本发明涉及杀松材线虫细菌的筛选技术领域，尤其涉及一种快速筛选杀松材线虫细菌的技术。
背景技术：
松材线虫病是世界性的重大森林病害。日本1905年首次报道了该病害，但直到1971年才确定该病害由松材线虫(bursaphelenchusxylophilus)引起。随后，该病害扩展到中国和韩国，近年来已传入欧洲(葡萄牙和西班牙)，对多个国家的松林造成极大危害并导致巨大经济损失。由于松材线虫的严重危害性，目前该线虫是国际上很多国家重要的检疫性有害生物，在我国，松材线虫不仅列于外检名单中，同时也列于国内林业检疫性有害生物名单之首位。自松材线虫病发生以来，世界各国学者对其进行了系统研究，但致病机制尚未十分清楚，其防治也一直是个世界难题，生产上迄今仍无行之有效的防治措施。目前生产上对该病的防治主要依靠加强植物检疫以及清理林间病死树，辅以松墨天牛的化学防治和生物防治，针对病原松材线虫的防治研究较少，但该研究领域正日益受到重视。
由于化学农药对环境的负面影响及残留问题，环境友好、安全有效的生物防治技术正日益引起重视，利用生防微生物开发杀线剂是线虫生物防治研究的热点，涉及的微生物主要包括捕食线虫真菌、内寄生真菌、产毒真菌、细菌以及放线菌等。其中，细菌具有生长繁殖速度快、易人工培养、对线虫有较好的杀灭作用等特点，已成为线虫生物防治的新突破口，越来越多具有杀线活性的细菌被筛选分离。罗兰等从51株苏云金芽孢杆菌中筛选出2株对松材线虫致死率较高的菌株；朱丽梅等从马尾松林中筛选出8株对松材线虫具有较高杀线活性的细菌；牛秋红等从198株细菌中筛选出松材线虫生防细菌5株。在目前的杀线虫细菌筛选过程中，常采用将细菌发酵滤液与松材线虫互作的方式进行(2003，鄢小宁；雷敬超，2007)。然而，有大量研究表明，松材线虫体表和体内均有大量伴生细菌，赵博光等(2000)通过电子显微镜观察到线虫体表携带大量的细菌，郭道森等(2002)发现感病黑松病组织中的松材线虫和灰葡萄孢菌丝上培养的松材线虫携带活细菌的数量平均为2.9×102个/条和3.0×103个/条，袁为敏等(2011)报道材线虫体内存在细菌，而这些伴生细菌中的某些种类可能对松材线虫有毒杀作用，例如paiva等(2013)测定了分离自松材线虫的47株细菌的杀线虫能力，其中40株菌株对松材线虫显示毒性。因此，杀松材线虫细菌筛选生测实验中，与线虫共培养的细菌发酵滤液中的营养物质促进了松材线虫伴生细菌的大量繁殖，可能对线虫造成毒杀，对准确评价所测细菌的杀线作用产生一定的影响。此外，有些细菌对线虫只是起麻痹作用，而非杀死作用，给统计结果造成误判，将其吸入清水中24h后有些可恢复活性(2003，鄢小宁)。构建一种准确快速高效的筛选杀松材线虫细菌的方法是个亟待解决的问题。
技术实现要素：
发明目的：针对现有技术中存在的上述不足，本发明的目的是提供一种快速筛选杀松材线虫细菌的方法，以实现为松材线虫的防治提供一种快速筛选生防细菌资源的方法。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种快速筛选杀松材线虫细菌的方法，先将无菌松材线虫悬浮液与待测细菌菌株培养液在96孔板中共培养，然后离心，去除上清，再加入无菌水与线虫共培养，然后统计被击倒的线虫数量，根据被击倒的线虫数量来判断细菌是否是杀松材线虫细菌。
所述的快速筛选杀松材线虫细菌的方法，先将无菌松材线虫悬浮液与待测细菌菌株培养液在96孔板中共培养24小时。
所述的快速筛选杀松材线虫细菌的方法，加入无菌水与线虫共培养2小时。
所述的快速筛选杀松材线虫细菌的方法，包括以下步骤：
(1)制备无细菌松材线虫，备用；
(2)配制lb液体培养基，调节ph至7.0～7.2，灭菌备用；
(3)挑取细菌的单菌落，接种至步骤(2)的lb液体培养基中，于28℃，200rpm/min转速摇床中振荡培养24h；
(4)将步骤(1)制备的无细菌松材线虫接种至96孔生化板各孔中，然后将步骤(3)的细菌菌株的24h培养液添加至已含松材线虫的96孔生化板各孔中，25℃条件下共培养24h；
(5)将96孔板取出，离心，去除上清，加入等体积无菌水，共培养2h；
(6)将96孔板各孔中线虫取出，显微镜下统计细菌对松材线虫的击倒率；依据击倒率筛选出杀松材线虫细菌。
步骤(1)中，采用cn102084849a中公开的方法，制备无细菌松材线虫。
步骤(6)中，击倒率达到95％以上，即为筛选出的杀松材线虫细菌。
有益效果：与现有技术相比，本发明的快速筛选杀松材线虫细菌方法，先将无菌松材线虫接种到96孔生化板中，然后将不同细菌菌株的培养液添加至已含松材线虫的96孔生化板各孔中，于25℃条件下共培养，24小时后，将96孔板取出，离心，去除上清，加入等体积无菌水，共培养2小时后，统计96孔生化板各孔中线虫的死亡率，筛选出对松材线虫有拮抗作用的细菌菌株。多个细菌菌株、多次重复结果表明，采用该方法对杀松材线虫进行筛选，准确率高，是一种快速且准确的杀线虫细菌筛选方法。
附图说明
图1是松材线虫及拟松材线虫伴生细菌对松材线虫的毒杀作用结果图。
具体实施方式
下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
一种快速筛选杀松材线虫细菌的方法，包括以下步骤：
(1)选取松材线虫ama3c1虫株(分离自安徽马鞍山市自然感染松材线虫病死亡的马尾松，并经连续近交20代获得的近交系松材线虫，保存于南京林业大学病理实验室，社会公众可索取获得)，不经无细菌化处理，直接用于试验。
(2)配制lb液体培养基(配方：酵母提取物5g，胰化蛋白胨10g，氯化钠10g，水1000ml)，调节ph至7.0～7.2，分装至100ml三角瓶中，每瓶30ml，121℃高压灭菌20min，备用。
(3)挑取待筛选细菌菌株js040-4、js040-6、js046-5、js055-3的单菌落(分离自现有已知的松材线虫虫株js040和js055，均未鉴定，为本方法的筛选对象，保存于南京林业大学病理实验室，社会公众可索取获得)，接种至上述lb液体培养基中，于28℃，200rpm/min转速摇床中振荡培养24h。
(4)将步骤(1)培养的松材线虫(200μl约含线虫10000条)接种至96孔生化板各孔中，然后将步骤(3)不同细菌菌株的24h培养液等体积添加至已含松材线虫的96孔生化板各孔中，以相同体积的无菌水和lb培养基为对照，25℃条件下共培养24h。
(5)将96孔板取出，从微孔中吸取线虫悬液(每孔取20μl，重复3次)用于后续统计线虫击倒率，其余的6000rpm/min离心5min，去除上清，每孔加入400μl清水(无菌水)重悬，分别于1h、2h、3h后取出，显微镜下统计细菌对松材线虫的击倒率(僵直或蜷曲不动的虫体视为被击倒)。统计结果(表1)显示，未经清水恢复的lb培养液处理线虫，击倒率高达71.8％，显微镜下线虫悬液较混浊，有大量细菌繁殖；清水处理1h后，部分线虫恢复活性，击倒率降至13.3％；2-3h后，线虫击倒率基本趋于稳定，分别为2.2％和3.3％。无菌水对照组中，刚取出以及清水恢复1h、2h和3h松材线虫死亡率分别是2.4％、1.4％、0.8％和0.8％，基本无变化。4株细菌发酵滤液处理、未经清水恢复的松材线虫，其击倒率分别为89.0％、98.7％、97.6％和98.7％，2株细菌(js040-6和js046-5)处理的线虫在清水处理前后的击倒率未发生明显变化。然而，另外2株细菌(js040-4和js055-3)处理的松材线虫部分恢复活性，清水处理1h后，其击倒率分生明显变化，分别降至78.3％和33.8％，2-3h后达到一个较为稳定的数值。因此，使用携带有大量细菌的松材线虫虫株进行生测、生测后未经清水处理即统计细菌对线虫的击倒率会对试验结果造成一定的影响，其结果并不理想。
表1细菌发酵滤液对松材线虫的击倒作用
表中，ck1为无菌水，ck2为lb培养基。
实施例2
一种快速筛选杀松材线虫细菌的方法，包括以下步骤：
(1)选取松材线虫ama3c1虫株，参照朱丽华等的方法(cn102084849a)制备无细菌松材线虫(bfama3c1)，备用。
(2)配制lb液体培养基(配方：酵母提取物5g，胰化蛋白胨10g，氯化钠10g，水1000ml)，调节ph至7.0～7.2，分装至100ml三角瓶中，每瓶30ml，121℃高压灭菌20min，备用。
(3)挑取细菌菌株js040-4、js040-6、js046-5、js055-3的单菌落，接种至上述lb液体培养基中，于28℃，200rpm/min转速摇床中振荡培养24h。
(4)将步骤(1)培养的无细菌松材线虫(200μl约含线虫10000条)接种至96孔生化板各孔中，然后将步骤(3)不同细菌菌株的24h培养液等体积添加至已含松材线虫的96孔生化板各孔中，以相同体积的无菌水和lb培养基为对照，25℃条件下共培养24h。
(5)将96孔板取出，从微孔中吸取线虫悬液(每孔取20μl，重复3次)用于后续统计线虫击倒率，其余的6000rpm/min离心5min，去除上清，每孔加入400μl清水(无菌水)重悬，分别于1h、2h、3h后取出，显微镜下统计细菌对松材线虫的击倒率(僵直或蜷曲不动的虫体视为被击倒)。
显微镜下观察结果显示，lb培养液处理的无菌松材线虫悬液依然清澈，无任何细菌繁殖，统计结果(表2)表明，lb培养液处理的无菌松材线虫未经清水恢复的，击倒率4.8％，清水处理1-3h后，线虫击倒率与未经清水处理的基本一致，分别为4.1％、2.6％和2.9％。无菌水对照组中，未经清水恢复以及清水恢复1h、2h和3h松材线虫死亡率基本保持一致，分别为2.1％、2.4％、2.6％和2.2％。4株细菌发酵滤液处理、未经清水恢复的松材线虫，其击倒率分别为71.0％、99.5％、99.6％和31.7％，使用清水处理后其击倒率未发生明显变化。4株菌中，js040-6和js046-5杀线能力较强，击倒率达到95％以上，即为筛选出的杀松材线虫细菌，可对其进行进一步的鉴定研究，js040-4次之，js055-3较弱。
说明使用无菌松材线虫作为生测对象、测试结束时将发酵滤液离心去除并添加清水进行恢复，可以有效避免未经无菌化处理的线虫体表细菌造成的影响，能更准确地评价待测细菌的杀线作用，可用于快速筛选杀松材线虫细菌。
表2细菌发酵滤液对松材线虫的击倒作用
表中，ck1为无菌水，ck2为lb培养基。
实施例3
一种快速筛选杀松材线虫细菌的方法，包括以下步骤：
(1)选取松材线虫ama3c1虫株，参照朱丽华等的方法(cn102084849a)制备无细菌松材线虫(bfama3c1)，备用。
(2)配制lb液体培养基(配方：酵母提取物5g，胰化蛋白胨10g，氯化钠10g，水1000ml)，调节ph至7.0～7.2，分装至100ml三角瓶中，每瓶30ml，121℃高压灭菌20min，备用。
(3)挑取分离纯化自9株松材线虫和2株拟松材线虫的待筛选的47株细菌的单菌落，接种至上述lb液体培养基中，于28℃，200rpm/min转速摇床中振荡培养24h。
(4)将步骤(1)制备的无细菌松材线虫(bfama3c1)接种至96孔生化板各孔中，然后将步骤(3)不同细菌菌株的24h培养液添加至已含松材线虫的96孔生化板各孔中，25℃条件下共培养24h。
(5)将96孔板取出，离心，去除上清，加入等体积无菌水，共培养2h。
(6)将96孔板各孔中线虫取出(每微孔吸取20μl线虫悬液)，显微镜下统计细菌对松材线虫的击倒率(僵直或蜷曲不动的虫体视为被击倒)。
统计结果如图1所示，表明部分菌株如yw4-3、yw4-4、wys-3、jso67d(b.m)-1、ama3c1-1、an19-2和an19-6等7株菌对bfama3c1的击倒率达95％以上，即为筛选出的杀松材线虫细菌，可对其进行进一步的鉴定研究；而jso67d(b.m)-4、mg2-4、mg2-5、ama3c1-2、aa3-4处理bfama3c1的击倒率与无菌水处理和lb培养液处理结果差异不显著，说明这几个菌对bfama3c1影响不大。
综上所述，本发明利用96孔生化板进行杀线虫细菌的筛选，先将无菌松材线虫悬浮液与待测细菌菌株培养液在96孔板中共培养24小时，然后离心，去除上清，再加入无菌水与线虫共培养2小时，然后统计被击倒的线虫数量，每菌株重复3次，分别以无菌水、lb培养液为对照，一次可筛选30个菌株，击倒率达到95％以上，即为筛选出的杀松材线虫细菌，可对其进行进一步的鉴定研究。该方法不仅克服了松材线虫体表或体内细菌对试验的干扰，且克服了有些细菌作用于线虫造成其昏迷、而非真正死亡的不确定问题，是一种简便、快速、准确的杀线虫细菌筛选方法。