本发明涉及一种分离筛选人体肠道中发酵乳杆菌的培养基及其应用，属于微生物
技术领域：
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背景技术：
：发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)属于乳杆菌科中的乳杆菌属，为异型发酵乳杆菌，革兰氏染色阳性，代谢类型为兼性厌氧，最适生长温度为30～37℃。发酵乳杆菌是人体肠道常驻菌群之一，主要黏附在小肠上皮细胞。2011年发酵乳杆菌被列入我国《可用于食品的菌种名单》，它还通过美国食品药品监督管理局的gras(一般认为安全的物质)认定。其中，发酵乳杆菌cect5716更是在2016年6月被中国卫生部列入《婴幼儿可食用菌种名单》。研究表明，发酵乳杆菌作为可用于食品的益生菌菌种之一，可以耐受人体肠道低酸、高胆盐环境，在胃肠道环境中适应能力强。发酵乳杆菌在免疫调节(结肠炎，肠应激综合征等)，拮抗致病菌(沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，念珠菌，链球菌等)，抗氧化，降胆固醇等方面表现出良好的益生作用。发酵乳杆菌作为益生菌，在潜在的益生特性方面具有巨大的研究价值，因此，快速、高效的筛选优良的发酵乳杆菌成为首先要解决的问题，而筛选培养基在筛选过程中最为关键。目前发酵乳杆菌的筛选来源主要来自健康人体肠道及一些发酵食品。申请号为201610827496.9，名称为“发酵乳杆菌特异性培养基及其应用”的中国发明专利申请，公开了一种发酵乳杆菌特异性培养基及其应用，但该培养基仅可应用于发酵乳制品中发酵乳杆菌的特异性培养，并不适宜对于复杂菌相样品的菌种分离。人体肠道中存在丰富多样的微生物，数量高达1014，其中超过99％都是细菌，有500～1000个不同的种类。包括发酵乳杆菌在内的乳杆菌是肠道中的重要益生菌，在人体肠道中常见的乳杆菌不少于20种，但往往丰度较低，不易于筛选。目前从肠道内容物筛选乳杆菌最有效的培养基是lamvab(lactobacillusfermentummrswitharabinoseandthreeantibiotics)培养基，该培养基通过降低ph和添加万古霉素来抑制乳酸菌外其他杂菌的生长，但它仅限于筛选乳酸菌，无法精确到菌种水平。因此，目前并没有用于分离筛选人体肠道中发酵乳杆菌的特异性培养基。技术实现要素：本发明要解决的技术问题，是提供一种提高人体肠道中发酵乳杆菌筛选分离效率的培养基，它含有链霉素，万古霉素，庆大霉素和碳源等物质，能够抑制人体肠道非乳杆菌和其它常见乳杆菌的生长，从而对人体肠道中发酵乳杆菌进行分离筛选。本发明还提供了人体肠道中发酵乳杆菌的分离筛选方法，利用上述培养基液体管对肠道中发酵乳杆菌先进行富集再稀释涂布在筛选培养基固体平板上，使肠道中丰度非常低的发酵乳杆菌能够快速富集。为解决上述技术问题，本发明的第一个目的是提供一种人体肠道筛选分离发酵乳杆菌的培养基lfmata(lactobacillusfermentummrswitharabinoseandthreeantibiotics)，按照重量计包含如下成分：蛋白胨8～15g，牛肉膏8～15g，酵母粉3～10g，吐温801～3g，磷酸氢二钾2～3g，乙酸钠2～5g，柠檬酸二铵1～3g，七水硫酸镁0.4～0.6g，一水硫酸锰0.15～0.25g，碳源8～20g，万古霉素20×10-3g，链霉素0.256g，庆大霉素6.4×10-2g，l-半胱氨酸0.5g，蒸馏水定容到1000ml。在本发明的一种实施方式中，所述培养基还含有琼脂10～20g/l。在本发明的一种实施方式中，所述碳源包括阿拉伯糖。在本发明的一种实施方式中，所述培养基的唯一碳源为阿拉伯糖；在本发明的一种实施方式中，所述培养基中每1l含有抗生素的质量为：万古霉素20×10-3g；链霉素0.256g；庆大霉素6.4×10-2g；所有抗生素均以溶液形式经滤器过滤灭菌。在本发明的一种实施方式中，所述培养基除抗生素外，经过115℃灭菌20min，培养基的ph为5.0±0.1。本发明的第二个目的是提供所述培养基在筛选或培养微生物方面的应用。本发明的第三个目的是提供一种制备所述培养基lfmata的方法，所述方法包括如下步骤：(1)称取蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，磷酸氢二钾2.6g，乙酸钠2g，柠檬酸氢二铵2g，七水硫酸镁0.5g，一水硫酸锰0.25g，阿拉伯糖20g，l-半胱氨酸0.5g放入容器中，加蒸馏水定容到969ml，用4mhcl调ph至5.0±0.1，115℃灭菌20分钟；(2)取0.1g万古霉素溶于50ml水中，配成浓度为2mg/ml的溶液a；取0.128g庆大霉素溶于20ml水中，配成浓度为6.4mg/ml溶液b；取0.512g链霉素溶于20ml水中，配成浓度为25.6mg/ml的溶液c；将溶液a、b、c分别过滤膜灭菌；(3)将步骤1灭菌后的混合物冷却至55℃，加入步骤2中溶液a10ml，溶液b10ml，溶液c10ml，混合均匀，即得到lfmata液体培养基。在本发明的一种实施方式中，所述方法在步骤(1)中加入琼脂20g，其余步骤不变，制备获得lfmata固体培养基。本发明的第四个目的是提供一种分离人体肠道样品中发酵乳杆菌的方法，包括如下步骤：(1)富集培养：取0.1～0.5g肠道内容物，在无菌条件下加入至5mllfmata液体培养基中，35℃～37℃厌氧条件下富集培养18～24h；(2)梯度稀释：步骤(1)液体管振荡器振荡混匀，取1ml混悬液置于9ml生理盐水中，充分混匀，得到10-1稀释液，重复上述稀释步骤，依次得到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释液；(3)涂布培养：分别吸取100ul上述10-4、10-5、10-6三个梯度稀释液于lfmata固体培养基上，用涂布棒涂布均匀，至37℃厌氧条件下培养48h；(4)一级纯化培养：取菌落数在30-300区间的稀释涂布平板，每个样本随机挑选10个形态大小各异的单菌落在mrs固体平板上划线，放至37℃厌氧条件下培养48h。(5)二级纯化培养：取步骤(4)划线平板上单菌落接液体mrs管，至37℃厌氧条件下培养20h。(6)菌种保存：将二级纯化培养菌悬液与灭菌60％甘油以1:1比例混合均匀，最终甘油浓度为30％，将混合液分装在冻存管中，冷冻保藏于-80℃超低温冰箱。(7)菌种鉴定：取步骤(6)剩余菌悬液离心获取菌泥，菌泥用无菌生理盐水重悬清洗后用于16sdnapcr扩增，扩增序列送测鉴定。本发明还要求保护所述方法在分离、鉴定发酵乳杆菌方面的应用。有益效果：(1)本发明在lamvab筛选培养基的基础上进行改进，除了添加万古霉素，还添加链霉素和庆大霉素两种抗生素，并且限制碳源为阿拉伯糖，使得人体肠道中非乳杆菌和常见除发酵乳杆菌之外的乳杆菌生长得到抑制，大大提高了从人体肠道筛选分离发酵乳杆菌的效率。(2)本发明还详述了分离筛选发酵乳杆菌培养基的配制方法和筛选应用步骤。相比一般筛菌过程，本发明利用筛选培养基液体管对发酵乳杆菌进行富集培养，再进行稀释涂布，划线纯化，接液体管等一般的筛菌流程，主要用于筛选人体肠道中低丰度发酵乳杆菌。具体实施方式实施例1：基于乳杆菌宏基因组探究人体肠道菌群中乳杆菌组成人体肠道菌群乳杆菌宏基因组测序技术流程：(1)从-80℃冷冻冰箱取出南通地区10个人群肠道内容物样本，待解冻过后，利用枪头取出0.2g肠道内容物样品用于dna提取；(2)利用粪便dna试剂盒(fastdnaspinkitforfeces,mp)从(1)所述10个肠道内容物中分离提取基因组dna；(3)乳杆菌groel基因扩增：(ⅰ)取步骤(2)所述基因组dna1ul作为pcr模板。(ⅱ)所用pcr引物为乳杆菌groel基因特异性扩增引物：308f-tgaagaaygtnryngcygg，806r-aangtnccvcgvatcttgt，扩增片段长度为499bp。(ⅲ)pcr反应体系为：25ul的premixtaq(takarataqversion2.0plusdye，takara)，1ul的308f，1ul的806r，2ul的dna模板，21ul的双蒸水。(ⅳ)pcr反应条件为：95℃，5min；35个循环(95℃，30s；55℃，40s；72℃，40s)；72℃，5min；12℃，10min。(ⅴ)经过上述pcr一系列过程得到肠道内容物细菌dna乳杆菌groel基因扩增产物。(4)pcr产物的鉴定和回收：(ⅰ)取步骤(3)pcr产物3ul点入加有染料的1.0％的琼脂糖凝胶上进行电泳，110v电泳30min，结束后再紫外凝胶成像仪上进行鉴定。(ⅱ)将所有阳性pcr产物在大孔回收胶中进行电泳，点样量为45ul，琼脂糖浓度为1.5％，110v电泳30min。在紫外灯下，对照100bpdnaladdermarker，切下499bp左右的dna条带放入1.5mlep管中。(ⅲ)用琼脂糖凝胶回收试剂盒(qiaquickgelextrationkit，qiagen)对上述dna条带进行回收纯化。(5)使用多功能酶标仪对步骤(4)纯化dna进行浓度测定。(6)定量和等质量混样及文库构建。(7)miseqpe300上机测序。(8)下机数据处理分析。南通地区10个人群肠道内容物样本(s1，s2，s3，s4，s5，s6，s7，s8，s9，s10)乳杆菌宏基因组分析结果如下：表1-1:10个人群(来自南通地区)肠道内容物乳杆菌组成特征分析表1-2:10个人群(来自南通地区)肠道内容物样本中乳杆菌组成特征分析注：l为lactobacillus缩写。如表1-1、1-2所示，基于南通地区10份人群肠道内容物样本的乳杆菌宏基因组测序结果，我们发现l.johnsonii,l.mucosae和l.salivarius在人体肠道中丰度最高，而l.casei,l.crispatus,l.frumenti,l.reuteri和l.vaginalis含量虽然很低，但在人体肠道中也是普遍存在的。以这十个人群样本为例，我们选取这21种乳杆菌作为人群肠道常见乳杆菌。实施例2：肠道内容物样本在乳杆菌基础培养基lamvab上的菌种筛选应用lamvab培养基的配方包括如下组分(以1l计)：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，磷酸氢二钾2.6g，乙酸钠2g，柠檬酸二铵2g，七水硫酸镁0.5，一水硫酸锰0.25，阿拉伯糖20g，万古霉素20×10-3g，l-半胱氨酸0.5g，溴甲酚绿0.05g，吐温801g，水1000ml。上述培养基的配制步骤如下：(1)称取蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母5g粉，磷酸氢二钾2.6g，乙酸钠2g，柠檬酸氢二铵2g，七水硫酸镁0.5g，一水硫酸锰0.25g2，葡萄糖20g，l-半胱氨酸0.5g，琼脂20g放入容器中，加蒸馏水定容到969ml，用4mhcl调ph至5.0±0.1，115℃灭菌20分钟；(2)取0.1g万古霉素溶于50ml水中，配成浓度为2mg/ml的溶液；(3)称取0.25g溴甲酚绿溶于100ml95％乙醇溶液中，配成浓度为2.5mg/ml的溴甲酚绿溶液；(4)将步骤1灭菌后的混合物冷却至55℃，加入步骤(2)中万古霉素溶液10ml，步骤(3)中溴甲酚绿溶液10ml，混合均匀，即得到本发明的固体培养基。利用上述培养基分离筛选人体肠道样品中微生物的步骤如下：(1)稀释涂布：取得的肠道内容物以1％的接种量接种于无菌生理盐水中，梯度稀释至浓度为10-1-10-5，从10-3，10-4和10-5三个梯度稀释液中取100ul涂布于上述lamvab固体培养基上；(2)一级纯化培养：取菌落数在30-300区间的稀释涂布平板，每个样本随机挑选10个形态大小各异的单菌落在mrs固体平板上划线，放至37℃厌氧条件下培养48h；(3)二级纯化培养：取步骤(2)划线平板上单菌落接液体mrs管，至37℃厌氧条件下培养20h；(4)菌种保存：将二级纯化培养菌悬液与灭菌60％甘油以1:1比例混合均匀，最终甘油浓度为30％，将混合液分装在冻存管中，冷冻保藏于-80℃超低温冰箱；(5)菌种鉴定：取步骤(4)剩余菌悬液离心获取菌泥，菌泥用无菌生理盐水重悬清洗后用于16sdnapcr扩增，扩增序列送测鉴定。以南通地区5个人群肠道内容物样本(a1，a2，a3，a4，a5)在lamvab培养基上筛菌结果为例，实验结果如下(每个样本挑选10株菌)：表25个人群肠道内容物样本在lamvab培养基上的筛菌结果汇总由表2可知，来自南通地区的5个肠道样本在lamvab培养基上共筛选得到50株菌，其中发酵乳杆菌数量只有4株，这4株菌来自3个人体样本。除了实施例1中出现的乳杆菌，还得到了其他乳酸菌，包括leuconostoccitreum,wessellacibaria,weissellaparamesenteroides和pediococcuspentosaceus，并且他们的出现频率很高。实施例3：培养基的碳源选择和优化针对实施例1-2所述，人体肠道中常见乳杆菌以及能在现有乳杆菌特异培养基lamvab上生长的乳酸菌大约为25种。针对这25种菌，我们首先探究了它们对不同碳源的利用情况。实验结果如下：表3人体肠道常见25种乳酸菌对不同糖的利用情况注：“+”表示能利用；“-”表示不能利用；“/”表示未知。根据人肠道中各种菌对不同糖的利用情况，我们选择阿拉伯糖作为选择培养基的碳源。而除了发酵乳杆菌能利用阿拉伯糖，还有11株菌也能利用阿拉伯糖，分别为发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)，胃窦乳杆菌(lactobacillusantri)，短乳杆菌(lactobacillusbrevis)，黏液乳杆菌(lactobacillusmucosae)，罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteri)，清酒乳杆菌(lactobacillussake)，柠檬明串珠菌(leuconostoccitreum)，戊糖片球菌(pediococcuspentosaceus)，lactobacillusfrumenti，融和魏斯氏菌(wessellacibaria)以及类肠膜魏斯氏菌(weissellaparamesenteroides)。实施例4：培养基的抗生素选择和优化本实施例在实施例3的基础上对能利用阿拉伯糖的11株菌(发酵乳杆菌，胃窦乳杆菌，短乳杆菌，黏液乳杆菌，罗伊氏乳杆菌，清酒乳杆菌，lactobacillus.frumenti，柠檬明串珠菌，戊糖片球菌，融和魏斯氏菌和肠膜魏斯氏菌)进行抗生素敏感性实验，具体方法参考iso10932-2010。实验结果如下。表4不同菌株对不同抗生素的最低抑菌浓度(minimuminhibitoryconcentration,mic)表5不同菌株对不同抗生素的最低抑菌浓度(minimuminhibitoryconcentration,mic)mic(ug/ml)氯霉素庆大霉素万古霉素利福平氨苄青霉素青霉素g发酵乳杆菌2128rr0.1250.125胃窦乳杆菌464r///短乳杆菌/128r/0.125/黏液乳杆菌4256r///罗伊氏乳杆菌832r///清酒乳杆菌//r///lactobacillus.frumenti4128r///柠檬明串珠菌864r///戊糖片球菌4rrr21融和魏斯氏菌432r///类肠膜魏斯氏菌28r///注：s表示测量范围内最低浓度仍抑制；r表示测量范围内最高浓度仍耐；/表示未知其中，上述各种抗生素的测量浓度范围为：克林霉素，0.032ug/ml-16ug/ml；环丙沙星，0.25ug/ml-128ug/ml；新霉素，0.5ug/ml-256ug/ml；链霉素，0.5ug/ml-256ug/ml；四环素，0.125ug/ml-64ug/ml；红霉素，0.016ug/ml-8ug/ml；氯霉素，0.125ug/ml-64ug/ml；庆大霉素，0.5ug/ml-256ug/ml；万古霉素，0.25ug/ml-128ug/ml；利福平，0.125ug/ml-64ug/ml；氨苄青霉素，0.032ug/ml-16ug/ml；青霉素g，0.016ug/ml-8ug/ml。从表4和5可以看出，上述能在乳酸菌培养基中生长的菌都能耐受高浓度的万古霉素，因此万古霉素不能作为它们的筛选条件。上述乳酸菌对链霉素的耐受能力有明显差异，而发酵乳杆菌对最高浓度的链霉素也耐受，因此选择浓度为256ug/ml的链霉素来抑制胃窦乳杆菌，短乳杆菌，粘液乳杆菌，清酒乳杆菌，lactobacillusfrumenti，柠檬明串珠菌和戊糖片球菌这7种菌的生长。虽然链霉素可以抑制这7种乳酸菌的生长，但是它不能抑制罗伊氏乳杆菌，融和魏斯氏菌和类肠膜魏斯氏菌的生长，从庆大霉素耐受结果看出，这3种菌对庆大霉素的耐受能力均没有发酵乳杆菌强，因此选择浓度为64ug/ml的庆大霉素来抑制罗伊氏乳杆菌，融和魏斯氏菌和类肠膜魏斯氏菌的生长。至此，在乳酸菌培养基基础上替换碳源再添加特定浓度的链霉素和庆大霉素用来筛选人体肠道中发酵乳杆菌的培养基就形成了。实施例5：lfmata培养基分离筛选人体肠道中发酵乳杆菌的效果验证lfmata固体培养基的配方包括如下组分(以1l计)：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，磷酸氢二钾2.6g，乙酸钠2g，柠檬酸二铵2g，七水硫酸镁0.5，一水硫酸锰0.25，阿拉伯糖20g，万古霉素20×10-3g，链霉素0.256g，庆大霉素6.4×10-2g，l-半胱氨酸0.5g，吐温801g，水1000ml。上述培养基的配制步骤如下：(1)称取蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母5g粉，磷酸氢二钾2.6g，乙酸钠2g，柠檬酸氢二铵2g，七水硫酸镁0.5g，一水硫酸锰0.25g，阿拉伯糖20g，l-半胱氨酸0.5g，琼脂20g放入容器中，加蒸馏水定容到969ml，用4mhcl调ph至5.0±0.1，115℃灭菌20分钟；(2)取0.1g万古霉素溶于50ml水中，配成浓度为20mg/ml的母液a；取0.128g庆大霉素溶于20ml水中，配成浓度为6.4mg/ml母液b；取0.512g链霉素溶于20ml水中，配成浓度为25.6mg/ml的母液c。将母液a、b、c分别过滤膜灭菌；(3)将步骤1灭菌后的混合物冷却至55℃，加入步骤2中母液a10ml，母液b10ml，母液c10ml，混合均匀，即得到本发明的固体培养基。上述培养基在分离人体肠道样品中发酵乳杆菌的应用方法如下：(1)富集培养：取0.5g左右肠道内容物无菌操作加入5ml上述人体肠道中分离筛选发酵乳杆菌培养基液体管(上述培养基不加琼脂)，37℃厌氧条件下富集培养24h；(2)梯度稀释：步骤(1)液体管振荡器振荡混匀，取1ml混悬液置于9ml生理盐水中，充分混匀，得到10-1稀释液，重复上述稀释步骤，依次得到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释液；(3)涂布培养：分别吸取100ul上述10-4、10-5、10-6三个梯度稀释液于人体肠道中分离筛选发酵乳杆菌培养基固体平板上，用涂布棒涂布均匀，至37℃厌氧条件下培养48h；(4)一级纯化培养：取菌落数在30-300区间的稀释涂布平板，每个样本随机挑选10个形态大小各异的单菌落在mrs固体平板上划线，放至37℃厌氧条件下培养48h。(5)二级纯化培养：取步骤(4)划线平板上单菌落接液体mrs管，至37℃厌氧条件下培养20h。(6)菌种保存：将二级纯化培养菌悬液与灭菌60％甘油以1:1比例混合均匀，最终甘油浓度为30％，将混合液分装在冻存管中，冷冻保藏于-80℃超低温冰箱。(7)菌种鉴定：取步骤(6)剩余菌悬液离心获取菌泥，菌泥用无菌生理盐水重悬清洗后用于16sdnapcr扩增，扩增序列送测鉴定。实施例2所述5个肠道内容物样本(a1，a2，a3，a4，a5)在lfmata培养基上筛菌结果如下(每个样本挑选10株菌)：表6实施例2所述5个肠道内容物在本发明培养基上的筛菌结果注：本表中的菌株均为独立存在的不同菌株。上述5个肠道内容物样本在lamvab培养基和lfmata培养基上的筛菌结果对比结果如下(每个样本挑选10株菌)：表7实施例2所述5个肠道内容物在两种培养基上的筛菌结果汇总由表6及表7可知，实施例2所述5个肠道样本在lfmata培养基上共筛选得到50株菌，其中发酵乳杆菌数量达到29株，来自5个样本。与实施例2相比，发酵乳杆菌出现的频率由原来的4提升到了29，由2个样本来源提高到了5个样本来源，筛选效率得到了很大的提高。说明本发明培养基对于筛选人体肠道中低丰度的发酵乳杆菌具有明显的优势。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。当前第1页12