本发明属于水稻白叶枯病原细菌的葡聚糖合成相关基因，尤其涉及一种葡聚糖葡糖基转移酶mdoh基因及其应用。
背景技术
水稻白叶枯病是一种细菌性病害，病原菌属于黄单胞菌属，该菌于1990年被命名为水稻白叶枯病菌(xanthomonas.oryzaepv.oryzae，简称xoo)。水稻白叶枯病原菌为革兰氏阴性杆菌，有鞭毛，没芽孢、荚膜，但分泌胞外多糖。水稻白叶枯病菌通过水孔入侵水稻叶片，从叶尖开始逐渐向下延伸，会产出少量脓液。水稻生长的全部时期都可以感染水稻白叶枯病菌，感染部位主要为叶片，部分为叶鞘。由于水稻品种、染病时期以及气候耕作条件等不同，水稻白叶枯病的具体特征也略有差异。水稻白叶枯病的传播源一般为种子和风雨，不能借助大气环流远程传染，但因为它受气候以及耕作条件的影响可以快速在田间传播，很容易形成地方性水稻流行病，并且逐渐扩散，难以根除。目前该病依旧流行于世界各个主要的水稻产区，因此，对水稻白叶枯病菌的研究与防治有很大意义。
在革兰氏阴性菌中，葡聚糖是低聚糖家族中的一员。在变形菌门的细胞周质间隙中含有低聚糖，有线状、分支或环状的，这些低聚糖对于维护细胞平衡和渗透的适应有重要的作用。在很多植物病原菌中，周质葡聚糖有着几个共同点：1葡萄糖是唯一的本架糖；2周质葡聚糖会随着渗透压的降低而在细胞周质中大量增加。研究表明，葡聚糖可能对于病原菌与植物之间的互作起着重要作用。在黄单胞菌中关于葡聚糖合成相关基因的研究甚少，具体功能和与细菌致病性的关系的尚不明确。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种葡聚糖葡糖基转移酶mdoh基因及其应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
葡聚糖葡糖基转移酶mdoh基因，与序列表中seq.id.no.1的碱基序列具有80％以上同源性。
上述葡聚糖葡糖基转移酶mdoh基因，为序列表中seq.id.no.1的碱基序列。
上述葡聚糖葡糖基转移酶mdoh基因在研制防治水稻白叶枯病的生物农药或制备水稻白叶枯病菌或构建水稻白叶枯病模型中的应用。
上述葡聚糖葡糖基转移酶mdoh基因编码的蛋白质。
上述蛋白质具有序列表seq.id.no.2的氨基酸序列。
上述蛋白质在研制防治水稻白叶枯病的生物农药或制备水稻白叶枯病菌或构建水稻白叶枯病模型中的应用。
包含上述葡聚糖葡糖基转移酶mdoh基因的重组载体。
重组载体的原始载体为原核表达载体plafrj。
缺失上述葡聚糖葡糖基转移酶mdoh基因的水稻白叶枯病菌的突变体菌由包含葡聚糖葡糖基转移酶mdoh基因的重组载体的原始菌突变而来。
发明人研究发现一种与水稻白叶枯病黄单胞菌致病相关的基因——葡聚糖葡糖基转移酶mdoh基因，它具有序列表中seq.id.n0.1的碱基序列，由1836个碱基组成。mdoh基因是葡聚糖合成基因簇中的一员，其编码的蛋白含611个氨基酸，被注释为葡糖基转移酶(glucosyltransferasemdoh)。研究证明，该基因功能的缺失会导致病菌致病力降低，可以当做药物靶标用以研发防治水稻白叶枯病的生物农药，因此在水稻病害防治中有重要应用潜力。本发明报道的水稻白叶枯病菌的致病相关基因对于深入了解病原菌在水稻中的发病机理、建立水稻和病原菌的致病模型、提供药物防治的靶标和药物开发的平台都具有重要意义和价值。
附图说明
图1是mdoh基因克隆的酶切电泳图谱，图中：m：100bpplusmarker(片段大小从上往下依次是：3kb，2kb，1.5kb，1.2kb，1kb，0.9kb，0.8kb，0.7kb等)，1：mdoh基因片段。
图2是mdoh基因缺失突变体dmmodh的pcr验证凝胶图，图中：m：100bpplusmarker；1-4用cmf/r引物pcr验证结果，1-3：dmdoh，4：xook74；5-8用imf/r引物pcr验证结果，5-7：dmdoh，8：xook74。
图3是modh基因突变体生物膜产生情况检测，图中：左为xook74，右为dmdoh。
图4是mdoh基因突变体致病性试验结果图，图中：1：野生型k74；2：modh基因缺失突变体；3：水(阴性对照)。
具体实施方式
以下通过实施例来充分说明本发明如何实施，所用材料包括大肠杆菌(escherichiacoli)株系transformaxtm、ec100dtm、pir+购自epicentre公司，dh5α为申请人保存；pk18mobsacb、plafrj为发明人研究室保存的柯斯质粒；限制性内切酶、连接酶等试剂购自promega公司；总dna提取、质粒提取、pcr产物纯化和胶回收试剂盒购自omega公司。
本发明mdoh基因的序列已在美国国立生物技术信息中心(ncbi)公布，基因序列号nc_010717.2，该基因编码蛋白序列号wp_033013308。携带该基因的质粒pjcmdoh已由申请人制备并保存。
序列表中seq.id.no.1的碱基序列是水稻白叶枯病黄单胞菌k74菌株的dna，由1836个碱基组成。含完整的葡聚糖生物合成葡糖基转移酶mdoh(glucansbiosynthesisglucosyltransferasemdoh)基因，自5’端的第1-611位核苷酸为该基因的开放阅读框(openreadingframe，orf)，自5’端的第1-3位核苷酸为该基因的起始密码子atg，自5’端的第1834-1836位核苷酸为终止密码子tga。
氨基酸序列为序列表seq.id.n0.2的蛋白质是葡糖基转移酶基因编码的葡糖基转移酶产物，由611个氨基酸组成。该蛋白质预测分子量为66980.21道尔顿，等电点为9.13。
实施例1mdoh基因(葡糖基转移酶基因)缺失突变体的构建
将有mdoh基因上、下游200bp片段整合至pk18mobsacb质粒上获得的重组质粒pkdmdoh的大肠杆菌过夜培养，提取重组质粒，制备xook74的电转感受态，通过电转方法将重组质粒pkdmdoh转入黄单胞菌xook74中，借助同源单交换，质粒pkdmdoh可以整合到xook74的基因组中，用kan、sm抗性板筛选，通过在含sm的蔗糖板和含kan、sm抗性板上同时平行点板，进一步确认单交换子。将经确认过的单交换子转接至含sm的ob培养基中，28℃摇床培养24h，稀释涂布在含sm、10％蔗糖的0a板上，放置3-4d，此过程中，单交换子再次发生同源单交换，排除掉交换回野生型的菌株，得到失去mdoh基因的双交换子，即mdoh基因缺失突变体，其缺失突变体编号为dmmodh。
实施例2mdoh基因的克隆及序列测定
根据mdoh的基因序列，设计引物(aaaggatccgagaacttgtgcatcgaa(seq.id.no.3)和tttaagcttccggtgcgaactcagatc(seq.id.no.4))，以水稻白叶枯病黄单胞菌k74菌株总dna为模板，pcr扩增该基因全长序列(95℃10min；95℃30sec；60℃30sec；72℃180sec，35个循环；72℃5min)(图1)，并将其克隆至克隆载体pk18mobsacb中，用双脱氧核苷酸法在abi377dna自动测序仪上测定dna核苷酸序列。将测序验证正确的modh基因序列克隆至原核表达载体plafrj中，获得了含该基因的重组质粒pjmdoh，该质粒用bamhi、hindiii酶切，除了一个22kb的载体条带外，还有一个2115bp的外源片段(图1)。
实施例3mdoh基因缺失突变体的验证
对缺失突变体dmmodh进行pcr验证，提取dmmodh的总dna作模板，用modh基因外部特异引物cmf/r(aaaggatcccgtcactgcaaccgattg(seq.id.n0.5)和tttaagctttcgacctgagccaccgat(seq.id.n0.6))配对进行pcr验证(95℃5min；95℃30sec；60℃30sec；72℃120sec，30个循环；72℃5min)，其产物预期大小为930bp，用野生型k74总dna模板为对照，用相同引物相同条件作对照，其产物预期大小为2700bp(图2)。分别以突变体dmmodh和野生型k74的总dna为模板，用modh基因内部特异引物imf/r(atcgtgcggctggtcgccgg(seq.id.n0.7)和ttcttcgtagctgccctgca(seq.id.n0.8))进行pcr验证(95℃5min；95℃30sec；60℃30sec；72℃30sec，30个循环；72℃5min)，dmmodh预期不能产生条带，k74预期产物大小为369bp(图2)。
实施例4modh基因突变体生物膜产生情况检测
细菌生物膜有助于帮助细菌抵抗不良的生长环境，对细菌生长、致病有很重要的影响，因此非常有必要检测突变体的生物膜产生情况。接种待测的mdoh基因相关突变体菌体于指型瓶内，用加有抗生素的ob培养基培养，放置28℃，220rpm摇床过夜，然后将过夜培养的菌液加入无抗生素的0b培养基统一调成总体积为10ml，od600＝0.1的菌液，混合均匀后，28℃静置3-5天，观察指形瓶的瓶壁是否产生生物膜。由生物膜检测结果可知，mdoh基因缺陷型突变体与野生型的生物膜相比明显减弱，说明mdoh基因的破坏较大地影响了生物膜合成(图3)。
实施例5mdoh基因缺失突变体的致病性试验
实验所用寄主植物为水稻(种名为oryzasatial.japomica.cv.nipponbare)，所用的接种方法为剪叶法(qian，2005)。用活化的野生型k74和突变体mdoh相关突变体，挑取新鲜的菌体用ob培养基28℃液体摇床培养至对数期，用ob液体培养基将菌液浓度统一调整为od600＝0.5。用剪叶法把菌液接种与苗龄为5周左右的水稻叶子上。14天后测量病斑长度。实验重复3次，每个菌样接种不少于100片叶子。由上株实验与病斑长度可知，mdoh基因缺失可导致水稻黄单胞菌致病力急剧下降(图4)。
序列表
<110>广西大学
<120>葡聚糖葡糖基转移酶mdoh基因及其应用
<160>8
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