将细胞重悬于10ml预冷的stc中，4℃，2400rpm，离心10min，弃上清；

（10）将细胞重悬于500μl预冷的stc（蔗糖）中，冰上放置，分装到提前在-80℃冰箱中预冷的1.5ml离心管中，每管50μl，置于-80℃冰箱中保存。

实例10：uet2原生质体转化

1、取两瓶regenerations-agar（蔗糖）微波加热至融化，冷却至60℃后取其中一瓶培养基加入萎锈灵（10mg/ml）使萎锈灵终浓度为50μg/ml后倒平板，每个平皿上倒约10ml培养基（可略厚），另一瓶暂时放置在60℃烘箱中保温；

2、取原生质体冰上放置10min；

3、各原生质体中分别加入1μlheparin；

4、每管加入总量为1～5μg的实例8准备好的dna（体积不允许超过10μl）

轻轻吹打两三下混匀，冰浴10min。在此期间，自烘箱中取出未加抗生素的100ml的regenerations-agar培养基，在已凝固的含萎锈灵的regenerations-agar平板上再倒一层培养基，每个平板倒约10ml培养基（可略薄），制成再生平板；

5、每管原生质体中加入500μlstc-peg（蔗糖），轻轻颠倒两下混匀后冰上放置15min；

6、将冰上放置15min后的原生质体全部加入到相应抗性的再生平板上，颠倒涂板；

7、将涂好的平板正置放在28℃培养箱中培养3-4天等表面干燥后倒置，再培养2-5天筛选转化子。

实例11：转化子表型验证

将再生平板上长出的转化子，继代于yeps加入萎锈灵（终浓度为50μg/ml）抗性的平板上扩大培养。将菌株保存，并继代于yeps平板上，每12h观察一次表型。经观察可知，24huetsp菌落上开始有菌丝大量生长。将得到的新菌株uetsp进行保藏。该菌株于2018年06月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为cgmccno.15929，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为：茭白黑粉菌（ustilagoesculenta）。

实例12：所构建菌株侵染能力及孕茭表型验证

将所构建的uetsp菌株在yeps平板上活化，观察12、24、36、48小时的菌落状态，从图6可以看出，该菌株在36h菌丝大量生长。且在接种后如图8所示，菌株可直接侵染茭白，使茭白孕茭，但是不产生冬孢子，即不形成灰茭这种不利表型。

实例13：uemt2原生质体的制备

1、菌株培养：

从平板上挑uemt2单菌落接种到15-20mlyeps液体培养基中，28℃，180rpm摇床振荡预培养至od600为0.8-1.5之间（约24h）。

将小摇的菌液5ml接种到新的50mlyeps液体培养基中继续培养至od600为0.6～0.8，（6～8h），最长时间不超过12h。

2、原生质体制备

（1）取少许培养好的菰黑粉菌置于载玻片上在显微镜下观察，确认无污染；

（2）将50ml菌液收集到50ml的无菌管中，常温3000rpm，离心5min，弃上清；

（3）将菌体重悬于25mlscs中，常温3000rpm，离心5min，弃上清；

（4）加入配制好的2mlscs/lywallzyme重悬菌体（轻柔吹打，避免产生过多气泡）；

（5）室温（25℃左右）水平慢速摇床（50rpm以下）上酶解（mt型约40～50min），每隔约10分钟取样观察，最终时间以酶解效果为准，原生质体产生量约为50%，几乎所有细胞开始产生原生质体时进行下一步；

（6）在菌液中加10ml预冷的scs，4℃，2400rpm，离心10min，弃上清；

（7）再次加10ml预冷的scs，4℃，2400rpm，离心10min，弃上清；

（8）再次加10ml预冷的scs，4℃，2400rpm，离心10min，弃上清；

（9）将细胞重悬于10ml预冷的stc中，4℃，2400rpm，离心10min，弃上清；

（10）将细胞重悬于500μl预冷的stc（蔗糖）中，冰上放置，分装到提前在-80℃冰箱中预冷的1.5ml离心管中，每管50μl，置于-80℃冰箱中保存。

实例14：uemt2原生质体转化

1、取两瓶regenerations-agar（蔗糖）微波加热至融化，冷却至60℃后取其中一瓶培养基加入萎锈灵（10mg/ml）使萎锈灵终浓度为50μg/ml后倒平板，每个平皿上倒约10ml培养基（可略厚），另一瓶暂时放置在60℃烘箱中保温；

2、取原生质体冰上放置10min；

3、各原生质体中分别加入1μlheparin；

4、每管加入总量为1～5μg的实例8准备好的dna（体积不允许超过10μl）

轻轻吹打两三下混匀，冰浴10min。在此期间，自烘箱中取出未加抗生素的100ml的regenerations-agar培养基，在已凝固的含萎锈灵的regenerations-agar平板上再倒一层培养基，每个平板倒约10ml培养基（可略薄），制成再生平板；

5、每管原生质体中加入500μlstc-peg（蔗糖），轻轻颠倒两下混匀后冰上放置15min；

6、将冰上放置15min后的原生质体全部加入到相应抗性的再生平板上，颠倒涂板；

7、将涂好的平板正置放在28℃培养箱中培养3-4天等表面干燥后倒置，再培养2-5天筛选转化子。

实例15：转化子表型验证

将再生平板上长出的转化子，继代于yeps加入萎锈灵（终浓度为50μg/ml）抗性的平板上扩大培养。将菌株保存，并继代于yeps平板上，每12h观察一次表型。经观察可知，36h后uemtsp菌落上开始有菌丝大量生长。将得到的新菌株uemtsp进行保藏。该菌株于2018年07月02日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为cgmccno.16040，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为：茭白黑粉菌（ustilagoesculenta）。

实例16：所构建菌株侵染能力及孕茭表型验证

将所构建的uemtsp菌株在yeps平板上活化，观察12、24、36、48小时的菌落状态，从图7可以看出，该菌株在36h菌丝大量生长。且在接种后如图9所示，菌株可直接侵染茭白，使茭白孕茭，但是不产生冬孢子，即不形成灰茭这种不利表型。

序列表

<110>中国计量大学

<120>psp107质粒及其应用、构建方法

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>8394

<212>dna

<213>质粒(plasmid)

<400>1

gaactcgagcagctgaagcttaactcgcttatttgacttgcttatccttcgcctagtctg60

atctctgacgagatcatgctgcggaaccacagacccaaatttcgaatgagcgcgctttca120

ttcggggtggccaatatagagagtaacaaaatcgagacaaaaaggacgaggactttgcag180

caccgcaaccaagttcagtaacttgactaggcgagcaagagccaatcaatgagattagaa240

ttcgaaaagaggtaggggttccaaccatcggcagtggaaagccggcgatccgagcatcct300

tgcctgtttttcgaccagaatagactcggggtcgtggccaacgagagagatcggcgattg360

cctcaacaagcgatgcaatcacgtccaatggggttgctgcctgtttagcgaaagaattgg420

ccgatcaaaatcaaagcccctgagcaacgtcagtatcgaggtctcttcacaatcagcgaa480

gagaggcaagaagagacctgaacttacttaccaaagcaagcttaggcgacaatacatgtg540

gagtagccgagaggggctccaccgccacggccctcatcggcgggcgagggctgggtctcg600

gagacggaggactgggcgggctgagtgaagatggagaacattttcagaaagaagtgtggg660

gtgtttaaatcggtgttcgaacgagtgtgtgaatgagagtagttgtgctttggatatcga720

ctagcttcggatcccgctgcttatatccttttcgacgccgtttacatgttgtggtcaggc780

taactagggacacagtatctctgtgttcataggtgcgcactcctaccgtccaggagctgg840

agagtgacagttgctactgaccagcactacagaccagtcattgagatgaacaaaggaaca900

cgaggctagcaaggctctcctttccatccttcagtggcgagcctcccttattttggctcg960

ttccctttccaattcgggacttcgagtgcgaaggtggcggtctgacgtctctgagtcttt1020

gttgtttagttcagtgactgaaaacgtgggcaccaaccatacaaactggcagccagtgcc1080

ttgcgctaagattatcaatcagacaatctctttcatccttccatgcagtactgaccatca1140

gataaagggcattgtgagatttggacaaagggcattcagcgccattattccaaagtggca1200

gggtccctttgacacaatacggttagtcgcacagccgattgatgcattgtttagatctcc1260

ccatgcaatcttggccgctttcccaggctgtctctcgaacaattatcccctttcaacgtc1320

ctcaacccccggttcaggttggagattggcatacacttttcctttatttttccctttgtg1380

agcgcaaaattcgatgcaacgcgtaggctctttgctttatattaaaagggacctggggtc1440

cctttgtcaagttctgcagaagccaatccgcaatcagtttcataccaagcacggaaagaa1500

gtacaatgtactgtacagtacggaccgaatcagcataccctatgtcttatattgattcga1560

tgatatagcagaagataagaaacgcatgtctcagacacgcagtgttcaaggtgctatttg1620

agctttgtgtcaccgcacacaaaagtgacacgccctggaagcaaaccacaaacgagtcca1680

aagggctgtcgcagacgctgttctcacaattagcaagtacagtgaagatgtttacgctca1740

ccactgttcattactccaaagattctgcaaactgtgtttgataggaaagaattgaaacaa1800

gcgagaacgtagctttttcgctcgaacgctgcgaatcaaactcgtgatcggggctatatc1860

aaaatcgccggcttgtgacaagccaaagtaacgagattaactcgtcagattggaaagaaa1920

gggctaaactacaggctgatcgacctaggaaacactcggagactcaaacgctggactttg1980

aaccctcttgtacagaactcaagcctcgtgtaagtcaacctgcggacctagctatgcggc2040

tcggaaaggttaaatagagggcggtacaggtcgtcctgatctgctttccgacatcacaca2100

tcacacctcacactttacaacaccacctcaaaagacctcttcccctctagctccttctgt2160

cactaaattcttcaaagaagctgcaagtgtagcatgtgaaatgttttcttctacccactt2220

cggtcacttaaacccctgtgtcattttatcaaagctttgagccgtaaagtgtaagccgcg2280

gtagtatcttggctgtgccgatacgcacagattctcttgcctgacctcaagctactcctt2340

cctccaccatctcaacagctgacacttttcatgcatatcgactaggacaacggatatcga2400

gtgatacaacgggaatttccaaaacacaaagggtagccagaatacaaagcgaaaacgaat2460

caaccaaacgcggcggagagactgtttgaagagaaagtttctctcctgattagcaccggc2520

acctgtccaagtgcatcgtaaggaggcaaatcgtgctgcttgacggcaggctcgagatag2580

gttgccgtctgagcgttgtcaagcgtgtgcgcttcaggcactgagatgcacgtgccaggc2640

gcagagcctcttgtattgtctgtgagacagtaaaaatcacagagggctgtggtcagtgag2700

gggaacaagtaacgttctctgaaagggaaggcacttacccgtggaaagggaatccgtcga2760

cagcttctgaacgcgtttcggcagcgctttgacttttcgcccgcctttcaagttgagact2820

cggactctgcagcacatcgttcgggtgcgaaaaaggattgtagtacatcatcgaaagatt2880

gctgctgagtgaattgaagctcgtgtctaccgtagagcatgtgctgagatctggcgttga2940

ctccatgcctgagctttctctgttgctgtccatggaaggagtcttgctcgcccgctgcgt3000

ggatttcctcggctttgcctgtgctgttgtgatcatgcgtgctggagttcgcttcgctgc3060

tgtaggaacagctcgcccctgacttggattgagattcttcttgttggcggcgacaagatc3120

gtgaacccagctacctattttctctttgacgccgtacttaatccagctgatcatacttgc3180

ccagtcgtcttcgaaagctttcttatcttcggccgtgagctgtcgaccaagattttcgcg3240

aagaacatcgtccaacttgtgagtcagaactgatctgagaggctcagtgcggataggaag3300

atcggaagagaccaacttggtttggataagaagtctcatgcgattgcgatcattgcacgc3360

gaacttccggaggatatgagaccagccagagcggcggcgcgcgttgatgaaccataaagt3420

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