α-淀粉酶变体的制作方法

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发明领域本发明涉及α-淀粉酶的变体、编码这些变体的多核苷酸、产生这些变体的方法、和使用这些变体的方法。相关技术的说明α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，e.c.3.2.1.1)构成一组酶，这些酶催化淀粉和其他直链和支链1,4-糖苷低聚糖和多糖的水解。α-淀粉酶在工业上用于几种已知应用如洗涤剂、烘焙、酿造、淀粉液化和糖化例如在制备高果糖糖浆中或用作从淀粉生产乙醇的一部分的用途具有悠久历史。α-淀粉酶的这些应用和其他应用是已知的并且利用源自微生物的α-淀粉酶，特别是细菌α-淀粉酶。属于首先被使用的细菌α-淀粉酶是来自地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)的α-淀粉酶，还称作termamyl，所述termamyl已经被充分表征并且这种酶的晶体结构已经被确定。碱性淀粉酶(如aa560)形成一个特定的已经用于洗涤剂中的α-淀粉酶的组。这些已知的细菌淀粉酶中许多已经经修饰以便改进它们在特定应用中的功能性。已经充分研究了增加α-淀粉酶热稳定性的方法。铃木(suzuki)等人(1989)披露了其中已经将解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)α-淀粉酶的指定区域置换为地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的相应区域的嵌合α-淀粉酶。构建这种嵌合α-淀粉酶，目的在于鉴定负责热稳定性的区域。发现这类区域包含解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶的第177-186位氨基酸残基和第255-270位氨基酸残基。五十岚(igarashi)等人1998显示可以通过从环(f178至a184)中缺失两个氨基酸残基r179-g180(amys编号)而增加amys-型淀粉酶的热稳定性。然而，晓(shiau)等人(2003)显示在相同环中具有缺失的amys酶在高温具有比亲本酶更低的玉米淀粉水解比活性，从而否定了amys淀粉酶的主要优点之一。出于环境原因，在洗涤、餐具洗涤和/或清洁过程中降低温度已经日益重要。然而，大多数酶(包括淀粉酶)具有通常在低温洗涤中所用温度以上的最适温度。α-淀粉酶是用于洗涤剂组合物中的关键酶并且对于衣物洗涤或餐具洗涤期间去除淀粉污渍，其用途已经变得日益重要。因此，重要的是找到这样的α-淀粉酶变体，它们在温度降低时保留其洗涤性能、污渍去除作用和/或活性。然而，尽管当前洗涤剂酶组合物的效率，仍然存在着难以彻底去除的许多污渍。这些问题因利用低(例如，冷水)洗涤温度的增加和较短的洗涤周期而加剧。因而，需要获得这样的淀粉分解酶，这些酶可以在低温下起作用并同时保留或增加其他令人希望的特性如比活性(淀粉分解活性)、稳定性和/或洗涤性能。因此，本发明的目的是提供可以在低温如5℃-35℃温度用于洗涤、餐具洗涤和/或清洁过程中的α-淀粉酶变体。本发明的一个另外的目的是提供与亲本α-淀粉酶相比或与seqidno:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中任一者的α-淀粉酶相比具有改善的低温洗涤性能的α-淀粉酶变体。发明简述本发明涉及亲本α-淀粉酶的分离的变体，所述变体包含在与seqidno:1的成熟多肽的g304、w140、w189、d134、e260、f262、w284、w347、w439、w469、g476和g477位置相对应的两个或更多个(几个)位置处的改变，其中每种改变独立地是置换、缺失或插入，并且其中所述变体与seqidnos1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中任一者的成熟多肽具有至少80％但是小于100％的序列一致性，并且其中所述变体具有α-淀粉酶活性。本发明还涉及包含码这些变体的分离的多核苷酸、包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；和产生这些变体的方法。本发明还涉及用于制备这类变体的方法。发明详细说明本发明涉及亲本α-淀粉酶的分离的变体，所述变体包含在与seqidno:1的成熟多肽的g304、w140、w189、d134、e260、f262、w284、w347、w439、w469、g476和g477位置相对应的两个或更多个(几个)位置处的改变，其中每种改变独立地是置换、缺失或插入，并且其中所述变体与与seqidnos1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中任一者的成熟多肽具有至少80％但是小于100％的序列一致性，并且其中所述变体具有α-淀粉酶活性。定义α-淀粉酶活性：术语“α-淀粉酶活性”意指α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(e.c.3.2.1.1)的活性，这些酶构成一组催化淀粉和其他直链和支链1,4-糖苷低聚糖和多糖水解的酶。变体：术语“变体”意指在一个或多个(几个)位置包含改变(即，置换、插入和/或缺失)的具有α-淀粉酶活性的多肽。置换意指将占据某个位置的氨基酸替换为不同的氨基酸；缺失意指去除占据某个位置的氨基酸；并且插入意指邻近占据某个位置的氨基酸添加1-3个氨基酸。突变体：术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。野生型酶：术语“野生型”α-淀粉酶意指由天然存在的微生物(如在自然界中发现的细菌、酵母或丝状真菌)表达的α-淀粉酶。亲本或亲本α-淀粉酶：术语“亲本”或“亲本α-淀粉酶”意指对其进行改变以产生本发明酶变体的α-淀粉酶。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体。分离的变体：术语“分离的变体”意指通过人工修饰的变体。在一个方面，该变体是至少1％纯的，例如至少5％纯的，至少10％纯的，至少20％纯的，至少40％纯的，至少60％纯的，至少80％纯的并且至少90％纯的，如通过sds-page所测定。基本上纯的变体：术语“基本上纯的变体”意指按重量计含有最多10％、最多8％、最多6％、最多5％、最多4％、最多3％、最多2％、最多1％和最多0.5％与该多肽天然或重组结合的其他多肽物质的制剂。优选地，按在该制剂中存在的总多肽物质的重量计，该变体是至少92％纯的，例如至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％、至少99.5％纯的、和100％纯的。本发明的变体优选地处于基本上纯的形式。这可以例如通过熟知的重组方法或通过经典纯化方法制备该变体来实现。成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如n端加工、c端截短、糖基化、磷酸化等之后处于其最终形式的多肽。成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有α-淀粉酶活性的成熟多肽的多核苷酸。序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联性由参数“序列一致性”描述。出于本发明的目的，使用needleman-wunsch算法(尼德尔曼(needleman)和文施(wunsch),1970,分子生物学杂志(j.mol.biol.)48:443-453)确定两个氨基酸序列之间的序列一致性的程度，如在emboss软件包(emboss:theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite(emboss:欧洲分子生物学开放软件包)，rice等人，2000,trendsgenet.16:276-277)的needle程序，优选地3.0.0版或更后的版本中所执行的。所用的任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，和eblosum62(blosum62的emboss版)替代矩阵。将needle标记的“最长一致性”(使用–nobrief选项获得)的输出用作一致性百分比并且计算如下：(相同残基x100)/(比对的长度-在比对中的空位总数)出于本发明的目的，使用needleman-wunsch算法(尼德尔曼(needleman)和文施(wunsch)，1970，上文)确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间序列一致性的程度，如emboss软件包(emboss:theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite(emboss:欧洲分子生物学开放软件包)，rice等人，2000，上文)的needle程序，优选地3.0.0版或更后的版本中所执行。所用的任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，和ednafull(ncbinuc4.4的emboss版)替代矩阵。将needle标记的“最长一致性”(使用–nobrief选项获得)的输出用作一致性百分比并且计算如下：(相同脱氧核糖核苷酸x100)/(比对的长度-在比对中的空位总数)片段术语“片段”意指使得一个或多个(几个)氨基酸从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失的多肽；其中所述片段具有α-淀粉酶活性。子序列：术语“子序列”意指使得一个或多个(几个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5'和/或3'末端缺失的多核苷酸；其中所述子序列编码具有α-淀粉酶活性的片段。等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据相同染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式的任一种。等位基因变异通过突变而自然发生，并且可以导致群体内部的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽方面无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸”意指通过人工修饰的多核苷酸。在一个方面，分离的多核苷酸是至少1％纯的，例如至少5％纯的，至少10％纯的，至少20％纯的，至少40％纯的，至少60％纯的，至少80％纯的，至少90％纯的并且至少95％纯的，如通过琼脂糖电泳所测定的。多核苷酸可以是基因组、cdna、rna、半合成、合成来源的或它们的任何组合。基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”意指不含其他外部或不想要的核苷酸并且处在适用于基因修饰多肽生产系统内部的形式下的多核苷酸制剂。因而，基本上纯的多核苷酸含有按重量计最多10％、最多8％、最多6％、最多5％、最多4％、最多3％、最多2％、最多1％和最多0.5％与该多核苷酸天然或重组结合的其他多核苷酸物质。然而，基本上纯的多核苷酸可以包含天然存在的5'和3'非翻译区，如启动子和终止子。优选的是，基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90％纯的，例如至少92％纯的，至少94％纯的，至少95％纯的，至少96％纯的，至少97％纯的，至少98％纯的，至少99％纯的，以及至少99.5％纯的。本发明的多核苷酸优选地处于基本上纯的形式。编码序列：术语“编码序列”意指直接指定其多肽产物的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的界限通常由开放阅读框决定，所述开放阅读框通常以atg起始密码子或替代的起始密码子如gtg和ttg开始并且以终止密码子如taa、tag和tga结束。编码序列可以是dna、cdna、合成或重组多核苷酸。cdna：术语“cdna”意指可以通过逆转录从获自真核细胞的成熟剪接的mrna分子制备的dna分子。cdna缺乏可以存在于相应基因组dna中的内含子序列。初始的初级rna转录物是mrna的前体，所述前体在作为成熟剪接的mrna出现之前经一系列步骤(包括剪接)加工。核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子从天然存在的基因分离或经修饰以含有处于本来在自然界中不存在的形式的或为合成的核酸区段。当核酸构建体含有表达本发明编码序列所需的控制序列时，术语“核酸构建体”与术语“表达盒”同义。控制序列术语“控制序列”意指为编码本发明变体的多核苷酸表达所必需的所有组分。每个控制序列可以相对于编码变体的多核苷酸是天然或外来的或彼此是天然或外来的。这类控制序列包括但不限于前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、和转录终止子。至少，控制序列包括启动子和转录及翻译终止信号。控制序列可以配有接头，目的在于引入促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区连接的特异性限制性位点。可操作地连接：术语“可操作地连接”意指其中将控制序列相对于多核苷酸的编码序列置于适宜位置处使得控制序列指导编码序列表达的构型。表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状dna分子，所述dna分子包含编码变体的多核苷酸并且与导致其表表达的另外的核苷酸可操作地连接。宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖因复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。淀粉去除过程：表述“淀粉去除过程”涉及任何种类的借以去除(或转化)淀粉的过程，如在其中从纺织品去除淀粉的洗涤过程中，例如纺织品清洁如洗衣。淀粉去除过程也可能是硬质表面清洁，如餐具洗涤或它可能是一般清洁过程，如工业清洁或机构清洁。该表述通常还包括其他淀粉去除过程或淀粉转化、乙醇生产、淀粉液化、纺织品退浆、纸和纸浆生产、啤酒制造和洗涤剂。改善的特性：术语“改善的特性”意指与变体相关的与亲本相比得到改善的特征。这类改善的特性包括但不限于热活性、热稳定性、ph活性、ph稳定性、底物/辅因子特异性、改善的表面特性、产物特异性、在预处理的生物质存在下增加的稳定性或溶解度、在储存条件下改善的稳定性、以及化学稳定性。洗涤性能：在本发明情况下，使用术语“洗涤性能”作为酶在例如衣物或硬质表面清洁如餐具洗涤期间去除存在于待清洁的物体上的淀粉或含淀粉污渍的能力。可以通过计算在amsa说明中和在下文方法部分中的烧杯洗涤性能测试中定义的所谓的强度值(int)将洗涤性能定量。改善的洗涤性能：术语“改善的洗涤性能”在此定义为相对于亲本淀粉酶的洗涤性能或相对于具有所述变体的相同氨基酸序列但是在一个或多个指定位置不具有缺失的α-淀粉酶或相对于具有在seqidno:4中所示的氨基酸序列的α-淀粉酶的活性，变体酶显示出淀粉酶变体的洗涤性能的改变，例如增加的污渍去除。术语“洗涤性能”包括通常清洁例如硬质表面清洁，如在餐具洗涤中，还包括在纺织品如衣物上的洗涤性能，并且还包括工业清洁和机构清洁。低温：“低温”是5℃-35℃、优选5℃-30℃、更优选5℃-25℃、更优选5℃-20℃、最优选5℃-15℃并且特别地5℃-10℃的温度。在一个优选实施例中，“低温”是10℃-35℃、优选10℃-30℃、更优选10℃-25℃、最优选10℃-20℃，并且特别地10℃-15℃的温度。变体命名的规则出于本发明的目的，在seqidno:1中披露的成熟多肽用来确定另一种α-淀粉酶中的相应氨基酸残基。将另一种α-淀粉酶的氨基酸序列与seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6中披露的成熟多肽比对，并且基于比对结果，使用needleman-wunsch算法(尼德尔曼(needleman)和文施(wunsch),1970,分子生物学杂志(j.mol.biol.)48:443-453)如在emboss软件包(emboss:theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite(emboss:欧洲分子生物学开放软件包)，rice等人，2000,遗传学趋势(trendsgenet.)16:276-277)的needle程序，优选地3.0.0版或更后的版本中所执行的，确定与seqidno:1中披露的成熟多肽中的任何氨基酸残基相应的氨基酸位置编号。可以通过使用“clustalw”(拉金(larkin)等人，2007,生物信息学(bioinformatics)23:2947-2948)比对多个多肽序列证实另一种α-淀粉酶中的相应氨基酸残基的鉴定。当另一种酶已经偏离seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5或seqidno:6的成熟多肽，使得基于序列的传统比较法未能检测它们的关系时(林达尔(lindahl)和埃洛弗松(elofsson)，2000,分子生物学杂志(j.mol.biol.)295:613-615)，可以使用其他配对序列比较算法。使用利用多肽家族的概率表示(谱)检索数据库的检索程序，可以在基于序列的检索中实现更高的敏感度。例如，psi-blast程序通过迭代数据库检索过程产生谱并且能够检测远同源物(阿尔丘尔(atschul等人)，1997,核酸研究(nucleicacidsres.)25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族具有在蛋白结构数据库中的一个或多个代表，可以实现甚至更高的敏感度。程序如genthreader(琼斯(jones)，1999,分子生物学杂志287:797-815；麦格芬(mcguffin)和琼斯，2003,生物信息学19:874-881)利用来自多种来源的信息(psi-blast、二级结构预测、结构比对谱和溶剂化潜力)作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，高夫(gough)等人，2000,分子生物学杂志313:903-919的方法可以用来将结构未知的序列与存在于scop数据库中的超家族模型比对。这些比对结果可以进而用来产生多肽的同源性模型，并且可以使用为这种目的所开发的多种工具评定这样的模型的准确度。对于已知结构的蛋白质，几项工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，已经将蛋白质的scop超家族进行结构比对，并且这些比对是可获取和可下载的。可以使用多种算法，如距离比对矩阵(霍姆(holm)和桑德(sander)，蛋白质(proteins)33:88-96)或组合延伸(shindyalov和bourne,1998,蛋白质工程(proteinengineering)11:739-747)来比对两种或更多种蛋白结构，并且这些算法的实施可以另外地用来查询具有感兴趣的结构的结构数据库以便发现可能的结构同源物(例如，霍姆和帕克(park)，2000,生物信息学16:566-567)。在描述本发明的α-淀粉酶变体时，为了便于参考，采用下文描述的命名法。使用公认的iupac单字母或三字母氨基酸缩写。置换对于氨基酸置换，使用以下命名法：原有氨基酸、位置、置换入的氨基酸。因此，将在位置226处的苏氨酸置换为丙氨酸的置换命名为“thr226ala”或“t226a”。多个突变由加号(“+”)分隔，例如，“gly205arg+ser411phe”或“g205r+s411f”代表在位置205和411分别将甘氨酸(g)置换为精氨酸(r)，并且将丝氨酸(s)置换为苯丙氨酸(f)。缺失对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原有氨基酸，位置*。因此，缺失在位置195处的甘氨酸命名为“gly195*”或“g195*”。多个缺失由加号(“+”)分隔，例如，“gly195*+ser411*”或“g195*+s411*”。插入对于氨基酸插入，使用以下命名法：原有氨基酸、位置、原有氨基酸、插入的氨基酸。因此，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸命名为“gly195glylys”或“g195gk”。多个氨基酸的插入命名为[原有氨基酸、位置、原有氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2；等等]。例如，在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸命名为“gly195glylysala”或“g195gka”。在这样的情况下，根据添加小写字母至所插入氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号，将插入的氨基酸残基编号。在以上实例中，序列因此将是：亲本：变体：195195195a195bgg-k-a包含多个改变的变体由(“+”)加号分隔，例如，“arg170tyr+gly195glu”或“r170y+g195e”代表用酪氨酸和谷氨酸分别置换在位置170和195处的精氨酸和甘氨酸。不同的置换在可以在一个位置引入不同置换的情况下，不同的置换由逗号分隔，例如，“arg170tyr，glu”代表在位置170用酪氨酸或谷氨酸置换精氨酸。因此，“tyr167gly，ala+arg170gly，ala”指示以下变体：“tyr167gly+arg170gly”、“tyr167gly+arg170ala”、“tyr167ala+arg170gly”、和“tyr167ala+arg170ala”。亲本α-淀粉酶亲本α-淀粉酶可以是与seqidno:1的成熟多肽具有至少80％序列一致性的多肽。在一个方面，亲本与seqidno:1的成熟多肽具有至少80％、例如至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，所述成熟多肽具有α-淀粉酶活性。在一个方面，该亲本的氨基酸序列与seqidno:1的成熟多肽相差不多于十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差二个氨基酸、以及相差一个氨基酸。亲本优选地包含seqidno:1的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，亲本包含seqidno:1的成熟多肽或由其组成。在另一个实施例中，亲本是seqidno:1的成熟多肽的等位基因变体。亲本α-淀粉酶也可以是与seqidno:2的成熟多肽具有至少80％序列一致性的多肽。在另一个方面，亲本与seqidno:2的成熟多肽具有至少80％、例如至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，所述成熟多肽具有α-淀粉酶活性。在一个方面，该亲本的氨基酸序列与seqidno:2的成熟多肽相差不多于十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差二个氨基酸、以及相差一个氨基酸。亲本优选地包含seqidno:2的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，亲本包含seqidno:2的成熟多肽或由其组成。在另一个实施例中，亲本是seqidno:2的成熟多肽的等位基因变体。亲本α-淀粉酶也可以是与seqidno:3的成熟多肽具有至少80％序列一致性的多肽。在另一个方面，亲本与seqidno:3的成熟多肽具有至少80％、例如至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，所述成熟多肽具有α-淀粉酶活性。在一个方面，该亲本的氨基酸序列与seqidno:3的成熟多肽相差不多于十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差二个氨基酸、以及相差一个氨基酸。亲本优选地包含seqidno:3的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，亲本包含seqidno:3的成熟多肽或由其组成。在另一个实施例中，亲本是seqidno:3的成熟多肽的等位基因变体。亲本α-淀粉酶也可以是与seqidno:4的成熟多肽具有至少80％序列一致性的多肽。在另一个方面，亲本与seqidno:4的成熟多肽具有至少80％、例如至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，所述成熟多肽具有α-淀粉酶活性。在一个方面，该亲本的氨基酸序列与seqidno:4的成熟多肽相差不多于十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差二个氨基酸、以及相差一个氨基酸。亲本优选地包含seqidno:4的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，亲本包含seqidno:4的成熟多肽或由其组成。在另一个实施例中，亲本是seqidno:4的成熟多肽的等位基因变体。亲本α-淀粉酶也可以是与seqidno:5的成熟多肽具有至少80％序列一致性的多肽。在另一个方面，亲本与seqidno:5的成熟多肽具有至少80％、例如至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，所述成熟多肽具有α-淀粉酶活性。在一个方面，该亲本的氨基酸序列与seqidno:5的成熟多肽相差不多于十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差二个氨基酸、以及相差一个氨基酸。亲本优选地包含seqidno:5的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，亲本包含seqidno:5的成熟多肽或由其组成。在另一个实施例中，亲本是seqidno:5的成熟多肽的等位基因变体。亲本α-淀粉酶也可以是与seqidno:6的成熟多肽具有至少80％序列一致性的多肽。在另一个方面，亲本与seqidno:6的成熟多肽具有至少80％、例如至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，所述成熟多肽具有α-淀粉酶活性。在一个方面，该亲本的氨基酸序列与seqidno:6的成熟多肽相差不多于十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差二个氨基酸、以及相差一个氨基酸。亲本优选地包含seqidno:6的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，亲本包含seqidno:6的成熟多肽或由其组成。在另一个实施例中，亲本是seqidno:6的成熟多肽的等位基因变体。亲本α-淀粉酶也可以是与seqidno:7的成熟多肽具有至少80％序列一致性的多肽。在另一个方面，亲本与seqidno:7的成熟多肽具有至少80％、例如至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，所述成熟多肽具有α-淀粉酶活性。在一个方面，该亲本的氨基酸序列与seqidno:7的成熟多肽相差不多于十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差二个氨基酸、以及相差一个氨基酸。亲本优选地包含seqidno:7的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，亲本包含seqidno:7的成熟多肽或由其组成。在另一个实施例中，亲本是seqidno:7的成熟多肽的等位基因变体。亲本α-淀粉酶也可以是与seqidno:8的成熟多肽具有至少80％序列一致性的多肽。在另一个方面，亲本与seqidno:8的成熟多肽具有至少80％、例如至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，所述成熟多肽具有α-淀粉酶活性。在一个方面，该亲本的氨基酸序列与seqidno:8的成熟多肽相差不多于十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差二个氨基酸、以及相差一个氨基酸。亲本优选地包含seqidno:8的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，亲本包含seqidno:8的成熟多肽或由其组成。在另一个实施例中，亲本是seqidno:8的成熟多肽的等位基因变体。亲本α-淀粉酶也可以是与seqidno:9的成熟多肽具有至少80％序列一致性的多肽。在另一个方面，亲本与seqidno:9的成熟多肽具有至少80％、例如至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，所述成熟多肽具有α-淀粉酶活性。在一个方面，该亲本的氨基酸序列与seqidno:9的成熟多肽相差不多于十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差二个氨基酸、以及相差一个氨基酸。亲本优选地包含seqidno:9的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，亲本包含seqidno:9的成熟多肽或由其组成。在另一个实施例中，亲本是seqidno:9的成熟多肽的等位基因变体。亲本α-淀粉酶也可以是与seqidno:10的成熟多肽具有至少80％序列一致性的多肽。在另一个方面，亲本与seqidno:10的成熟多肽具有至少80％、例如至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，所述成熟多肽具有α-淀粉酶活性。在一个方面，该亲本的氨基酸序列与seqidno:10的成熟多肽相差不多于十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差二个氨基酸、以及相差一个氨基酸。亲本优选地包含seqidno:10的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，亲本包含seqidno:10的成熟多肽或由其组成。在另一个实施例中，亲本是seqidno:10的成熟多肽的等位基因变体。亲本α-淀粉酶也可以是与seqidno:11的成熟多肽具有至少80％序列一致性的多肽。在另一个方面，亲本与seqidno:11的成熟多肽具有至少80％、例如至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，所述成熟多肽具有α-淀粉酶活性。在一个方面，该亲本的氨基酸序列与seqidno:11的成熟多肽相差不多于十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差二个氨基酸、以及相差一个氨基酸。亲本优选地包含seqidno:11的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，亲本包含seqidno:11的成熟多肽或由其组成。在另一个实施例中，亲本是seqidno:11的成熟多肽的等位基因变体。亲本α-淀粉酶也可以是与seqidno:12的成熟多肽具有至少80％序列一致性的多肽。在另一个方面，亲本与seqidno:12的成熟多肽具有至少80％、例如至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性，所述成熟多肽具有α-淀粉酶活性。在一个方面，该亲本的氨基酸序列与seqidno:12的成熟多肽相差不多于十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差二个氨基酸、以及相差一个氨基酸。亲本优选地包含seqidno:12的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，亲本包含seqidno:12的成熟多肽或由其组成。在另一个实施例中，亲本是seqidno:12的成熟多肽的等位基因变体。seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12或其片段的氨基酸序列可以用来设计核酸探针以根据本领域熟知的方法鉴定和克隆编码来自不同属或物种的菌株的亲本的dna。具体而言，这样的探针可以用于按照标准dna印迹程序，与感兴趣的属或物种的基因组或cdna杂交，以便鉴定和分离在其中的相应基因。这样的探针可以是大大短于整个序列，但是应当具有至少14个、例如至少25个、至少35个、或至少70个核苷酸长度。优选地，核酸探针具有至少100个核苷酸长度，例如至少200个核苷酸长度、至少300个核苷酸长度、至少400个核苷酸长度、至少500个核苷酸长度、至少600个核苷酸长度、至少700个核苷酸长度、至少800个核苷酸长度或至少900个核苷酸长度。可以使用dna探针和rna探针两者。典型地这些探针被标记用于检测相应的基因(例如用32p、3h、35s、生物素、或亲合素)。这类探针由本发明涵盖。可以筛选从这类其他生物制备的基因组dna或cdna文库的与上述探针杂交并编码亲本的dna。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、或其他分离技术分离来自这类其他生物的基因组dna或其他dna。可以将来自这些文库的dna或分离dna转移至并且固定在用于在dna印迹中的硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。出于本发明的目的，杂交表示多核苷酸在低至极高严格性条件下与标记的核苷酸探针杂交，所述核苷酸探针与编码seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12的多核苷酸或其子序列相应。可以使用例如x射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段检测与该探针杂交的分子。在一个方面，核酸探针是编码seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12的多肽的多核苷酸或其片段。对于至少100个核苷酸长度的长探针，极低至极高严格性条件定义为最佳地按照标准dna印迹程序，在42℃在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切和变性的鲑精dna中，以及对于极低和低严格性在25％甲酰胺中，对于中等和中等-高严格性在35％甲酰胺中，或对于高和极高严格性在50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后使用2xssc、0.2％sds在45℃(极低严格性)、在50℃(低严格性)、在55℃(中等严格性)、在60℃(中等-高严格性)、在65℃(高严格性)、或在70℃(极高严格性)将载体材料洗涤三次，各自持续15分钟。对于大约15个核苷酸至大约70个核苷酸长度的短探针，严格性条件被定义为最佳地按照标准dna印迹程序，在使用根据bolton和mccarthy(1962，美国科学院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)48:1390)的计算法所计算的tm以下大约5℃至大约10℃，在每毫升0.9mnacl、0.09mtris-hclph7.6、6mmedta、0.5％np-40、1xdenhardt's溶液、1mm焦磷酸钠、1mm磷酸二氢钠、0.1mmatp和0.2mg酵母rna中预杂交和杂交12至24小时。最后将载体材料在计算的tm以下约5℃至约10℃，在6xscc加0.1％sds中洗涤1次持续15分钟并且使用6xssc洗涤二次，每次15分钟。可以从任何属的微生物获得亲本。出于本发明的目的，如在此与给出的来源结合使用，术语“从……获得”应当意指由多核苷酸编码的变体是由该来源或由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的细胞产生的。在一个方面，亲本分泌至细胞外。亲本可以是细菌α-淀粉酶。例如，亲本可以是革兰氏阳性细菌多肽，如芽孢杆菌属(bacillus)α-淀粉酶、梭菌属(clostridium)α-淀粉酶、肠球菌属(enterococcus)α-淀粉酶、土芽孢杆菌属(geobacillus)α-淀粉酶、乳杆菌属(lactobacillus)α-淀粉酶、乳球菌属(lactococcus)α-淀粉酶、海洋芽孢杆菌(oceanobacillus)α-淀粉酶、葡萄球菌属(staphylococcus)α-淀粉酶、链球菌属(streptococcus)α-淀粉酶或链霉菌属(streptomyces)α-淀粉酶，或革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属(campylobacter)α-淀粉酶、大肠杆菌α-淀粉酶、黄杆菌属(flavobacterium)α-淀粉酶、梭杆菌属(fusobacterium)α-淀粉酶、螺杆菌属(helicobacter)α-淀粉酶、泥杆菌属(ilyobacter)α-淀粉酶、奈瑟球菌属(neisseria)α-淀粉酶、假单胞菌属(pseudomonas)α-淀粉酶、沙门菌属(salmonella)或脲原体属(ureaplasma)α-淀粉酶。在一个方面，亲本是嗜碱芽孢杆菌(bacillusalkalophilus)α-淀粉酶、解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)α-淀粉酶、短芽孢杆菌(bacillusbrevis)α-淀粉酶、环状芽孢杆菌(bacilluscirculans)α-淀粉酶、克劳氏芽孢杆菌(bacillusclausii)α-淀粉酶、凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)α-淀粉酶、坚强芽孢杆菌(bacillusfirmus)α-淀粉酶、灿烂芽孢杆菌(bacilluslautus)α-淀粉酶、迟缓芽孢杆菌(bacilluslentus)α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)α-淀粉酶、巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)α-淀粉酶、短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌(bacillusstearothermophilus)α-淀粉酶、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)α-淀粉酶或苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)α-淀粉酶。在另一个方面，亲本是马链球菌(streptococcusequi)α-淀粉酶、化脓性链球菌(streptococcuspyogenes)α-淀粉酶、乳房链球菌(streptococcusuberis)或马链球菌兽疫亚种(streptococcusequisubsp.zooepidemicus)α-淀粉酶。在另一个方面，亲本是不产色链霉菌(streptomycesachromogenes)α-淀粉酶、阿维链霉菌(streptomycesavermitilis)α-淀粉酶、天蓝色链霉菌(streptomycescoelicolor)α-淀粉酶、灰色链霉菌(streptomycesgriseus)α-淀粉酶或浅青紫链霉菌(streptomyceslividans)α-淀粉酶。亲本可以是真菌α-淀粉酶。例如，亲本可以是酵母α-淀粉酶，如假丝酵母属(candida)α-淀粉酶、克鲁维酵母属(kluyveromyces)α-淀粉酶、毕赤酵母属(pichia)α-淀粉酶、酵母属(saccharomyces)α-淀粉酶、裂殖酵母(schizosaccharomyces)α-淀粉酶或子囊菌酵母属(yarrowia)α-淀粉酶。例如，亲本可以是丝状真菌α-淀粉酶如枝顶孢霉属(acremonium)α-淀粉酶、伞菌属(agaricus)α-淀粉酶、链格孢属(alternaria)α-淀粉酶、曲霉属(aspergillus)α-淀粉酶、金担子菌属(aureobasidium)α-淀粉酶、葡萄座腔菌属(botryospaeria)α-淀粉酶、拟蜡菌属(ceriporiopsis)α-淀粉酶、毛喙壳属(chaetomidium)α-淀粉酶、金孢属(chrysosporium)α-淀粉酶、麦角菌属(claviceps)α-淀粉酶、旋孢腔菌属(cochliobolus)α-淀粉酶、鬼伞属(coprinopsis)α-淀粉酶、乳白蚁属(coptotermes)α-淀粉酶、棒囊壳属(corynascus)α-淀粉酶、隐丛赤壳属(cryphonectria)α-淀粉酶、隐球酵母属(cryptococcus)α-淀粉酶、壳色单隔孢属(diplodia)α-淀粉酶、黑耳属(exidia)α-淀粉酶、绒黑粉类酵母(filibasidium)α-淀粉酶、镰刀菌属(fusarium)α-淀粉酶、赤霉属(gibberella)α-淀粉酶、全鞭毛虫属(holomastigotoides)α-淀粉酶、腐质霉属(humicola)α-淀粉酶、耙齿菌属(irpex)α-淀粉酶、香菇属(lentinula)α-淀粉酶、小球腔菌属(leptospaeria)α-淀粉酶、巨座壳属(magnaporthe)α-淀粉酶、melanocarpusα-淀粉酶、亚灰树花菌属(meripilus)α-淀粉酶、毛霉属(mucor)α-淀粉酶、毁丝霉属(myceliophthora)α-淀粉酶、新美鞭菌属(neocallimastix)α-淀粉酶、脉孢菌属(neurospora)α-淀粉酶、拟青霉属(paecilomyces)α-淀粉酶、青霉属(penicillium)α-淀粉酶、平革菌属(phanerochaete)α-淀粉酶、梨囊鞭菌属(piromyces)α-淀粉酶、poitrasiaα-淀粉酶、假黑盘菌属(pseudoplectania)α-淀粉酶、假披发虫属(pseudotrichonympha)α-淀粉酶、根毛霉属(rhizomucor)α-淀粉酶、裂褶菌属(schizophyllum)α-淀粉酶、柱霉属(scytalidium)α-淀粉酶、蓝状菌属(talaromyces)α-淀粉酶、嗜热子囊菌(thermoascus)α-淀粉酶、梭孢壳属(thielavia)α-淀粉酶、弯颈霉属(tolypocladium)α-淀粉酶、木霉属(trichoderma)α-淀粉酶、毛盘菌属(trichophaea)α-淀粉酶、轮枝孢属(verticillium)α-淀粉酶、小包脚菇属(volvariella)α-淀粉酶或炭角菌属(xylaria)α-淀粉酶。在另一个方面，亲本是卡氏酵母(saccharomycescarlsbergensis)α-淀粉酶、酿酒酵母α-淀粉酶、糖化酵母(saccharomycesdiastaticus)α-淀粉酶、道格拉斯酵母(saccharomycesdouglasii)α-淀粉酶、克鲁弗酵母(saccharomyceskluyveri)α-淀粉酶、诺地酵母(saccharomycesnorbensis)α-淀粉酶或卵形酵母(saccharomycesoviformis)α-淀粉酶。在另一个方面，亲本是解纤维枝顶孢霉(acremoniumcellulolyticus)α-淀粉酶、棘孢曲霉(aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉α-淀粉酶、臭曲霉(aspergillusfoetidus)α-淀粉酶、烟曲霉α-淀粉酶、日本曲霉(aspergillusjaponicus)α-淀粉酶、构巢曲霉α-淀粉酶、黑曲霉α-淀粉酶、米曲霉α-淀粉酶、chrysosporiuminopsα-淀粉酶、嗜角质金孢子菌(chrysosporiumkeratinophilum)α-淀粉酶、勒克瑙金孢(chrysosporiumlucknowense)α-淀粉酶、粪状金孢(chrysosporiummerdarium)α-淀粉酶、租金孢子菌(chrysosporiumpannicola)α-淀粉酶、昆士兰金孢子菌(chrysosporiumqueenslandicum)α-淀粉酶、热带金孢子菌(chrysosporiumtropicum)α-淀粉酶、chrysosporiumzonatumα-淀粉酶、杆孢状镰刀菌(fusariumbactridioides)α-淀粉酶、禾谷镰刀菌(fusariumcerealis)α-淀粉酶、克地镰刀菌(fusariumcrookwellense)α-淀粉酶、黄色镰刀菌(fusariumculmorum)α-淀粉酶、禾谷镰刀菌(fusariumgraminearum)α-淀粉酶、禾赤镰刀菌(fusariumgraminum)α-淀粉酶、异孢镰刀菌(fusariumheterosporum)α-淀粉酶、合欢木镰刀菌(fusariumnegundi)α-淀粉酶、尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)、网状镰刀菌(fusariumreticulatum)α-淀粉酶、粉红镰刀菌(fusariumroseum)α-淀粉酶、接骨木镰刀菌(fusariumsambucinum)α-淀粉酶、肤色镰刀菌(fusariumsarcochroum)α-淀粉酶、拟枝孢镰刀菌(fusariumsporotrichioides)α-淀粉酶、硫色镰刀菌(fusariumsulphureum)α-淀粉酶、簇囊镰刀菌(fusariumtorulosum)α-淀粉酶、拟丝孢镰刀菌(fusariumtrichothecioides)α-淀粉酶、fusariumvenenatumα-淀粉酶、灰腐质霉(humicolagrisea)α-淀粉酶、特异腐质霉(humicolainsolens)α-淀粉酶、柔毛腐质霉(humicolalanuginosa)α-淀粉酶、白囊耙齿菌(irpexlacteus)α-淀粉酶、米黑毛霉(mucormiehei)α-淀粉酶、嗜热毁丝霉(myceliophthorathermophila)α-淀粉酶、粗糙脉孢菌(neurosporacrassa)α-淀粉酶、绳状青霉(penicilliumfuniculosum)α-淀粉酶、产紫青霉(penicilliumpurpurogenum)α-淀粉酶、黄孢原毛平革菌(phanerochaetechrysosporium)α-淀粉酶、无色梭孢壳(thielaviaachromatica)α-淀粉酶、thielaviaalbomycesα-淀粉酶、thielaviaalbopilosaα-淀粉酶、澳洲梭孢壳(thielaviaaustraleinsis)α-淀粉酶、thielaviafimetiα-淀粉酶、小孢梭孢壳(thielaviamicrospora)α-淀粉酶、卵孢梭孢壳(thielaviaovispora)α-淀粉酶、thielaviaperuvianaα-淀粉酶、毛梭孢壳(thielaviasetosa)α-淀粉酶、瘤孢梭孢壳(thielaviaspededonium)α-淀粉酶、耐热梭孢壳(thielaviasubthermophila)α-淀粉酶、土生梭孢壳(thielaviaterrestris)α-淀粉酶、哈茨木霉(trichodermaharzianum)α-淀粉酶、康氏木霉(trichodermakoningii)α-淀粉酶、长枝木霉(trichodermalongibrachiatum)α-淀粉酶、里氏木霉(trichodermareesei)α-淀粉酶或绿色木霉(trichodermaviride)α-淀粉酶。在另一个方面，亲本是芽孢杆菌α-淀粉酶，例如，seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5或seqidno:6的α-淀粉酶。应当理解的是，对于前述物种，本发明包括完全和不完全状态，及其他分类学等同物，例如无性型，无论通过它们知道的物种名称是什么。本领域技术人员将容易地识别适当等同物的身份。这些物种的菌株在许多培养物保藏中心中对于公众是容易接近的，如美国典型培养物保藏中心(atcc)、德国微生物菌种保藏中心(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh，dsm)、荷兰菌种保藏中心(centraalbureauvoorschimmelcultures，cbs)和北部地区研究中心农业研究局专利培养物保藏中心(agriculturalresearchservicepatentculturecollection,northernregionalresearchcenter，nrrl)。可以使用上述探针，鉴定亲本并从其他来源包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水，等等)分离的微生物获得该亲本，或从天然材料(例如，土壤、堆肥、水，等等)直接获得dna样品。直接从天然栖息地分离微生物和dna的技术是本领域熟知的。随后可以通过类似地筛选另一种微生物的基因组或cdna文库或混合dna样品衍生编码亲本的多核苷酸。一旦已经用探针检测到编码亲本的多核苷酸，则可以通过利用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆多核苷酸(参见，例如桑布鲁克(sambrook)等人，1989，上文)。亲本可以是杂合多肽，其中一种多肽的一部分在另一种多肽的一部分的n末端或c末端处融合。该亲本还可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中一种多肽在另一种多肽的n末端或c末端处融合。通过将编码一种多肽的多核苷酸与编码另一种多肽的多核苷酸融合而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列，使得它们在框内，并且融合多肽的表达处于相同的启动子和终止子的控制之下。也可以使用内含肽技术构建融合蛋白，其中以翻译后方式产生融合物(库珀(cooper)等人，欧洲分子生物学学会杂志(emboj.)12:2575-2583；道森(dawson)等人，1994,科学(science)266:776-779)。融合多肽可以进一步包含在两种多肽之间的切割位点。在分泌融合蛋白之后，切割该位点，释放出两种多肽。切割位点的实例包括但不限于马丁(martin)等人，2003,j.ind.microbiol.biotechnol.3:568-576；斯韦蒂纳(svetina)等人，2000,生物技术杂志(j.biotechnol.)76:245-251；拉斯穆森-威尔逊(rasmussen-wilson)等人，1997,应用与环境微生物技术(appl.environ.microbiol.)63:3488-3493；沃德(ward)等人，1995,生物技术(biotechnology)13:498-503；和康特拉斯(contreras)等人，1991,生物技术(biotechnology)9:378-381；伊顿(eaton)等人，1986,生物化学(biochemistry)25:505-512；collins-racie等人，1995,生物技术(biotechnology)13:982-987；卡特(carter)等人，1989,蛋白质：结构、功能、和遗传学(proteins:structure,function,andgenetics)6:240-248；以及史蒂文斯(stevens)，2003,药物发现世界(drugdiscoveryworld)4:35-48中披露的位点。变体的制备本发明还涉及用于获得具有α-淀粉酶活性的变体的方法，所述方法包括：(a)将改变在两个或更多个(几个)位置引入亲本α-淀粉酶中，所述位置与seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11或seqidno:12的成熟多肽的位置140、181、189、134、195、206、243、260、262、284、304、347、439、469、476和477相应，其中根据seqidno:1进行编号并且变体具有α-淀粉酶活性；并且(b)回收变体。在一个方面，本发明涉及一种用于获得具有α-淀粉酶活性的变体的方法，所述方法包括：(a)将改变在两个或更多个(几个)位置引入亲本α-淀粉酶中，所述位置与seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11或seqidno:12的成熟多肽的w140、r181、w189、d134、n195、v206、y243、e260、f262、w284、g304、w347、w439、w469、g476和g477相应，其中根据seqidno:1进行编号并且变体具有α-淀粉酶活性；并且(b)回收变体。在一个实施例中，引入的改变是置换。在又一个实施例中，本发明涉及一种用于获得具有α-淀粉酶活性的变体的方法，所述方法包括：(a)将置换在两个或更多个(几个)位置引入亲本α-淀粉酶中，所述位置与seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11或seqidno:12的成熟多肽的g304rkeq、w140yf、w189egt、d134e、e260adcqlmfpswvghiknrty、f262gp、w284dhfyr、w347hfy、w439rg、g476eqrk、g477eqkmr相应，其中根据seqidno:1进行编号并且变体具有α-淀粉酶活性；并且(b)回收变体。在一个优选的实施例中，引入的置换是g304r、w140yf、w189egt、d134e、e260ghiknrty、w284dfr、w439rg、g476ek、g477ekmr的两种或更多种。在一个更优选的实施例中，引入的置换是g304r、w140yf、e260ghiknprty和g476eqrk。在一个甚至更优选的实施例中，用于获得具有α-淀粉酶活性的变体的方法包括：(a)在seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11或seqidno:12的任一者中，将置换g304r、w140y、e260g和g476k引入亲本α-淀粉酶，其中根据seqidno:1进行编号并且变体具有α-淀粉酶活性；并且(b)回收变体。可以使用本领域已知的任何诱变方法，如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等制备变体。定点诱变是其中在编码亲本的多核苷酸中的一个或多个限定的位点处产生一个或多个(几个)突变的一项技术。定点诱变可以通过pcr在体外完成，所述pcr涉及使用含有所希望的突变的寡核苷酸引物。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，所述盒式诱变涉及由限制性酶在包含编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将含有突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化质粒和寡核苷酸的限制性酶是相同的，从而允许质粒和插入物的粘性末端彼此连接。参见，例如谢勒(scherer)和戴维斯(davis)，1979,美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)76:4949-4955；和巴顿(barton)等人，1990,核酸研究(nucleicacidsres.)18:7349-4966。也可以通过本领域已知的方法在体内实现定点诱变。参见，例如美国专利申请公开号2004/0171154；storici等人，2001,自然生物技术(naturebiotechnol.)19:773-776；凯伦(kren)等人，1998,自然医学(nat.med.)4:285-290；以及卡里萨诺(calissano)和曼奇诺(macino)，1996,真菌遗传学通讯(fungalgenet.newslett.)43:15-16。可以在本发明中使用任何定点诱变方法。存在许多可获得的可以用来制备变体的商业试剂盒。合成基因构建使得必需体外合成设计的多核苷酸分子以编码感兴趣的多肽。可以利用许多技术，如由田(tian)等人，(2004，自然(nature)432:1050-1054)描述的基于多重微芯片的技术和其中在光可编程的微流芯片上合成和装配寡核苷酸的相似技术进行基因合成。可以做出单个或多个氨基酸置换、缺失和/或插入并且使用已知的诱变、重组和/或改组方法进行测试，随后进行有关筛选程序，如reidhaar-olson和索尔(sauer),1988，科学，241:53-57；鲍威(bowie)和索尔,1989,美国科学院院刊，86:2152-2156；wo95/17413或wo95/22625所披露的那些。可以使用的其他方法包括易错pcr、噬菌体展示(例如，罗曼(lowman)等人，1991,生物化学(biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；wo92/06204)和区域定向诱变(德比舍尔(derbyshire)等人，1986,基因(gene)46:145；ner等人，1988,dna7:127)。诱变/改组方法可以与高通量自动化筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的诱变多肽的活性(奈斯(ness)等人，1999,自然生物技术17:893-896)。使用本领域的标准方法可以从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的dna分子并且将其快速测序。这些方法允许快速确定多肽中各个氨基酸残基的重要性。通过将合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变和/或改组的多个方面组合而完成半合成基因构建。半合成基因构建由利用与pcr技术组合而合成的多核苷酸片段的的方法代表。基因的限定区域可以因此从头合成，而可以使用位点特异性诱变引物扩增其他区域，同时另外的其他区域可以经受易错pcr或非易错pcr扩增。随后可以进行多核苷酸子序列穿梭。变体本发明还提供了亲本α-淀粉酶的变体，所述变体包含在与seqidno:1的成熟多肽的g304、w140、w189、d134、e260、f262、w284、w347、w439、w469、g476和g477位置相应的两个或更多个(几个)位置处的改变，并且其中每种改变独立地是置换、插入或缺失(优选地是置换)并且所述变体具有α-淀粉酶活性。因而，提供了与亲本α-淀粉酶相比或与seqidno:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12的α-淀粉酶相比具有改善的低温洗涤性能的变体。在一个实施例中，变体与亲本α-淀粉酶的氨基酸序列具有至少80％、例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但是小于100％的序列一致性。在另一个实施例中，本发明涉及α-淀粉酶的分离的变体，所述变体包含在与seqidno:1的成熟多肽的g304、w140、w189、d134、e260、f262、w284、w347、w439、w469、g476和g477位置相应的两个或更多个(几个)位置处的改变，其中每种改变独立地是置换、缺失或插入，并且其中所述变体与与seqidnos1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中任一者的成熟多肽具有至少80％但是小于100％的序列一致性，并且其中所述变体具有α-淀粉酶活性。在另一个实施例中，该变体与seqidno:1的成熟多肽具有至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％和至少99％、但是小于100％的序列一致性。在另一个实施例中，该变体与seqidno:2的成熟多肽具有至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％和至少99％、但是小于100％的序列一致性。在另一个实施例中，该变体与seqidno:3的成熟多肽具有至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％和至少99％、但是小于100％的序列一致性。在另一个实施例中，该变体与seqidno:4的成熟多肽具有至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％和至少99％、但是小于100％的序列一致性。在另一个实施例中，该变体与seqidno:5的成熟多肽具有至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％和至少99％、但是小于100％的序列一致性。在另一个实施例中，该变体与seqidno:6的成熟多肽具有至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％和至少99％、但是小于100％的序列一致性。在另一个实施例中，该变体与seqidno:7的成熟多肽具有至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％和至少99％、但是小于100％的序列一致性。在另一个实施例中，该变体与seqidno:8的成熟多肽具有至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％和至少99％、但是小于100％的序列一致性。在另一个实施例中，该变体与seqidno:9的成熟多肽具有至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％和至少99％、但是小于100％的序列一致性。在另一个实施例中，该变体与seqidno:10的成熟多肽具有至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％和至少99％、但是小于100％的序列一致性。在另一个实施例中，该变体与seqidno:11的成熟多肽具有至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％和至少99％、但是小于100％的序列一致性。在另一个实施例中，该变体与seqidno:12的成熟多肽具有至少85％、至少87％、至少90％、至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％和至少99％、但是小于100％的序列一致性。在一个方面，本发明变体中的改变的数目是2-20，例如，2-10个和2-5个，如2、3、4、5，6、7、8、9或10个改变。在一个方面，变体包含在与位置g304、w140、w189、d134、e260、f262、w284、w347、w439、w469、g476和g477相应的两个或更多个(几个)位置处的改变。在另一个方面，变体包含在与位置g304、w140、w189、d134、e260、f262、w284、w347、w439、w469、g476和g477的任一者相应的两个位置处的改变。在另一个方面，变体包含在与位置g304、w140、w189、d134、e260、f262、w284、w347、w439、w469、g476和g477的任一者相应的三个位置处的改变。在另一个方面，变体包含在与位置g304、w140、w189、d134、e260、f262、w284、w347、w439、w469、g476和g477的任一者相应的四个位置处的改变。在另一个方面，变体包含在与位置g304、w140、w189、d134、e260、f262、w284、w347、w439、w469、g476和g477的任一者相应的五个位置处的改变。在另一个方面，变体包含在与位置g304、w140、w189、d134、e260、f262、w284、w347、w439、w469、g476和g477的任一者相应的六个位置处的改变。在另一个方面，变体包含在与位置g304、w140、w189、d134、e260、f262、w284、w347、w439、w469、g476和g477相应的每个位置处的改变。这些位置相应于seqidno:1的位置。优选的是这些改变是置换。在一个实施例中，该变体包含在二、三或四个位置处的置换，所述位置选自由g304、w140、w189、d134、e260、f262、w284、w347、w439、w469、g476和g477组成的组。在一个优选实施例中，该变体包含在二、三或四个位置处的置换，所述位置选自由g304、w140、e260和g476组成的组。在本发明的一个方面，该变体包含在二或更多个(几个)置换，所述置换选自由g304rkeq、w140yf、w189egt、d134e、e260adcqlmfpswvghiknrty、f262gp、w284dhfyr、w347hfy、w439rg、g476eqrk、g477eqkmr组成的组。优选的是，本发明的变体包含在二、三或四个位置处的置换，所述置换选自由g304r、w140yf、e260ghiknprty和g476eqrk组成的组。在一个更优选的实施例中，在二、三或四个位置处的置换选自由g304r、w140y、e260g和g476k组成的组。在一个实施例中，该变体进一步包含一个或多个置换，所述置换选自由t51il、s52q、n54k、g109a、e194d、n195f、v206y、y243f、g109a、g273dv、g337n、k72r、r181h、s303g和y100i组成的组。在一个优选实施例中，一个或多个其他置换选自由n195f、v206y、y243f组成的组。优选地，该变体包含这些置换中的两个或三个。因而，提供了与亲本α-淀粉酶相比或与seqidno:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12的α-淀粉酶相比具有改善的低温洗涤性能以及改善的针对ca2+耗尽的稳定性的变体。在本发明的另一个方面，该变体包含seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11或seqidno:12的的成熟多肽的两个或更多个(几个)置换，所述置换选自由d134e、e260g、e260h、e260i、e260k、e260n、e260r、e260t、g109a、g273d、g273v、g337n、g476e、g477e、g477m、g477r、k72r、r181h、s303g、w140f、w140y、w189e、w189g、w189t、w284d和y100i组成的组。变体还可以包含在一个或多个(几个)其他位置处的改变。例如，变体可以包含在与位置g182*+d183*或d183*+g184*相应的位置处的改变。在另一个方面，本发明涉及变体，所述变体包含与seqidno:1的多肽的位置相应的位置内的置换，所述置换选自由以下组成的组：w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+g477e，w140y+n195f+v206y+y243f+e260t+w284d，w140y+n195f+v206y+y243f+w284d，g109a+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g，w140y+n195f+v206y+y243f+e260g，n195f+v206y+y243f+e260k+w284d，d134e+g476e，w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+g476e，w140y+w189g+n195f+v206y+y243f+e260g，w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+s303g，w140y+w189t+n195f+v206y+y243f+e260g，w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+w284d，y100i+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g，w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+g337n，w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+w439rg109a+w140y+e194d+n195f+v206y+y243f+e260gg109a+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+g476et51i+y100i+g109a+w140y+n195f+v206y+y243f+e260gt51i+g109a+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+w439rt51i+s52q+n54k+g109a+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+g476ew140y+n195f+v206y+y243f+e260g+g304r+g476kw140y+n195f+v206y+y243f+e260g+w284r+g477kw140y+n195f+v206y+y243f+e260g+w284f+g477r，和n195f+v206y+y243f+e260g+w284d。在另一个方面，本发明涉及变体，所述变体由与seqidno:1的多肽的位置相应的位置内的置换组成，所述置换选自由以下组成的组：w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+g477e，w140y+n195f+v206y+y243f+e260t+w284d，w140y+n195f+v206y+y243f+w284d，g109a+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g，w140y+n195f+v206y+y243f+e260g，n195f+v206y+y243f+e260k+w284d，d134e+g476e，w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+g476e，w140y+w189g+n195f+v206y+y243f+e260g，w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+s303g，w140y+w189t+n195f+v206y+y243f+e260g，w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+w284d，y100i+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g，w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+g337n，w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+w439rg109a+w140y+e194d+n195f+v206y+y243f+e260gg109a+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+g476et51i+y100i+g109a+w140y+n195f+v206y+y243f+e260gt51i+g109a+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+w439rt51i+s52q+n54k+g109a+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+g476ew140y+n195f+v206y+y243f+e260g+g304r+g476kw140y+n195f+v206y+y243f+e260g+w284r+g477kw140y+n195f+v206y+y243f+e260g+w284f+g477r，和n195f+v206y+y243f+e260g+w284d。在又另一个方面，本发明涉及变体，所述变体包含与seqidno:1的多肽的位置相应的位置内的改变，所述改变选自由以下改变组成的组：d183*+g184*+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+g477e，d183*+g184*+w140y+n195f+v206y+y243f+e260t+w284d，d183*+g184*+w140y+n195f+v206y+y243f+w284d，d183*+g184*+g109a+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g，d183*+g184*+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g，d183*+g184*+n195f+v206y+y243f+e260k+w284d，d183*+g184*+d134e+g476e，d183*+g184*+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+g476e，d183*+g184*+w140y+w189g+n195f+v206y+y243f+e260g，d183*+g184*+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+s303g，d183*+g184*+w140y+w189t+n195f+v206y+y243f+e260g，d183*+g184*+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+w284d，d183*+g184*+y100i+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g，d183*+g184*+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+g337n，d183*+g184*+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+w439rd183*+g184*+g109a+w140y+e194d+n195f+v206y+y243f+e260gd183*+g184*+g109a+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+g476ed183*+g184*+t51i+y100i+g109a+w140y+n195f+v206y+y243f+e260gd183*+g184*+t51i+g109a+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+w439rd183*+g184*+t51i+s52q+n54k+g109a+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+g476ed183*+g184*+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+g304r+g476kd183*+g184*+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+w284r+g477kd183*+g184*+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+w284f+g477r，和d183*+g184*+n195f+v206y+y243f+e260g+w284d。在另一个方面，本发明涉及变体，所述变体由与seqidno:1的多肽的位置相应的位置内的改变组成，所述改变选自由以下改变组成的组：d183*+g184*+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+g477e，d183*+g184*+w140y+n195f+v206y+y243f+e260t+w284d，d183*+g184*+w140y+n195f+v206y+y243f+w284d，d183*+g184*+g109a+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g，d183*+g184*+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g，d183*+g184*+n195f+v206y+y243f+e260k+w284d，d183*+g184*+d134e+g476e，d183*+g184*+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+g476e，d183*+g184*+w140y+w189g+n195f+v206y+y243f+e260g，d183*+g184*+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+s303g，d183*+g184*+w140y+w189t+n195f+v206y+y243f+e260g，d183*+g184*+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+w284d，d183*+g184*+y100i+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g，d183*+g184*+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+g337n，d183*+g184*+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+w439rd183*+g184*+g109a+w140y+e194d+n195f+v206y+y243f+e260gd183*+g184*+g109a+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+g476ed183*+g184*+t51i+y100i+g109a+w140y+n195f+v206y+y243f+e260gd183*+g184*+t51i+g109a+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+w439rd183*+g184*+t51i+s52q+n54k+g109a+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+g476ed183*+g184*+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+g304r+g476kd183*+g184*+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+w284r+g477kd183*+g184*+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+w284f+g477r，和d183*+g184*+n195f+v206y+y243f+e260g+w284d。可以根据本领域已知的方法，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变鉴定亲本中的必需氨基酸(康宁汉(cunningham)和韦尔斯(wells)，1989,科学(science)244:1081-1085)。在后一种技术中，将单个丙氨酸突变在分子中的每个残基处引入，并且对所产生的突变体分子测试α-淀粉酶活性以鉴定对该分子活性至关重要的氨基酸残基。还见希尔顿(hilton)等人，1996,生物化学杂志(j.biol.chem.)271:4699-4708。也可以通过结构的物理分析测定α-淀粉酶的活性部位或其他生物学相互作用，如通过这类技术如核磁共振、结晶学、电子衍射或光亲和标记法，连同推定的接触位点氨基酸突变所确定的。参见，例如德·沃斯(devos)等人，1992,科学(science)255:306-312；史密斯(smith)等人，1992,分子生物学杂志(j.mol.biol.)224:899-904；wlodaver等人，1992，欧洲生物化学学会联盟通讯(febslett.)309:59-64。也可以从与多肽的一致性的分析推断必需氨基酸的身份，其中所述多肽与亲本相关。多核苷酸本发明还涉及编码本发明的任何变体的分离的多核苷酸。核酸构建体本发明还涉及核酸构建体，所述核酸构建体包含与一个或多个(几个)控制序列可操作地连接的编码本发明变体的多核苷酸，其中所述控制序列指导编码序列在适合的宿主细胞中在与所述控制序列相容的条件下的表达。可以按多种方式操作多核苷酸以提供变体的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前操作多核苷酸可能是令人希望的或必需的。利用重组dna方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。控制序列可以是启动子序列，所述启动子序列由宿主细胞识别用于表达多核苷酸。启动子序列含有介导变体表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列，包括突变、截短和杂合启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因中获得。指导本发明的核酸构建体在细菌宿主细胞中转录的适合启动子的实例是从解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyq)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyl)，地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penp)、嗜热脂肪地芽孢杆菌生麦芽糖淀粉酶基因(amym)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacb)、枯草芽孢杆菌xyla和xylb基因、大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌琼脂酶基因(daga)和原核β-内酰胺酶基因获得的启动子(维拉-科马罗夫(villa-kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊75:3727-3731)、以及tac启动子(德波儿(deboer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。其他启动子在吉尔伯特(gilbert)等人，1980,科学美国人(scientificamerican)，242:74-94的“usefulproteinsfromrecombinantbacteria(来自重组细菌的有用蛋白质)”中、以及由桑布鲁克(sambrook)等人(1989，上文)描述。指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的适合启动子的实例是从构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaa)、米曲霉taka淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶(wo96/00787)、fusariumvenenatum淀粉葡糖苷酶(wo00/56900)、fusariumvenenatumdaria(wo00/56900)、fusariumvenenatumquinn(wo00/56900)、米黑根毛霉(rhizomucormiehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶i、里氏木霉纤维二糖水解酶ii、里氏木霉内切葡聚糖酶i、里氏木霉内切葡聚糖酶ii、里氏木霉内切葡聚糖酶iii、里氏木霉内切葡聚糖酶iv、里氏木霉内切葡聚糖酶v、里氏木霉木聚糖酶i、里氏木霉木聚糖酶ii、里氏木霉β-木糖苷酶的基因获得的启动子，以及na2-tpi启动子(修饰的启动子包括编码曲霉内的中性α-淀粉酶的基因，其中非翻译前导序列已经由来自编码曲霉中的磷酸丙糖异构酶的基因中的非翻译前导序列替换；非限制性实例包括修饰的启动子，所述启动子包括编码黑曲霉内的中性α-淀粉酶的基因，其中非翻译前导序列已经由来自编码构巢曲霉或米曲霉中的磷酸丙糖异构酶的基因中的非翻译前导序列替换)；及其突变、截短和杂合启动子。在酵母宿主中，从酿酒酵母烯醇化酶(eno-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(gal1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(adh1、adh2/gap)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(tpi)、酿酒酵母金属硫蛋白(cup1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因获得有用启动子。酵母宿主细胞的其他有用启动子由罗马诺斯(romanos)等人，1992,酵母(yeast)8:423-488描述。控制序列也可以是由宿主细胞识别以终止转录的适合的转录终止子序列。终止子序列与编码变体的多核苷酸的3'末端可操作地连接。可以使用在宿主细胞中有功能的任何终止子。从构巢曲霉邻氨基苯甲酸酯合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉taka淀粉酶和尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶的基因获得用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子。从酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素c(cyc1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因获得用于酵母宿主细胞的优选终止子。酵母宿主细胞的其他有用终止子由罗马诺斯(romanos)等人，1992，上文描述。控制序列也可以是适合的前导序列，所述前导序列是对宿主细胞翻译重要的mrna的非翻译区。该前导序列与编码变体的多核苷酸的5'末端可操作地连接。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。从米曲霉taka淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶的基因获得用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列。从酿酒酵母烯醇化酶(eno-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(adh2/gap)的基因获得用于酵母宿主细胞的适合的前导序列。控制序列也可以是多聚腺苷酸化序列，一种与编码变体的序列的3'末端可操作地连接并在转录时由宿主细胞识别为向转录的mrna添加聚腺苷酸残基的信号的序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何多聚腺苷酸化序列。从构巢曲霉邻氨基苯甲酸酯合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉taka淀粉酶和尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶的基因获得用于丝状真菌宿主细胞的优选多聚腺苷酸化序列。用于酵母宿主细胞的有用多聚腺苷酸化序列由郭(guo)和谢尔曼(sherman)，1995,分子细胞生物学(mol.cellularbiol.)15:5983-5990描述。控制序列也可以是编码信号肽的信号肽编码区，其中所述信号肽与变体的n末端连接并且指导变体进入细胞的分泌途径。多核苷酸的编码序列的5'末端可以内在地含有在翻译阅读框中与编码变体的编码区的区段天然连接的信号肽编码区。可替代地，编码序列的5'末端可以含有相对于编码序列为外来的信号肽编码区。在编码序列不天然地含有信号肽编码区的情况下，可能需要外来信号肽编码区。可替代地，外来信号肽编码区可以单纯地替代天然信号肽编码区以便增强变体的分泌。然而，可以使用指导已表达变体进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区。用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从芽孢杆菌ncib11837生麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprt、nprs、nprm)和枯草芽孢杆菌prsa的基因获得的信号肽编码序列。其他信号序列由西莫宁(simonen)和帕尔瓦(palva)，1993,微生物评论(microbiologicalreviews)57:109-137描述。用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉taka淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶v、柔毛腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的基因获得的信号肽编码序列。从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得用于酵母宿主细胞的有用信号肽。其他的有用的信号肽编码序列由罗曼诺斯(romanos)等人(1992，上文)描述。控制序列也可以是编码位于变体n末端处的前肽的前肽编码区。所产生的多肽称作酶原或多肽原(或在某些情况下酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过前肽的催化或自催化裂解而从多肽原转化成活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(apre)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprt)、嗜热毁丝霉漆酶(wo95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子的基因获得前肽编码区。在信号肽和前肽区两者都在变体的n末端存在的情况下，将前肽区紧邻变体的n末端定位并且将信号肽区紧邻前肽区的n末端定位。也可能令人希望的是添加调节序列，所述调节序列允许相对于宿主细胞的生长而调节变体的表达。调节系统的实例是引起将响应于化学或物理刺激(包括调节性化合物的存在)而开启或关闭的基因表达的那些系统。原核体系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用adh2系统或gal1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉takaα-淀粉酶启动子、和米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核体系中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因和因重金属而扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码变体的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。表达载体本发明还涉及包含本发明多核苷酸、启动子和转录与翻译终止信号的重组表达载体。各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，所述重组表达载体可以包含一个或多个(几个)合宜的限制性位点以允许在这样的位点插入或置换编码变体的多核苷酸。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列如此位于载体中，使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。重组表达载体可以是可以合宜地经受重组dna程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。典型地，载体的选择将取决于载体与向其中待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭合环状质粒。载体可以是自主复制载体，即作为其复制不依赖于染色体复制的染色体外实体而存在的载体，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当被导入宿主细胞中时，所述载体整合入基因组中并且随已经整合入该载体的染色体一起复制。此外，可以使用单个载体或质粒或一起含有待引入宿主细胞的基因组的总dna的两种或更多种载体或质粒、或者转座子。载体优选地含有允许便于选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等的一个或多个(几个)选择标记。选择标记是一种基因，其产物提供杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、原养型至营养缺陷型，等等。细菌选择标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因或赋予抗生素抗性如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素或四环素抗性的标记。用于酵母宿主细胞的适合标记是ade2、his3、leu2、lys2、met3、trp1、和ura3。用于丝状真菌宿主细胞中的选择标记包括但不限于amds(乙酰胺酶)、argb(鸟氨酸氨基甲酰转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niad(硝酸还原酶)、pyrg(鸟氨酸-5'-磷酸脱羧酶)、sc(硫酸腺苷酰转移酶)和trpc(邻氨基苯甲酸酯合酶)、以及其等同物。优选用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amds和pyrg基因以及吸水链霉菌的bar基因。载体优选地含有允许载体整合至宿主细胞基因组中或载体在细胞中独立于基因组而自主复制的元件。为了整合至宿主细胞基因组中，载体可以依赖于编码变体的多核苷酸序列或用于借助同源或非同源重组整合至基因组中的任何其他载体元件。可替代地，载体可以含有另外的核苷酸序列，所述核苷酸序列用于指导在染色体中的精确位置处通过同源重组整合至宿主细胞的基因组中。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数目的核酸，如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对，所述核酸与相应的靶序列具有高度一致性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。在另一方面，载体可以通过非同源重组整合至宿主细胞的基因组中。为了自主复制，载体还可以包含复制起点，所述复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的核苷酸序列。细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pbr322、puc19、pacyc177和pacyc184的复制起点、以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pub110、pe194、pta1060和的复制起点。用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ars1、ars4、ars1和cen3的组合、以及ars4和cen6的组合。在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是ama1和ans1(gems等人，1991,基因(gene)98:61-67；卡伦(cullen)等人，1987,核酸研究(nucleicacidsres.)15:9163-9175；wo00/24883)。可以根据wo00/24883中披露的方法完成ama1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。可以将本发明多核苷酸的一个以上的拷贝插入宿主细胞以增加变体的产生。可以通过将至少一个另外拷贝的序列整合至宿主细胞基因组中或随该多核苷酸一起包含可扩增选择标记基因而获得多核苷酸的拷贝数的增加，其中可以通过在适当的选择剂存在下培养所述细胞来选择含有已扩增拷贝的选择标记基因并因而含有另外的拷贝的多核苷酸的细胞。用来连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域技术人员熟知的(参见，例如桑布鲁克等人，1989，上文)以获得基本上纯的变体。宿主细胞本发明还涉及重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含与指导本发明变体产生的一个或多个(几个)控制序列可操作地连接的本发明多核苷酸。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，从而该构建体或载体被维持为染色体整合体或被维持为如稍早描述的自我复制染色体外载体。术语“宿主细胞”涵盖因复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码变体的基因及其来源。宿主细胞可以是在变体的重组产生中有用的任何细胞，例如原核生物或真核生物。原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括，但不限于芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括，但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟球菌属、假单胞菌属、沙门菌属和脲原体属。细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌细胞、解淀粉芽孢杆菌细胞、短芽孢杆菌细胞、环状芽孢杆菌细胞、克劳氏芽孢杆菌细胞、凝结芽孢杆菌细胞、坚强芽孢杆菌细胞、灿烂芽孢杆菌细胞、迟缓芽孢杆菌细胞、地衣芽孢杆菌细胞、巨大芽孢杆菌细胞、短小芽孢杆菌细胞、嗜热脂肪芽孢杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞和苏云金芽孢杆菌细胞。细菌宿主细胞也可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于马链球菌细胞、化脓性链球菌细胞、乳房链球菌细胞、和马链球菌兽疫亚种细胞。细菌宿主细胞也可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于不产色链霉菌细胞、阿维链霉菌细胞、天蓝色链霉菌细胞、灰色链霉菌细胞、和浅青紫链霉菌细胞。可以例如通过原生质体转化(参见，例如昌(chang)和科恩(cohen)，1979,现代分子生物学(mol.gen.genet.)168:111-115)、通过使用感受态细胞(参见，例如杨(young)和斯皮宰曾(spizizen)，1961,细菌学杂志(j.bacteriol.)81:823-829，或dubnau和davidoff-abelson,1971,分子生物学杂志(j.mol.biol.)56:209-221)、通过电穿孔(参见，例如shigekawa和dower,1988,生物技术(biotechniques)6:742-751)或通过接合(参见，例如克勒(koehler)和索恩(thorne)，细菌学杂志(j.bacteriol.)169:5271-5278)实现向芽孢杆菌细胞中引入dna。可以例如通过原生质体转化(参见，例如哈那汗(hanahan)，1983,分子生物学杂志(j.mol.biol.)166:557-580)或电穿孔(见，例如dower等人，1988,核酸研究(nucleicacidsres.)16:6127-6145))实现向大肠杆菌细胞中引入dna。可以例如通过原生质体转化和电穿孔(参见，例如贡(gong)等人，2004,foliamicrobiol.(praha)49:399-405)、通过接合(参见，例如马卓德(mazodier)等人，1989，细菌学杂志171:3583-3585)或通过转导(参见，例如伯克(burke)等人，2001，美国国家科学院院刊98:6289-6294)实现向链霉菌细胞中引入dna。可以例如通过电穿孔(参见，例如崔(choi)等人，2006,微生物学方法杂志(j.microbiol.methods)64:391-397)或通过结合(参见，例如皮内多(pinedo)和斯梅茨(smets)，2005,应用与环境微生物学(appl.environ.microbiol.)71:51-57)实现向假单胞菌细胞中引入dna。可以例如通过天然感受态(参见，例如斐瑞(perry)和仓光(kuramitsu)，感染免疫学(infect.immun.)32:1295-1297)、通过原生质体转化(参见，例如卡特(catt)和jollick,1991,微生物(microbios)68:189-207)、通过电穿孔(参见，例如巴克利(buckley)等人，1999,应用与环境微生物学65:3800-3804)或通过接合(参见，例如clewell，1981,微生物学评论(microbiol.rev.)45:409-436)实现向链球菌细胞中引入dna。然而，可以使用本领域已知的向宿主细胞中引入dna的任何方法。宿主细胞也可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。宿主细胞可以是真菌细胞。如在此所用的“真菌”包括子囊菌门(ascomycota)、担子菌门(basidiomycota)、壶菌门(chytridiomycota)和接合菌门(zygomycota)以及卵菌门(oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如霍克斯沃思(hawksworth)等人定义，引自：ainsworthandbisby'sdictionaryofthefungi，第8版，1995,国际cab，大学出版社(universitypress)，剑桥(cambridge)，英国)。真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此所用的“酵母”包括产子囊孢子酵母(内孢霉目(endomycetales))、产担孢子酵母和属于半知菌纲(fungiimperfecti)的酵母(芽孢纲(blastomycetes))。由于酵母的分类可能在将来变化，为了本发明的目的，酵母应当如酵母的生物学与活性(biologyandactivitiesofyeast)(斯金纳(skinner)，f.a.,帕斯莫尔(passmore)，s.m.和达文波特(davenport)，r.r.编著，应用细菌学学会专题论文集系列9(soc.app.bacteriol.symposiumseriesno.9)，1980)所描述那样定义。酵母宿主细胞可以是假丝酵母属细胞、汉逊酵母属细胞、克鲁维酵母属细胞、毕赤酵母属细胞、酵母菌属细胞、裂殖酵母或子囊菌酵母属细胞，如乳酸克鲁维酵母细胞、卡氏酵母细胞、酿酒酵母细胞、糖化酵母细胞、道格拉斯酵母(saccharomycesdouglasii)细胞、克鲁弗酵母细胞、诺地酵母细胞、卵形酵母细胞或解脂子囊菌酵母细胞。真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(eumycota)和卵菌门(oomycota)亚类的所有丝状形式(如霍克斯沃思等人，1995，上文定义)。丝状真菌通常以由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复杂多糖组成的菌丝体壁为特征。营养生长是菌丝伸长并且碳分解代谢是专性需氧的。相比之下，酵母例如酿酒酵母的营养生长是通过单细胞菌体的出芽并且碳分解代谢可以是发酵性的。丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属细胞、曲霉属细胞、金担子菌属细胞、烟管菌属(bjerkandera)细胞、拟蜡菌属细胞、金孢属细胞、鬼伞属细胞、革盖菌属(coriolus)、隐球菌属细胞、绒黑粉类酵母细胞、镰刀菌属细胞、腐质霉属细胞、巨座壳属细胞、毛霉属细胞、毁丝霉属细胞、新美鞭菌属细胞、脉孢菌属细胞、拟青霉属细胞、青霉属细胞、平革菌属细胞、射脉菌属(phlebia)细胞、梨囊鞭菌属细胞、侧耳属细胞、裂褶菌属细胞、蓝状菌属细胞、嗜热子囊菌细胞、梭孢壳属细胞、弯颈霉属细胞、栓菌属(trametes)细胞或木霉属细胞。例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉细胞、臭曲霉细胞、烟曲霉细胞、日本曲霉细胞、构巢曲霉细胞、黑曲霉细胞、米曲霉细胞、烟管菌(bjerkanderaadusta)细胞、干拟蜡菌(ceriporiopsisaneirina)细胞、ceriporiopsiscaregiea细胞、浅黄拟蜡菌(ceriporiopsisgilvescens)细胞、ceriporiopsispannocinta细胞、ceriporiopsisrivulosa细胞、浅红拟蜡菌(ceriporiopsissubrufa)细胞、弯孢拟蜡菌(ceriporiopsissubvermispora)细胞、chrysosporiuminops细胞、嗜角质金孢子菌细胞、勒克瑙金孢细胞、粪状金孢细胞、毛金孢细胞、昆士兰金孢细胞、热带金孢子菌细胞、chrysosporiumzonatum细胞、灰盖鬼伞细胞、毛革盖菌(coriolushirsutus)细胞、杆孢状镰刀菌细胞、fusariumcerealis细胞、克地镰刀菌细胞、黄色镰刀菌细胞、禾谷镰刀菌、禾赤镰刀菌细胞、异孢镰刀菌细胞、合欢木镰刀菌细胞、尖孢镰刀菌细胞、网状镰刀菌细胞、粉红镰刀菌细胞、接骨木镰刀菌细胞、肤色镰刀菌细胞、拟枝孢镰刀菌细胞、硫色镰刀菌细胞、簇囊镰刀菌细胞、拟丝孢镰刀菌细胞、fusariumvenenatum细胞、特异腐质霉细胞、柔毛腐质霉细胞、米黑毛霉细胞、嗜热毁丝霉细胞、粗糙脉孢菌细胞、产紫青霉细胞、黄孢原毛平革菌细胞、辐射射脉菌(phlebiaradiata)细胞、刺芹侧耳(pleurotuseryngii)细胞、土生梭孢壳细胞、长绒毛栓菌(trametesvillosa)细胞、变色栓菌(trametesversicolor)细胞、哈茨木霉细胞、康氏木霉细胞、长枝木霉细胞、里氏木霉细胞或绿色木霉细胞。真菌细胞可以通过下述过程转化，所述过程涉及原生质体形成、原生质体的转化、以及以本身已知的方式的细胞壁的再生。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在ep238023和埃尔顿(yelton)等人，1984,美国国家科学院院刊81:1470-1474中描述。用于转化镰刀菌属物种的适合方法在马拉迪耶(malardier)等人，1989,基因(gene)78:147-156和wo96/00787中描述。可以使用以下文献中描述的程序转化酵母：贝克尔(becker)和瓜伦特(guarente)，引自阿贝尔森(abelson)，j.n.和西蒙(simon)，m.i.编者，酵母遗传学与分子生物学指南(guidetoyeastgeneticsandmolecularbiology)，酶学方法(methodsinenzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社公司(academicpress,inc.)，纽约；ito等人，1983，细菌学杂志(j.bacteriol.)153:163；和hinnen等人，1978，美国国家科学院院刊75:1920。产生的方法本发明还涉及产生变体的方法，所述方法包括：(a)将本发明的宿主细胞在适合于表达该变体的条件下培养；并且(b)回收该变体。使用本领域已知的方法，在适合于产生变体的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养、或在实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养细胞，所述培养在适合的培养基中并且在允许表达和/或分离多肽的条件下进行。使用本领域已知的程序，在包含碳源和氮源和无机盐的适合营养培养基中进行培养。适合的培养基从商业供应商可获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果变体分泌至营养培养基中，则可以直接从培养基回收该变体。如果未分泌变体，可以从细胞裂解液将其回收。可以使用本领域已知的对变体特异的方法检测变体。这些检测方法可以包括利用特异性抗体、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶测定法可以用来测定变体的活性。可以通过本领域已知的方法回收该变体。例如，可以通过常规程序从营养培养基回收变体，所述常规程序包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。可以通过本领域已知的多种方法纯化变体，所述方法包括但不限于色谱(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法、聚焦色谱法和大小排阻色谱法)、电泳方法(例如，制备性等电聚焦)、差异性溶解(例如，硫酸铵沉淀)、sds-page、或提取(参见，例如，蛋白质纯化(proteinpurification)，编者j.-c.janson和larsryden,vch出版公司，纽约，1989)，以便获得基本上纯的变体。在替代性方面，不回收变体，而是使用表达变体的本发明宿主细胞作为变体的来源。组合物本发明还涉及包含本发明变体的组合物。优选地，组合物富集这种变体。术语“富集”意指组合物的α-淀粉酶活性已经增加，例如具有1.1的富集因子。该组合物可以包含变体作为主要酶促组分，例如单组分组合物。可替代地，该组合物可以包含多种酶活性，如氨基肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤代过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶裂解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。另外的酶可以例如由属于以下属的微生物产生：曲霉属，例如，棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；镰刀菌属，例如，杆孢状镰刀菌、fusariumcerealis、克地镰刀菌、黄色镰刀菌、禾谷镰刀菌、禾赤镰刀菌、异孢镰刀菌、合欢木镰刀菌、尖孢镰刀菌、网状镰刀菌、粉红镰刀菌、接骨木镰刀菌、肤色镰刀菌、硫色镰刀菌、fusariumtoruloseum、拟丝孢镰刀菌或fusariumvenenatum；腐质霉属，例如，特异腐质霉或柔毛腐质霉；或木霉属(trichoderma)，例如，哈茨木霉、康氏木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉。可以根据本领域已知的方法制备组合物，并且它可以处于液体或干燥组合物的形式。例如，组合物可以处于颗粒或微颗粒的形式。可以根据本领域已知的方法将变体稳定化。根据本发明，以上α-淀粉酶变体典型地可以是清洁组合物如洗涤剂组合物，例如衣物洗涤剂组合物或餐具洗涤洗涤剂组合物中的组分。特别优选的是液体衣物洗涤剂组合物。这样的清洁组合物包含清洁/洗涤剂助剂，优选地组分的混合物。典型地，清洁助剂将在组合物中以从0.001至99.9wt％、更典型地从0.01至80wt％清洁助剂的量存在。在另一个优选的方面，这种组合物包含一种或多种表面活性剂，所述表面活性剂可以是非离子的(包括半极性)和/或阴离子和/或阳离子和/或两性离子的和/或两性的和/或半极性非离子的和/或它们的混合物。表面活性剂典型地以组合物的大约从0.1％至60重量％或从0.5至50wt％或1至40wt％的水平存在。用途本发明还涉及使用α-淀粉酶变体的方法。本发明的α-淀粉酶变体可用于洗涤剂组合物、低温衣物洗涤、餐具洗涤和/或清洁过程。实例用于确定α-淀粉酶活性的pnp-g7测定法可通过使用g7-pnp底物的方法确定α-淀粉酶活性。缩写为4,6-亚乙基(g7)-对硝基苯基(g1)-α,d-麦芽庚糖苷的g7-pnp是一种可由内切淀粉酶如α-淀粉酶切割的嵌段低聚糖。切割后，包含在试剂盒中的α-葡糖苷酶进一步消化水解的底物以释放游离的pnp分子，所述分子具有黄色并且因此可通过可见分光光度法在λ＝405nm(400-420nm)处测量。含有g7-pnp底物和α-葡糖苷酶的试剂盒由罗氏/日立公司(roche/hitachi)制造(目录号11876473)。试剂：来自这个试剂盒的g7-pnp底物含有22mm4,6-亚乙基-g7-pnp和52.4mmhepes(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸)，ph7.0)。α-葡糖苷酶试剂含有52.4mmhepes、87mmnacl、12.6mmmgcl2、0.075mmcacl2、>4ku/l的α-葡糖苷酶。通过将1mlα-葡糖苷酶试剂与0.2mlg7-pnp底物混合，产生底物工作溶液。在使用之前即刻产生这种底物工作溶液。稀释缓冲液：50mmmops，0.05％(w/v)tritonx100(聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚(c14h22o(c2h4o)n(n＝9-10)))，1mmcacl2，ph8.0。流程：将待分析的淀粉酶样品稀释于稀释缓冲液中以确保稀释样品中的ph是7。通过转移20μl稀释的酶样品至96孔微量滴定板并添加80μl底物工作溶液而进行该测定法。将溶液混合并且在室温预孵育1分钟并且在od405nm在5分钟范围内每20秒测量吸收。时间依赖性吸收曲线的斜率(每分钟吸光度)与在给定系列条件下的在讨论中的α-淀粉酶的比活性(活性/mg酶)成正比。淀粉酶样品应当被稀释至其中斜率低于0.4吸光度单位/分钟的水平。用于衣物的自动机械应力测定法(amsa)为了评定在衣物中的洗涤性能，使用自动机械应力测定法(amsa)进行洗涤实验。采用amsa，可以检验大量的小体积酶-洗涤剂溶液的洗涤性能。amsa平板具有用于试验溶液的许多狭槽和抵住全部狭槽开口牢固挤压衣物样品(待洗涤的纺织品)的盖。在洗涤时间期间，将平板、试验溶液、纺织品和盖剧烈振摇以便使试验溶液与纺织品接触并以常规、周期性振荡方式施加机械应力。关于进一步描述，参见wo02/42740，尤其是在第23-24页的段落“具体方法实施例”。洗涤性能总体描述制备一种试验溶液，所述试验溶液包含水(10°dh)、0.8g/l洗涤剂(例如，如下文描述的5.1g/l欧洲液体洗涤剂)和本发明酶(例如处于浓度0、0.8和/或1.2mg酶蛋白/l)。加入具有淀粉污渍的织物(例如，来自试验材料中心bv(荷兰弗拉尔丁恩，邮箱120,3133kt)的cs-28)并且将它们在20℃洗涤20分钟。在流动自来水下彻底漂洗并且在黑暗中干燥之后，随后测量带有污渍的织物的光强度或反射值作为洗涤性能的量度。具有0mg酶蛋白/l的试验用作空白以获得δ减弱值。优选地，在洗涤步骤期间施加机械作用，例如以将洗涤溶液与织物一起振摇、转动或搅拌的形式施加。amsa洗涤性能实验在以下详细说明的实验条件下实施。表1：amsa实验条件淀粉酶稀释缓冲剂：将淀粉酶稀释于超纯水(milliq水)中，具有在储存期间使淀粉酶稳定化的低浓度的钙(0.1mm))和降低酶蛋白吸附于容器和移液器的风险的0.01％tritonx-100。通过向测试系统添加cacl2、mgcl2和nahco3(ca2+:mg2+:hco3-＝3:1:4.5)，将水硬度调节至10°dh。在洗涤之后，将纺织品在自来水中冲洗，然后干燥。将洗涤性能测量为洗涤过的纺织品的色彩亮度。亮度也可以表述为用白光照明时从样品反射的光的强度。当样品被玷污时，反射光的强度低于干净样品的反射光强度。因此反射光的强度光可以用来度量洗涤性能。用专业平板扫描仪(flatbedscanner)进行颜色测量(kodakiqsmart,kodak,midtager29,dk-2605丹麦)，所述扫描仪用来捕获洗涤的纺织品的图像。为了提取来自扫描图像的光强度的值，来自图像的24比特像素值被换算成红色、绿色和蓝色(rgb)的值。通过将这些rgb值作为向量加在一起并且随后乘以所得向量的长度来计算强度值(int)：纺织品：纺织品样品cs-28(棉花上的米淀粉)从试验材料中心bv(邮箱120,3133kt，vlaardingen，荷兰)获得。表3中显示不同变体的amsa衣物试验的结果。在该结果中，index是100。将亲本α-淀粉酶的性能结果赋予值100并且将变体的结果与这个值比较。amsa洗涤性能通过如方法部分中所述的amsa试验方法测试变体和相应亲本α-淀粉酶的洗涤性能。将结果给出为(变体的性能-空白的性能)除以(亲本的性能-空白的性能)乘以100，其中空白是通过在相同的条件下、但是不存在α-淀粉酶时洗涤所获得的性能。最后，计算在两个浓度0.8和1.2mg/l时相对性能的均数。结果呈现在表3中。terg-o-tometer(tom)洗涤测定法tergo-to-meter(tom)是可以用来同时测试12种不同洗涤条件的中等规模模型洗涤系统。tom基本上是巨大的具有多达12个开放金属烧杯淹没至其中的温度受控的水浴。每个烧杯构成一个小的上开门(toploader)式洗衣机并且在实验期间，它们中的每一个将含有特定洗涤剂/酶系统的溶液和对之测试其性能的玷污和未玷污的织物。机械应力由转动搅拌臂实现，所述转动搅拌臂搅动每只烧杯内部的液体。因为tom烧杯无盖，因此可以在tom实验期间抽取样品并且分析洗涤期间的在线信息。tom模型洗涤系统主要用于在us或la/ap洗涤条件下的洗涤剂和酶的中等规模测试。在tom实验中，可以改变多个因素，如压载物(ballast)对污垢的比率以及织物对洗涤液的比率。因此，tom提供了在小规模实验(如amsa和微型洗涤)与在上开门式洗衣机中的更费时的全规模实验之间的联系。设备：具有12个钢烧杯和1个转动臂/烧杯的水浴，容量为500或1200ml洗涤剂溶液。温度范围是从5℃至80℃。水浴应当用去离子水填充。转动速度可以设定到高达70至120转/分钟。tom洗涤性能通过添加cacl2、mgcl2和nahco3，将水硬度调节至下文描述的强度。如下文描述，用所希望的量的洗涤剂、温度和水硬度在桶中制备洗涤溶液。洗涤剂在磁搅拌10分钟期间溶解。(在制备之后30至60分钟之内使用洗涤溶液)。在terg-o-tometer中，根据以下设置设定水浴中的温度和转速(转/分钟)。当根据设置调节温度(公差是+/-0.5℃)时，将洗涤溶液根据下文描述的量添加至tom烧杯。在烧杯中以120转/分钟进行搅拌。将2份米淀粉样品(cs-28)和污垢压载物添加至每个烧杯并且根据下文所述的时间进行洗涤。将样品在冷的自来水中漂洗5分钟。样品于黑暗中静置干燥过夜。纺织品：从荷兰弗拉尔丁恩试验材料中心bv(邮箱120,3133kt)获得纺织品样品cs-28(在棉花上的米淀粉)。污垢压载物：污垢压载物，从荷兰弗拉尔丁恩试验材料中心bv(邮箱120,3133kt)获得在棉花/聚酯上的米淀粉(empa162)。bistro肉汁(063kc)、frij巧克力奶昔、heinz意大利面条(113kc)、herseys双层巧克力从英国warwickequest有限公司(达勒姆郡，dh86bn，康塞特，康塞特商业园(consettbusinesspark)，55单元)获得。不同变体的tom洗涤试验的结果显示在表3中。在该结果中，index是100。将值100赋给亲本α-淀粉酶(seqidno:7)的性能结果并且将变体的结果与这个值比较。表2：实验条件洗涤剂和试验材料如下：将洗涤性能度量为洗涤过的纺织品的色彩亮度，以减弱值表述。使用macbeth7000coloreye分光光度计进行减弱测量。测量每份干燥样品。由于存在来自背景的干扰风险，在测量减弱期间将样品置于4层织物的顶部上。在460nm处测量减弱。不包含uv滤光片。计算样品减弱的平均结果。实例1α-淀粉酶在欧洲(eu)(实例1a)和北美洲(实例1b)(us)液体洗涤剂中的洗涤性能如上文所述测试了受测试的变体和相应亲本α-淀粉酶(seqidno:7)的洗涤性能。将结果给出为(变体的性能-空白的性能)除以(亲本的性能-空白的性能)乘以100，其中空白是通过在相同的条件下、但是不存在α-淀粉酶时洗涤所获得的性能。实例1a：欧洲重垢液体衣物洗涤剂组合物1无规接枝共聚物是具有聚环氧乙烷主链和多个聚乙酸乙烯酯侧链的聚乙酸乙烯酯接枝聚环氧乙烷共聚物。聚环氧乙烷主链的分子量是大约6000并且聚环氧乙烷对聚乙酸乙烯酯的重量比是大约40至60，并且每50个环氧乙烷单元不多于1个接枝点。实例1b:北美洲重垢液体衣物洗涤剂组合物实例1b(wt％)烷基乙氧基1.8硫酸钠17.29烷基苯磺酸钠7.73支链烷基硫酸盐3.3c12-18烷基1.5-9乙氧基化物1.31c12二甲胺氧化物1.03柠檬酸0.67c12-18脂肪酸1.52硼酸钠(borax)2.53乙氧基化聚乙烯亚胺21.44膦酸化螯合剂0.34二羟基苯-3,5-二磺酸二钠盐水合物0.19光亮剂0.29两性烷氧基化的油脂清洁聚合物31.93少量：染料、香料、酶、酶稳定剂、溶剂、结构剂、ph调节剂平衡2具有20个乙氧基化物基团/-nh的聚乙烯亚胺(mw＝600)。3两性烷氧基化油脂清洁聚合物是具有24个乙氧基化物基团/-nh和具有16个丙氧基化物基团/-nh的聚乙烯亚胺(mw＝600)。表3：洗涤性能洗涤性能试验结果清楚地证明，在测试的温度下，变体的性能相对于它们的对应亲本分子(seqidno:7)被改善。实例2在液体洗涤剂中的淀粉酶变体的全规模洗衣机性能评价i.洗涤剂试验组合物的制备在这个实验中，基于液体洗涤剂实例1a制备四种试验组合物。从实例1a制备洗涤剂基料，它不含酶并且将其调节至ph8.2。制备以下四种洗涤剂制剂：表4*作为活性酶蛋白添加是由丹麦鲍斯韦诺维信a/s作为‘natalase200l‘供应的酶。2变体1是野生型淀粉酶芽孢杆菌sp722seqidno:1的本发明的淀粉酶变体，其具有以下两个缺失d183*+g184*并且包含置换w140y、n195f、v206y、y243f、e260g和w284d。还称作sp722+d183*+g184*+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+w284d3变体2是野生型淀粉酶芽孢杆菌sp722seqidno:1的本发明的淀粉酶变体，其具有以下两个缺失d183*+g184*并且包含置换w140y、n195f、v206y、y243f和w284d。还称作sp722+d183*+g184*+w140y+n195f+v206y+y243f+w284d。ii.试验织物三种淀粉酶敏感性污渍：cs-28米淀粉、pcs-28米淀粉和cs-29木薯淀粉(5cmx5cm)(由荷兰试验材料中心供应)被附着至20cmx20cm白色针织棉布(由英国达勒姆warwickequest供应)。两种淀粉酶敏感性污渍：bbq酱汁和frijj巧克力奶昔(直径2.5cm)被附着至20cmx20cm白色针织棉布(由英国达勒姆warwickequest供应)。将8个重复(2个重复，跨4台不同的机器)用于每种试验制剂。表5：iii.试验洗涤程序该方法涉及使用西欧hotpoint洗衣机，型号aquariuswf541。使用如上文所述的试验制剂在添加如上文所述的混合污垢和清洁压载物荷载的情况下洗涤淀粉酶敏感性污渍。含有6g/l试验制剂、10°的克拉克硬度的13l水外加试验织物及压载物的洗衣机在15℃以持续1小时和15分钟的快速棉制品洗涤周期进行洗涤。在洗涤之后，将试验织物在室内挂干。将洗涤过程重复另外3个洗涤周期。随后测量污渍去除指数(sri)(如通过比较未洗涤的l*a*b*值与洗涤的l*a*b*值所测量)以便对洗涤剂组合物的污渍去除性能进行定量。还通过计算((实例c或实例d的性能-对比实例a的性能)除以(对比实例b的性能-对比实例a的性能)乘以100)来度量性能指数。iv.样品的比较表6：5种污渍(每种污渍8个重复)的平均sri表7：cs-29木薯淀粉(8个重复)的性能指数通过比较用实例a的组合物(存在nil酶)洗涤的样品与用实例b(含有natalase)、c和d(分别含有变体1和2)洗涤的样品，显而易见的是污渍去除性能因添加淀粉酶而改善。根据作为参考的实例a(nil酶)，通过比较用实例b的组合物(含有natalase)洗涤的样品与用实例c和d(分别含有变体1和2)洗涤的样品，显而易见的是本发明的变体1和2两者都能够实现比显著更高的污渍去除水平。实例3液体洗涤剂中的淀粉酶变体的全规模洗衣机性能评价i.洗涤剂试验组合物的制备在这个实验中，基于以上液体洗涤剂实例1b制备了四种试验组合物。从实例1b制备洗涤剂基料，它不含酶并且将其调节至ph8.2。制备了以下四种制剂：表8：*作为活性酶蛋白添加由丹麦鲍斯韦诺维信a/s作为‘natalase200l’供应。4变体3是野生型淀粉酶芽孢杆菌sp722seqidno:1的本发明的淀粉酶变体，其具有以下两个缺失d183*+g184*并且包含置换w140y、n195f、v206y、y243f、e260g和g477e。还称作sp722+d183*+g184*+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+g477e5变体4是野生型淀粉酶芽孢杆菌sp722seqidno:1的本发明淀粉酶的变体，其具有以下两个缺失d183*+g184*并且包含置换g109a、w140y、n195f、v206y、y243f和e260g。还称作sp722+d183*+g184*+g109a+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g。ii.试验织物三种淀粉酶敏感性污渍：pcs-28米淀粉、ps-28米淀粉和cs-26玉米淀粉(5cmx5cm)(由荷兰试验材料中心供应的)被附着至20cmx20cm白色针织棉布(由英国达勒姆warwickequest供应)。两种淀粉酶敏感性污渍：bbq酱汁和巧克力布丁婴儿食品(直径2.5cm)被附着至20cmx20cm白色针织棉布(由英国达勒姆warwickequest供应)。将8个重复(2个重复，跨4台不同的机器)用于每种试验制剂。表9：iii.试验洗涤程序该方法涉及使用北美洲kenmore洗衣机型号600系列。使用如上文所述的试验制剂在添加如上文所述的混合污垢和清洁压载物荷载的情况下洗涤淀粉酶敏感性污渍。含有0.78g/l试验制剂、6°克拉克水硬度的64l水外加试验织物及压载物的洗衣机在15℃以12分钟超级洗涤和一次漂洗进行洗涤。在洗涤之后，将试验织物在室内挂干。将洗涤过程重复另外3个洗涤循环。随后测量污渍去除指数(如通过比较未洗涤的l*a*b*值与洗涤的l*a*b*值所测量)以便对洗涤剂组合物的污渍去除性能进行定量。还通过计算((实例c或实例d的性能-对比实例a的性能)除以(对比实例b的性能-对比实例a的性能)乘以100)来度量性能指数。iv.样品的比较表10：5种污渍(每种污渍8个重复)的平均sri表11：cs-26玉米淀粉(8个重复)的性能指数实例性能指数对比实例a--对比实例b100根据本发明的实例c221根据本发明的实例d238通过比较用实例a的组合物(存在nil酶)洗涤的样品与用实例b(含有natalase)、c和d(分别含有变体3和4)洗涤的样品，显而易见的是污渍去除性能因添加淀粉酶而改善。根据作为参考的实例a(nil酶)，通过比较用实例b的组合物(含有natalase)洗涤的样品与用实例c和d(分别含有变体3和4)洗涤的样品，显而易见的是本发明的变体3和4两者都能够实现比显著更高的污渍去除水平。实例4液体洗涤剂中的淀粉酶变体的全规模洗衣机性能评价i.洗涤剂试验组合物的制备在这个实验中，基于以下液体洗涤剂制剂4a制备了四种试验组合物。从制剂4a制备了洗涤剂基料，它不含酶并且将其调节至ph8.2。表12；制剂4a：重垢液体衣物洗涤剂组合物1无规接枝共聚物是具有聚环氧乙烷主链和多个聚乙酸乙烯酯侧链的聚乙酸乙烯酯接枝聚环氧乙烷共聚物。聚环氧乙烷主链的分子量是大约6000并且聚环氧乙烷对聚乙酸乙烯酯的重量比是大约40至60，并且每50个环氧乙烷单元不多于1个接枝点。制备了以下七种洗涤剂制剂：表13：*作为活性酶蛋白添加是由丹麦鲍斯韦诺维信a/s作为‘natalase200l’供应的酶。2变体5是野生型淀粉酶芽孢杆菌sp722seqidno:1的本发明的淀粉酶变体，其具有以下两个缺失d183*+g184*并且包含置换g109a、w140y、n195f、v206y、y243f、e260g和g476e。还称作sp722+d183*+g184*+g109a+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+g476e。3变体6是野生型淀粉酶芽孢杆菌sp722seqidno:1的本发明的淀粉酶变体，其具有以下两个缺失d183*+g184*并且包含置换t51i、g109a、w140y、n195f、v206y、y243f、e260g和w439r。还称作sp722+d183*+g184*+t51i+g109a+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+w439r。4变体7是野生型淀粉酶芽孢杆菌sp722seqidno:1的本发明的淀粉酶变体，其具有以下两个缺失d183*+g184*并且包含置换t51i、s52q、n54k、g109a、w140y、n195f、v206y、y243f、e260g和g476e。还称作sp722+d183*+g184*+t51i+s52q+n54k+g109a+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+g476e。5变体8是野生型淀粉酶芽孢杆菌sp722seqidno:1的本发明的淀粉酶变体，其具有以下两个缺失d183*+g184*并且包含置换w140y、n195f、v206y、y243f、e260g、g304r和g476k。还称作sp722+d183*+g184*+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+g304r+g476k。6变体9是野生型淀粉酶芽孢杆菌sp722seqidno:1的本发明的淀粉酶变体，其具有以下两个缺失d183*+g184*并且包含置换w140y、n195f、v206y、y243f、e260g、w284r和g477k。还称作sp722+d183*+g184*+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+w284r+g477k。ii.试验织物三种淀粉酶敏感性污渍：pcs-28米淀粉、cs-128熟化米淀粉和cs-26玉米淀粉(5cmx5cm)(由荷兰试验材料中心供应的)被附着至20cmx20cm白色针织棉布(由英国达勒姆warwickequest供应)。两种淀粉酶敏感性污渍：墨西哥辣肉酱(chilliconcarne)和heinz意大利面条(直径2.5cm)被附着至20cmx20cm白色针织棉布(由英国达勒姆warwickequest供应)。将8个重复(2个重复，跨4台不同的机器)用于每种试验制剂。表14iii.试验洗涤程序该方法涉及使用西欧hotpoint洗衣机，型号aquariuswf541。使用如上文所述的试验制剂在添加如上文所述的混合污垢和清洁压载物荷载的情况下洗涤淀粉酶敏感性污渍。含有6g/l试验制剂、在10°的克拉克硬度的13l水外加试验织物及压载物的洗衣机在15℃以持续1小时和15分钟的快速棉制品洗涤周期进行洗涤。在洗涤之后，将试验织物在室内挂干。将洗涤过程重复另外3个洗涤循环。随后测量污渍去除指数(sri)(如通过比较未洗涤的l*a*b*值与洗涤的l*a*b*值所测量)以便对洗涤剂组合物的污渍去除性能进行定量。还通过计算((实例c、d、e、f或g的性能-对比实例a的性能)除以(对比实例b的性能-对比实例a的性能)乘以100)来度量性能指数。iv.样品的比较表15：5种污渍(每种污渍8个重复)的平均sri表16：墨西哥辣肉酱(8个重复)的性能指数实例性能指数对比实例a--对比实例b100根据本发明的实例c169根据本发明的实例d145根据本发明的实例e181本发明的实例f178根据本发明的实例g188通过比较用实例a的组合物(存在nil酶)洗涤的样品与用实例b(含有natalase)、c、d、e、f和g(分别含有变体5、6、7、8和9)洗涤的样品，显而易见的是，污渍去除性能因添加淀粉酶而改善。根据作为参考的实例a(nil酶)，通过比较用实例b的组合物(含有natalase)洗涤的样品与用实例c、d、e、f和g(分别含有变体5、6、7、8和9)洗涤的样品，显而易见的是本发明的变体5、6、7、8和9能够实现比显著更高的污渍去除水平。实例5液体洗涤剂中的淀粉酶变体的全规模洗衣机性能评价i.洗涤剂试验组合物的制备在这个实验中，基于液体洗涤剂制剂5a制备了四种试验组合物。从制剂5a制备洗涤剂基料，它不含酶并且将其调节至ph8.2。表17：5a重垢液体衣物洗涤剂组合物的配制制剂5a(wt％)烷基乙氧基1.8硫酸钠14.81烷基苯磺酸钠3.53支链烷基硫酸盐2.44c12-18烷基-1.5-9-乙氧基化物0.88c12二甲胺氧化物0.56柠檬酸2.05c12-18脂肪酸1.48乙氧基化聚乙烯亚胺21.51膦酸化螯合剂0.53光亮剂0.19两性烷氧基化聚合物31.25少量：染料、香料、酶、酶稳定剂、溶剂、结构剂、ph调节剂平衡物2具有20个乙氧基化物基团/-nh的聚乙烯亚胺(mw＝600)。3两性烷氧基化聚合物是从经衍生以含有24个乙氧基化物基团/-nh和具有16个丙氧基化物基团/-nh的聚合物所制备的聚乙烯亚胺(mw600)。表18制备了以下六种制剂：*作为活性酶蛋白添加由丹麦鲍斯韦诺维信a/s作为‘natalase200l’供应。2变体7是野生型淀粉酶芽孢杆菌sp722seqidno:1的本发明的淀粉酶变体，其具有以下两个缺失d183*+g184*并且包含置换t51i、s52q、n54k、g109a、w140y、n195f、v206y、y243f、e260g和g476e。还称作sp722+d183*+g184*+t51i+s52q+n54k+g109a+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+g476e。3变体8是野生型淀粉酶芽孢杆菌sp722seqidno:1的本发明的淀粉酶变体，其具有以下两个缺失d183*+g184*并且包含置换w140y、n195f、v206y、y243f、e260g、g304r和g476k。还称作sp722+d183*+g184*+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+g304r+g476k。4变体9是野生型淀粉酶芽孢杆菌sp722seqidno:1的本发明的淀粉酶变体，其具有以下两个缺失d183*+g184*并且包含置换w140y、n195f、v206y、y243f、e260g、w284r和g477k。还称作sp722+d183*+g184*+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+w284r+g477k。5变体10是野生型淀粉酶芽孢杆菌sp722seqidno:1的本发明的淀粉酶变体，其具有以下两个缺失d183*+g184*并且包含置换w140y、n195f、v206y、y243f、e260g、w284f和g477r。还称作sp722+d183*+g184*+w140y+n195f+v206y+y243f+e260g+w284f+g477r。ii.试验织物三种淀粉酶敏感性污渍：pcs-28米淀粉、ps-28米淀粉和cs-29木薯淀粉(5cmx5cm)(由荷兰试验材料中心供应)被附着至20cmx20cm白色针织棉布(由英国达勒姆warwickequest供应)。一种淀粉酶敏感性污渍：heinz意大利面条(直径2.5cm)被附着至20cmx20cm白色针织棉布(由英国达勒姆warwickequest供应)。一种淀粉酶敏感性污渍：肉汁(直径2.5cm)被附着至25cmx24cmcm白色针织棉布(由美国俄亥俄州费尔菲尔德accurateproductdevelopment供应)。将8个重复(2个重复，4台不同的机器)用于每种试验制剂。表19iii.试验洗涤程序该方法涉及使用北美洲kenmore洗衣机型号600系列。使用如上文所述的试验制剂在添加如上文所述的混合污垢和清洁压载物荷载的情况下洗涤淀粉酶敏感性污渍。含有0.78g/l试验制剂、6°克拉克水硬度的64l水外加试验织物及压载物的洗衣机在15℃以12分钟超级洗涤和一次漂洗进行洗涤。在洗涤之后，将试验织物在室内挂干。将洗涤过程重复另外3个洗涤周期。随后测量污渍去除指数(如通过比较未洗涤的l*a*b*值与洗涤的l*a*b*值所测量)以便对洗涤剂组合物的污渍去除性能进行定量。还通过计算((实例c、d、e或f的性能-对比实例a的性能)除以(对比实例b的性能-对比实例a的性能)乘以100)来度量性能指数。iv.样品的比较表20：5种污渍(每种污渍8个重复)的平均sri表21：heinz意大利面条(8个重复)的性能指数实例性能指数对比实例a--对比实例b100根据本发明的实例c266根据本发明的实例d256根据本发明的实例e284根据本发明的实例f416通过比较用实例a的组合物(存在nil酶)洗涤的样品与用实例b(含有natalase)、c、d、e和f(分别含有变体7、8、9和10)洗涤的样品，显而易见的是，污渍去除性能因添加淀粉酶而改善。根据作为参考的对比实例a(nil酶)，通过比较用实例b的组合物(含有natalase)洗涤的样品与用实例c、d、e和f(分别含有变体7、8、9和10)洗涤的样品，显而易见的是，本发明的变体7、8、9和10能够实现比显著更高的污渍去除水平。在此描述和要求保护的发明在范围上不受在此披露的具体方面限制，因为这些方面旨在说明本发明的若干方面。任何等同方面预期处于本发明的范围之内。实际上，除了在此显示和说明的那些修改之外，本发明的各种修改将因前述说明而对本领域的技术人员变得清楚。这样的修改也预期落入所附权利要求书的范围之内。在发生冲突的情况下，以包括定义在内的本披露为准。序列表<110>诺维信公司(novozymesa/s)<120>α-淀粉酶变体<130>12183-wo-pcd<160>12<170>patentin版本3.5<210>1<211>485<212>prt<213>芽孢杆菌物种<400>1hishisasnglythrasnglythrmetmetglntyrpheglutrphis151015leuproasnaspglyasnhistrpasnargleuargaspaspalaser202530asnleuargasnargglyilethralailetrpileproproalatrp354045lysglythrserglnasnaspvalglytyrglyalatyraspleutyr505560aspleuglyglupheasnglnlysglythrvalargthrlystyrgly65707580thrargserglnleugluseralailehisalaleulysasnasngly859095valglnvaltyrglyaspvalvalmetasnhislysglyglyalaasp100105110alathrgluasnvalleualavalgluvalasnproasnasnargasn115120125glngluileserglyasptyrthrileglualatrpthrlyspheasp130135140pheproglyargglyasnthrtyrseraspphelystrpargtrptyr145150155160hispheaspglyvalasptrpaspglnserargglnpheglnasnarg165170175iletyrlyspheargglyaspglylysalatrpasptrpgluvalasp180185190sergluasnglyasntyrasptyrleumettyralaaspvalaspmet195200205asphisprogluvalvalasngluleuargargtrpglyglutrptyr210215220thrasnthrleuasnleuaspglypheargileaspalavallyshis225230235240ilelystyrserphethrargasptrpleuthrhisvalargasnala245250255thrglylysglumetphealavalalagluphetrplysasnaspleu260265270glyalaleugluasntyrleuasnlysthrasntrpasnhisserval275280285pheaspvalproleuhistyrasnleutyrasnalaserasnsergly290295300glyasntyraspmetalalysleuleuasnglythrvalvalglnlys305310315320hispromethisalavalthrphevalaspasnhisaspserglnpro325330335glygluserleugluserphevalglnglutrpphelysproleuala340345350tyralaleuileleuthrarggluglnglytyrproservalphetyr355360365glyasptyrtyrglyileprothrhisservalproalametlysala370375380lysileaspproileleuglualaargglnasnphealatyrglythr385390395400glnhisasptyrpheasphishisasnileileglytrpthrargglu405410415glyasnthrthrhisproasnserglyleualathrilemetserasp420425430glyproglyglyglulystrpmettyrvalglyglnasnlysalagly435440445glnvaltrphisaspilethrglyasnlysproglythrvalthrile450455460asnalaaspglytrpalaasnpheservalasnglyglyservalser465470475480iletrpvallysarg485<210>2<211>485<212>prt<213>芽孢杆菌物种<400>2hishisasnglythrasnglythrmetmetglntyrpheglutrptyr151015leuproasnaspglyasnhistrpasnargleuasnseraspalaser202530asnleulysserlysglyilethralavaltrpileproproalatrp354045lysglyalaserglnasnaspvalglytyrglyalatyraspleutyr505560aspleuglyglupheasnglnlysglythrvalargthrlystyrgly65707580thrargserglnleuglnalaalavalthrserleulysasnasngly859095ileglnvaltyrglyaspvalvalmetasnhislysglyglyalaasp100105110alathrglumetvalargalavalgluvalasnproasnasnargasn115120125glngluvalthrglyglutyrthrileglualatrpthrargpheasp130135140pheproglyargglyasnthrhisserserphelystrpargtrptyr145150155160hispheaspglyvalasptrpaspglnserargargleuasnasnarg165170175iletyrlyspheargglyhisglylysalatrpasptrpgluvalasp180185190thrgluasnglyasntyrasptyrleumettyralaaspileaspmet195200205asphisprogluvalvalasngluleuargasntrpglyvaltrptyr210215220thrasnthrleuglyleuaspglypheargileaspalavallyshis225230235240ilelystyrserphethrargasptrpileasnhisvalargserala245250255thrglylysasnmetphealavalalagluphetrplysasnaspleu260265270glyalailegluasntyrleuglnlysthrasntrpasnhisserval275280285pheaspvalproleuhistyrasnleutyrasnalaserlyssergly290295300glyasntyraspmetargasnilepheasnglythrvalvalglnarg305310315320hisproserhisalavalthrphevalaspasnhisaspserglnpro325330335gluglualaleugluserphevalgluglutrpphelysproleuala340345350tyralaleuthrleuthrarggluglnglytyrproservalphetyr355360365glyasptyrtyrglyileprothrhisglyvalproalametargser370375380lysileaspproileleuglualaargglnlystyralatyrglylys385390395400glnasnasptyrleuasphishisasnileileglytrpthrargglu405410415glyasnthralahisproasnserglyleualathrilemetserasp420425430glyalaglyglyserlystrpmetphevalglyargasnlysalagly435440445glnvaltrpseraspilethrglyasnargthrglythrvalthrile450455460asnalaaspglytrpglyasnpheservalasnglyglyservalser465470475480iletrpvalasnlys485<210>3<211>485<212>prt<213>芽孢杆菌物种<400>3hishisasnglythrasnglythrmetmetglntyrpheglutrptyr151015leuproasnaspglyasnhistrpasnargleuargseraspalaser202530asnleulysasplysglyileseralavaltrpileproproalatrp354045lysglyalaserglnasnaspvalglytyrglyalatyraspleutyr505560aspleuglyglupheasnglnlysglythrileargthrlystyrgly65707580thrargasnglnleuglnalaalavalasnalaleulysserasngly859095ileglnvaltyrglyaspvalvalmetasnhislysglyglyalaasp100105110alathrglumetvalargalavalgluvalasnproasnasnargasn115120125glngluvalserglyglutyrthrileglualatrpthrlyspheasp130135140pheproglyargglyasnthrhisserasnphelystrpargtrptyr145150155160hispheaspglyvalasptrpaspglnserarglysleuasnasnarg165170175iletyrlyspheargglyaspglylysglytrpasptrpgluvalasp180185190thrgluasnglyasntyrasptyrleumettyralaaspileaspmet195200205asphisprogluvalvalasngluleuargasntrpglyvaltrptyr210215220thrasnthrleuglyleuaspglypheargileaspalavallyshis225230235240ilelystyrserphethrargasptrpileasnhisvalargserala245250255thrglylysasnmetphealavalalagluphetrplysasnaspleu260265270glyalailegluasntyrleuasnlysthrasntrpasnhisserval275280285pheaspvalproleuhistyrasnleutyrasnalaserlyssergly290295300glyasntyraspmetargglnilepheasnglythrvalvalglnarg305310315320hispromethisalavalthrphevalaspasnhisaspserglnpro325330335gluglualaleugluserphevalgluglutrpphelysproleuala340345350tyralaleuthrleuthrarggluglnglytyrproservalphetyr355360365glyasptyrtyrglyileprothrhisglyvalproalametlysser370375380lysileaspproileleuglualaargglnlystyralatyrglyarg385390395400glnasnasptyrleuasphishisasnileileglytrpthrargglu405410415glyasnthralahisproasnserglyleualathrilemetserasp420425430glyalaglyglyasnlystrpmetphevalglyargasnlysalagly435440445glnvaltrpthraspilethrglyasnargalaglythrvalthrile450455460asnalaaspglytrpglyasnpheservalasnglyglyservalser465470475480iletrpvalasnlys485<210>4<211>485<212>prt<213>芽孢杆菌物种<400>4hishisasnglythrasnglythrmetmetglntyrpheglutrptyr151015leuproasnaspglyasnhistrpasnargleuargaspaspalaala202530asnleulysserlysglyilethralavaltrpileproproalatrp354045lysglythrserglnasnaspvalglytyrglyalatyraspleutyr505560aspleuglyglupheasnglnlysglythrvalargthrlystyrgly65707580thrargasnglnleuglnalaalavalthrserleulysasnasngly859095ileglnvaltyrglyaspvalvalmetasnhislysglyglyalaasp100105110glythrgluilevalasnalavalgluvalasnargserasnargasn115120125glngluthrserglyglutyralaileglualatrpthrlyspheasp130135140pheproglyargglyasnasnhisser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