本发明涉及到生物化学与分子生物学技术领域，特别涉及一种嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因分泌表达方法。
背景技术
脂肪酶(lipase，e.c.3.1.1.)，又叫甘油脂水解酶(triacylglycerolacylhydrolase)，是一种可以分解脂肪、具有脂质降解能力的蛋白酶。脂肪酶可以将三酰甘油酯水解为脂肪酸、二酰甘油酯、单酸甘油酯和甘油。脂肪酶的天然底物一般是不溶于水的长链脂肪酸酰基酯，其反应特点是在油水界面起催化作用(1)。根据底物的性质，可划分为脂肪酶，酯酶，磷脂酶，或角质酶。脂肪酶是最重要的工业用酶之一，被广泛应用于食品、饲料、洗涤、制革、医药、油酯化工等领域。由于生物酶法合成生物柴油，即利用脂肪酶在非水相中的转酯化反应将动植物油脂和低碳醇催化制备成相应的脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯，具有条件温和及无排放污染等优点，脂肪酶在绿色能源领域近年来也得到越来越多的应用。
来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌t1菌株(geobacillusstearothermophilusstraint1)的脂肪酶(genbank登录号jc8061),是一种耐热性碱性脂肪酶(e.c.3.1.1.3)。其对不同碳链的天然或合成的底物都表现出活性，尤其偏爱c4-c16的底物，最适底物是c8的底物。嗜热脂肪土芽孢脂肪酶在各种洗涤剂成分存在下，例如表面活性剂或其它洗涤剂成分存在下，仍具有羧酸酯水解酶活性，可以水解脂质。这一特性使得该脂肪酶非常适合应用于洗涤剂工业。另外，该脂肪酶还具有转酯化的能力，可将脂肪酸和乙醇催化反应成脂肪酸乙酯。
巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)是近年来越来越受到重视的一个高效的真核表达系统。该表达系统具有许多独特的优点，并己迅速发展成为分子生物学领域中被广泛用于重组蛋白生产的主要手段之一。毕赤酵母作为真核表达系统具有以下优势:(1)毕赤酵母生长迅速，在简单合成培养基中可实现高密度培养；(2)毕赤酵母具有精确调控的启动子，包括甲醇依赖型启动子或非甲醇依赖型组成型启动子，都可以高效表达目的外援蛋白；(3)外源蛋白表达效率高，而自身分泌蛋白少，其表达的外源蛋白可占总分泌表达蛋白的90％以上，有利于外源目的蛋白的分离纯化；(4)毕赤酵母具有真核生物特有的蛋白翻译后修饰、折叠及高效分泌，可以克服原核表达系统的可溶性蛋白表达量低、及单位质量蛋白的酶活性低等缺陷。因此，毕赤酵母成为近年来作为表达外源目的蛋白最有前途的表达系统。
但是，嗜热脂肪土芽孢脂肪酶只有在细菌中成功表达的报道(2)。我们发现，嗜热脂肪土芽孢脂肪酶在巴斯德毕赤酵母表达系统中表达时，遇到的主要问题就是表达产物出现了不同程度的降解。分泌表达的完整嗜热脂肪土芽孢脂肪酶的大小应为46kda,但我们也发现了其它小分子质量的产物。这些小分子量产物具有与嗜热脂肪土芽孢脂肪酶相同的n-端氨基酸序列,而且这些片段的c末端含有成对的碱性氨基酸残基。进一步的研究发现,该脂肪酶的特征性降解是由酵母细胞中存在的钙离子依赖性丝氨酸内切蛋白酶(kexin,ec3.4.21.61)引起的。丝氨酸内切蛋白酶是酵母细胞自身编码的一种前体加工酶,位于酵母细胞膜上,该酶的作用位点是双碱性氨基酸残基,它主要负责大多数酵母蛋白的分泌与成熟,如信号肽或前导肽的加工处理等(3-5)。我们在嗜热脂肪土芽孢脂肪酶的成熟肽序列中发现了3个潜在的丝氨酸内切蛋白酶的特异性识别位点kex2(6)。
技术实现要素：
发明的目的在于提供一种嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因分泌表达方法，通过定点突变的方法，改变了嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽序列中3个潜在的丝氨酸蛋白酶识别位点kex2，在毕赤酵母中获得了完整表达的、酶活性更高的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶，克服了该脂肪酶在细菌表达系统中表达量较低、单位质量的脂肪酶活性较低等缺陷，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因分泌表达方法，包括如下步骤：
步骤一：genbank中搜索获得嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽基因，按照毕赤酵母对遗传密码子的喜好性对嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽基因进行密码子优化；
步骤二：按照定点突变pcr的要求，分别设计三对引物；分别为:
a1:gttgccagaattgaagcaaggtggtagaatcca；
a2:tggattctaccaccttgcttcaattctggcaac；
b1:tcgaaagattgaagcaatccccagtttggac；
b2:gtccaaactggggattgcttcaatctttcga；
c1:tgaacggtccaaagcaaggttcttctgatag；
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交由idt进行引物合成；
步骤三：以a1和a2为引物，进行pcr反应定点突变r103q，以b1和b2为引物，进行pcr反应定点突变r230q，再以c1和c2为引物，进行pcr反应定点突变r330q；
步骤四：对三轮kex2定点突变后的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽基因进行测序，测序结果显示通过定点突变pcr后的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因序列与预先设计的序列一致；
步骤五：将合成的野生型或kex2定点突变的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽基因与毕赤酵母表达质粒分别进行酶切，胶回收酶切片段，t4连接酶连接两者后转化大肠杆菌，获得含有启动子-α因子信号肽-嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽基因的表达质粒的菌株，挑克隆提取质粒后测序；
步骤六：提取上述菌株中经测序鉴定的质粒，酶切线性化后电转化pep4/prb1双蛋白酶缺陷型巴斯德毕赤酵母感受态细胞，转化后的细胞涂布于带有不同浓度的zeocin抗性的ypd平板，挑克隆，对克隆进行小量发酵培养，检测酶活力，以获得新型高效的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因的毕赤酵母工程菌。
优选的，成熟肽序列中3个潜在的丝氨酸蛋白酶识别位点kex2被改变为其它氨基酸残基并按毕赤酵母偏爱密码子设计的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因。
优选的，表达载体为含有高效甲醇诱导启动子aox1或非甲醇依赖性的组成型启动子gap的质粒。
优选的，步骤一中由genscript对优化过的基因进行合成，合成的基因序列由macrogen进行测序，测序结果与预先设计的基因序列一致。
优选的，步骤三中氨基酸编号以嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽的第一个氨基酸为1。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明采用毕赤酵母表达系统以及按照毕赤酵母喜好性优化密码子后的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因，更有利于该脂肪酶的翻译后修饰、折叠及高效分泌。通过定点突变嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽序列中的三个丝氨酸蛋白酶识别位点kex2，避免了分泌的脂肪酶被酵母细胞内源性丝氨酸内切蛋白酶kexin降解，在毕赤酵母中获得了完整表达的、高酶活的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶。这在嗜热脂肪土芽孢脂肪酶的研究领域尚属首次，为嗜热脂肪土芽孢脂肪酶的大规模工业化生产提供了可靠保障。
附图说明
图1为本发明的不同p-np底物存在下脂肪酶的活性柱状图；
图2为本发明的ph对脂肪酶活性的影响折线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因分泌表达方法，包括如下步骤：
步骤一：genbank中搜索获得嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽基因，按照毕赤酵母对遗传密码子的喜好性对嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽基因进行密码子优化；
步骤二：按照定点突变pcr的要求，分别设计三对引物；分别为:
a1:gttgccagaattgaagcaaggtggtagaatcca；
a2:tggattctaccaccttgcttcaattctggcaac；
b1:tcgaaagattgaagcaatccccagtttggac；
b2:gtccaaactggggattgcttcaatctttcga；
c1:tgaacggtccaaagcaaggttcttctgatag；
c2:ctatcagaagaaccttgctttggaccgttca；
交由idt进行引物合成；
步骤三：以a1和a2为引物，进行pcr反应定点突变r103q，以b1和b2为引物，进行pcr反应定点突变r230q，再以c1和c2为引物，进行pcr反应定点突变r330q；
步骤四：对三轮kex2定点突变后的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽基因进行测序，测序结果显示通过定点突变pcr后的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因序列与预先设计的序列一致；
步骤五：将合成的野生型或kex2定点突变的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽基因与毕赤酵母表达质粒分别进行酶切，胶回收酶切片段，t4连接酶连接两者后转化大肠杆菌，获得含有启动子-α因子信号肽-嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽基因的表达质粒的菌株，挑克隆提取质粒后测序；
步骤六：提取上述菌株中经测序鉴定的质粒，酶切线性化后电转化pep4/prb1双蛋白酶缺陷型巴斯德毕赤酵母感受态细胞，转化后的细胞涂布于带有不同浓度的zeocin抗性的ypd平板，挑克隆，对克隆进行小量发酵培养，检测酶活力，以获得新型高效的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因的毕赤酵母工程菌。
实施例1
嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因的密码子优化及合成
genbank中搜索获得嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽基因(seqidno.4)，在嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽氨基酸序列(seqidno.4)的基础上，采用毕赤酵母偏好的遗传密码子替换嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因在毕赤酵母中使用频率较低的密码子，设计出在毕赤酵母中使用频率高的基因序列，其具体核昔酸序列如seqidno.3所示，从而提高嗜热脂肪土芽孢脂肪酶在酵母中的表达量。由genscript对优化过的基因进行合成。合成的基因序列送交macrogen进行测序，测序结果与预先设计的基因序列完全一致；
实施例2
毕赤酵母表达质粒的构建
采用限制性内切酶xho1/ecor5双酶切上述合成的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽基因，以及含有高效甲醇诱导启动子aox1的酵母表达质粒(pd912,dna2.0)，或含有非甲醇依赖型组成型启动子gap的酵母表达质粒(pd915,dna2.0)。胶回收酶切后产物，并将二者(酶切后的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶和酵母表达质粒载体)用t4连接酶连接后转化大肠杆菌top10感受态细胞。筛选并得到重组质粒的阳性克隆(含有启动子-α因子信号肽-嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽基因表达盒)，送交macrogen进行测序，阳性克隆基因序列与预期目标基因序列完全一致；
实施例3
嗜热脂肪土芽孢脂肪酶毕赤酵母工程菌的构建
以电击法将bamh1线性化的上述重组质粒,转化野生型毕赤酵母宿主(dna2.0，pps-9010)或pep4/prb1双蛋白酶缺陷型巴斯德毕赤酵母(dna2.0，pps-9016)感受态细胞。转化后的细胞涂布于带有不同浓度的0.2mg/ml–0.8mg/mlzeocin抗性的ypd平板，培养3-5天，将高浓度zeocin-ypd平板上出现的转化子挑取单克隆，进行小量发酵培养鉴定；
实施例4
表达嗜热脂肪土芽孢脂肪酶的毕赤酵母工程菌的培养和酶活测定
挑取含有高效甲醇诱导启动子aox1的重组转化子单克隆接种于20mlbmgy培养基中，28-30℃，250rpm/min振荡培养160h至od600到3,离心收集菌体，再将其悬浮于bmmy培养基中，稀释至od600为1，继续振荡培养，每隔24h向bmmy培养基中补加甲醇至终浓度为1.0％进行诱导表达，发酵6天，每天取上清液，做sds-page检测。而对于含有组成型启动子gap的重组转化子，从高浓度zeocin-ypd平板上挑取单克隆直接接种于2mlypd培养基中，28-30℃，250rpm/min振荡培养48-72h，发酵液在5000rpm、4℃离心15分钟，弃沉淀，取上清液，做sds-page检测。高通量测定各克隆上清液中的脂肪酶酶活力的方法是利用不同碳链的人工合成的对硝基苯酚酯作底物(用dmso配制)，对硝基苯酚酯被脂肪酶水解后会释放出黄色的对硝基苯酚，利用分光光度计，根据对硝基苯酚在a405nm标准浓度的光吸收曲线，计算反应体系中在一定的时间范围內生成的对硝基苯酚，再计算各个样品每分钟分解对硝基苯酚酯产生对硝基苯酚的μg数，即酶活力单位(u)。不仅在野生型毕赤酵母菌株克隆的上清液中没有检测到明显的酶活，即使在pep4/prb1双蛋白酶缺陷型毕赤酵母菌株克隆的上清液中也没有检测到明显的酶活。sds-page显示本应为46kda的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶出现了不同程度的降解。这些小分子量产物具有与嗜热脂肪土芽孢脂肪酶相同的n-端氨基酸序列,而且这些片段的c末端含有成对的碱性氨基酸残基，暗示该脂肪酶的特征性降解可能是由酵母细胞中存在的钙离子依赖性丝氨酸内切蛋白酶kexin引起的。经过进一步的序列分析，在嗜热脂肪土芽孢脂肪酶的成熟肽序列中罕见地发现了三个可能的丝氨酸内切蛋白酶kexin的特异性识别位点kex2；
实施例5
对嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽基因中潜在的kex2进行定点突变
按照定点突变pcr的要求，分别设计三对引物(seqidno.5-10)。
分别为:a1:gttgccagaattgaagcaaggtggtagaatcca,；
a2:tggattctaccaccttgcttcaattctggcaac；
b1:tcgaaagattgaagcaatccccagtttggac；
b2:gtccaaactggggattgcttcaatctttcga；
c1:tgaacggtccaaagcaaggttcttctgatag；
c2:ctatcagaagaaccttgctttggaccgttca。
交由idt进行引物合成。其中a1和a2引物用于定点突变r103q(氨基酸编号以嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽的第一个氨基酸为1)，b1和b2引物用于定点突变r230q,c1和c2引物用于定点突变r330q。定点突变pcr以实施例2中构建的毕赤酵母表达质粒为模板，具体pcr反应体系为：模板1μl；10xpfu聚合酶缓冲液5μl,2.5mmol/ldntp4μl；10μm的上下游引物各1μl，pfudna聚合酶1μl(10u)，加无菌水至总体积为50μl。pcr反应条件为:95℃预变性20s；98℃变性10s，50℃返火15s，72℃延伸6min，共15个循环；第15个循环后72℃延伸10min。pcr产物经过dpn1在37℃处理1h,然后转化大肠杆菌top10感受态细胞。筛选并得到突变质粒的阳性克隆，提取定点突变后的质粒交由macrogen进行测序。经过三轮定点突变后，测序结果显示kex2定点突变后的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因序列与预先设计的序列完全一致，即与seqidno.1所示的核苷酸序列一致；
实施例6
含有kex2突变的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因的毕赤酵母工程菌的构建和酶活测定
将上述实施例5中构建的含有kex2突变的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因的毕赤酵母表达质粒用内切酶bamh1进行线性化处理，然后以电击法将线性化的酵母表达质粒转化pep4/prb1双蛋白酶缺陷型毕赤酵母感受态细胞。转化后的酵母细胞被涂布于带有不同浓度的0.2mg/ml–0.8mg/mlzeocin抗性的ypd平板，培养3-5天，将高浓度zeocin-ypd平板上出现的转化子挑取单克隆，进行小量发酵培养(培养步骤参照实施例4)。发酵培养液经离心后取上清液，做sds-page检测和高通量酶活测定。正如我们所预期的一样，几乎每个含有kex2突变的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因的毕赤酵母工程菌克隆都显示出比细菌表达高很多的脂肪酶水解活力。sds-page显示超过70％的分泌蛋白是全长的46kda的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶，而且没有明显的蛋白降解现象。而含有非甲醇依赖性的组成型启动子gap的酵母表达工程菌克隆比含有甲醇诱导启动子aox1的酵母表达工程菌克隆具有更高的脂肪酶表达量和酶活；
实施例7
毕赤酵母工程菌表达的含有kex2突变的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶的生化特性
选取一个脂肪酶酶活力最高的含有组成型启动子gap的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶酵母表达工程菌克隆，利用c2-c18不同碳链的人工合成的对硝基苯酚酯作底物(用dmso配制)，分光光度计法测定毕赤酵母表达的含有kex2突变的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶对不同碳链底物的活性。如图所示1，酵母表达的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶对不同碳链的底物都表现出活性，尤其偏爱c2-c16的底物，其最适底物是c10的对硝基苯酚酯。而以c10的对硝基苯酚酯作底物，酵母表达的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶在ph3.4-10.0的范围內都有活性，而且如图所示2，ph值越高，酶活力越高，是典型的碱性脂肪酶。
序列表
seqidno.1的信息
<>一种含有新型的kex2突变的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因及其在毕赤酵母中的表达
<>1167
<>dna
<>人工序列
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seqidno.2的信息
<>一种含有新型的kex2突变的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因及其在毕赤酵母中的表达
<>388
<>prt
<>人工序列
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seqidno.3的信息
<>一种含有密码子优化的野生型嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因及其在毕赤酵母中的表达
<>1167
<>dna
<>人工序列
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seqidno.4的信息
<>一种含有密码子优化的野生型嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因及其在毕赤酵母中的表达
<>388
<>prt
<>人工序列
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draceayaqlvggtvdygaahaakhgharfgrtypgllpelkrggrihiiahsqggqtar
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seqidno.5的信息
<>进行kex2定点突变的引物a1
<>33
<>dna
<>人工序列
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seqidno.6的信息
<>进行kex2定点突变的引物a2
<>33
<>dna
<>人工序列
tggattctaccaccttgcttcaattctggcaac
seqidno.7的信息
<>进行kex2定点突变的引物b1
<>31
<>dna
<>人工序列
tcgaaagattgaagcaatccccagtttggac
seqidno.8的信息
<>进行kex2定点突变的引物b2
<>31
<>dna
<>人工序列
gtccaaactggggattgcttcaatctttcga
seqidno.9的信息
<>进行kex2定点突变的引物c1
<>31
<>dna
<>人工序列
tgaacggtccaaagcaaggttcttctgatag
seqidno.10的信息
<>进行kex2定点突变的引物c2
<>31
<>dna
<>人工序列
ctatcagaagaaccttgctttggaccgttca
综上所述，本发明提出的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因分泌表达方法，采用毕赤酵母表达系统以及按照毕赤酵母喜好性优化密码子后的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因，更有利于该脂肪酶的翻译后修饰、折叠及高效分泌。通过定点突变嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽序列中的三个丝氨酸蛋白酶识别位点kex2，避免了分泌的脂肪酶被酵母细胞内源性丝氨酸内切蛋白酶kexin降解，在毕赤酵母中获得了完整表达的、高酶活的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶。这在嗜热脂肪土芽孢脂肪酶的研究领域尚属首次，为嗜热脂肪土芽孢脂肪酶的大规模工业化生产提供了可靠保障。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。