蓝色犁头霉中甾类11β-羟化酶及其编码基因与应用的制作方法

本发明涉及基因工程领域，具体涉及蓝色犁头霉中甾类11β-羟化酶及其编码基因与应用。
背景技术：
氢化可的松(hydrocortisone，hc)化学名为11β,17α,21-三羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮，是肾上腺糖皮质激素药物，在激素类药物中占与重要地位，其结构式如图1中所示。hc能够影响糖代谢，具有抗病毒、消炎、抗过敏及抗休克等作用[dumas,b.,etal.,hydrocortisonemadeinyeast:metabolicengineeringturnsaunicellularmicroorganismintoadrug-synthesizingfactory.biotechnolj,2006.1(3):299-307.]。主要用于肾上腺皮质功能不全引起的疾病及先天性肾上腺皮质功能增生等症状的治疗，也可用于支气管哮喘、类风湿性关节炎、痛风、风湿性发热等炎症性及过敏性疾病的治疗，还可以用于严重性感染和抗休克治疗等。hc的合成方法主要分为三类：全化学合成法、半合成法及全生物合成的方法[colingsworth,d.r.,etal."apartialmicrobiologicalsynthesisofhydrocortisone."journalofbiologicalchemistry203.2(1953):807.]。1950年，wendler等用化学全合成的方法经30多步化学反应成功合成hc，但因其工艺复杂，总收率太低，而无工业生产价值。dumas等[szczebara,f.m.,etal.,totalbiosynthesisofhydrocortisonefromasimplecarbonsourceinyeast.natbiotechnol,2003.21(2):143-149.]在酿酒酵母中使用人来源的11位β羟基化p450(cyp11b1)实现以葡萄糖为唯一碳源生物法全合成氢化可的松，但由于合成途径复杂，产物得率较低也并没有实现工业化生产。目前国内外制备hc等甾体药物依然主要采用半合成的方法，即以薯蓣皂素或植物甾醇等前体通过化学合成获得药物中间体17α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(cortexolone-21-acetate,rsa)或11-脱氧皮质醇(11-deoxycortisol，rs)，然后通过犁头霉菌(absidiaorchidis)和新月弯孢霉(curvularialunata)等微生物的生物全细胞催化反应对其11位进行β羟基化反应获得hc[kim,y.h.,etal.,synthesisofα-ketoglutarateusingglutamatedehydrogenasecombinedwithelectrochemicalcofactorregenerationsystem.journalofbioscienceandbioengineering,2009.108:s45-s46.manosroi,j.,y.chisti,anda.manosroi,biotransformationofcortexolonetohydrocortisonebymoldsusingarapidcolor-developmentassay.appliedbiochemistryandmicrobiology,2006.42(5):479-483.]。氢化可的松合成工艺见图2。蓝色犁头霉(absidiacoerulea)属藻状菌纲毛霉目毛霉科。从上世纪60年代捷克首次使用蓝色犁头霉催化生产hc开始，我国近几十年在工业上普遍使用蓝色犁头霉作为工业化生产菌株进行hc的生产。而近几十年我国学者从菌种选育到发酵工艺上不断进行探索与研究，努力提高发酵生产hc的产率。2004年张宝全等[zhang,b.,effectofsupercriticalfluidsonc11-hydroxylationactivityofabsidiacoerulea.biotechnolprog,2004.20:1885-1887.]使用超临界流体作为催化介质提高了底物rsa溶解度和11位β羟基化产物的得率。范志华等[范志华,孙爱友,郝建东,等.用海藻酸钙包埋法固定化蓝色梨头霉菌生产氢化可的松的初步研究[j].天津科技大学学报,2003,18(4):1-4.]以海藻酸钙固定化蓝色犁头霉细胞进行有机相催化rsa合成hc显著提高了产物中hc与表hc的比值以及hc的产率。虽然蓝色犁头霉氢化可的松半合成工艺已经有了几十年的研究，但目前存在的一个重要问题是rsa到hc的转化率比较低，hc的得率只有50％左右。合成产物除了hc之外，还有大量的表氢化可的松，这主要有两个原因。一是蓝色犁头霉中存在多个p450蛋白，除了11-β羟基化p450蛋白催化合成hc外，其他p450蛋白会催化合成副产物。二是11-β羟基化p450蛋白催化的手性专一性不高，该蛋白除了在11位进行β羟基化反应合成hc之外，还能在11位进行α羟基化反应合成表氢化可的松。因此，从蓝色犁头霉中挖掘出11-β羟基化p450蛋白有重要意义。技术实现要素：本发明的目的是提供一种蓝色犁头霉中甾类11β-羟化酶及其编码基因与应用。第一方面，本发明要求保护如下蛋白质或成套蛋白质。本发明所提供的蛋白质为如下(a1)-(a4)中任一所示的蛋白质：(a1)至少含有seqidno.1的第19-527位氨基酸序列，并且从seqidno.1的第19位开始按照seqidno.1的氨基酸序列向seqidno.1的n端延长，得到长度为509-526位氨基酸的任意一个蛋白质；(a2)将(a1)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；(a3)与(a1)或(a2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；(a4)在(a1)-(a3)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白。本发明所提供的成套蛋白质由蛋白质a和蛋白质b组成。所述蛋白质a为如上(a1)-(a4)中任一所示的蛋白质或者氨基酸序列如seqidno.1所示的蛋白质(其中，seqidno.1所示的蛋白质为全长ac-cyp003蛋白)。所述蛋白质b为如下(b1)-(b4)中任一所示的蛋白质：(b1)氨基酸序列如seqidno.2所示的蛋白质(其中，seqidno.2所示的蛋白质为全长ac-cpr蛋白)；(b2)将(b1)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；(b3)与(b1)或(b2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；(b4)在(b1)-(b3)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白。进一步地，所述(a1)所示的蛋白质具体为氨基酸序列如seqidno.1的第19-527位所示的蛋白质(即截短后的ac-cyp003蛋白——ac-cyp003-t1蛋白)。第二方面，本发明要求保护核酸分子或成套核酸分子。本发明所提供的核酸分子可为核酸分子1或核酸分子2。所述核酸分子1为编码前文第一方面中所述蛋白质的核酸分子(包括优化和非优化的编码截短后的ac-cyp003蛋白的核酸分子)。所述核酸分子2为seqidno.3所示的dna分子(即优化后的编码ac-cyp003全长蛋白的dna分子)。本发明所提供的成套核酸分子由核酸分子a和核酸分子b组成。所述核酸分子a为编码前文第一方面中所述蛋白质a的核酸分子(包括优化和非优化的编码截短和非截短的ac-cyp003蛋白的核酸分子)；所述核酸分子b为编码前文第一方面中所述蛋白质b的核酸分子(包括优化和非优化的编码ac-cpr蛋白的核酸分子)。进一步地，所述核酸分子1具体可为如下(a1)-(a4)中任一所示的dna分子：(a1)至少含有seqidno.3的第55-1584位核苷酸序列，并且从seqidno.3的第55位开始按照seqidno.3的核苷酸序列向seqidno.3的5′端延长，得到长度为1530至1583bp的任意一个dna分子；(a2)至少含有seqidno.5的第55-1584位核苷酸序列，并且从seqidno.5的第55位开始按照seqidno.5的核苷酸序列向seqidno.5的5′端延长，得到长度为1530至1583bp的任意一个dna分子；(a3)在严格条件下与(a1)或(a2)限定的dna分子杂交且编码前文第一方面中所述(a1)-(a4)中任一所示的蛋白质的dna分子；(a4)与(a1)-(a3)中任一所限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码前文第一方面中所述(a1)-(a4)中任一所示的蛋白质的dna分子。进一步地，所述核酸分子a具体可为如上(a1)-(a4)中任一所示的dna分子或者核苷酸序列如seqidno.3或seqidno.5所示的dna分子(其中，seqidno.3为优化的全长ac-cyp003蛋白的编码基因，seqidno.5为非优化的全长ac-cyp003蛋白的编码基因)。进一步地，所述核酸分子b具体可为如下(b1)-(b3)中任一所示的dna分子：(b1)核苷酸序列如seqidno.4或seqidno.6所示的dna分子(其中，seqidno.4为优化的全长ac-cpr蛋白的编码基因，seqidno.6为非优化的全长ac-cpr蛋白的编码基因)；(b2)在严格条件下与(b1)限定的dna分子杂交且编码前文第一方面中所述蛋白质b的dna分子；(b3)与(b1)或(b2)所限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码前文第一方面中所述蛋白质b的dna分子。其中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(sds)、0.5mnapo4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，2×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mnapo4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，1×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mnapo4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mnapo4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mnapo4和1mmedta的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×ssc，0.1％sds中漂洗；也可为：在6×ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。更进一步地，所述(a1)所示的dna分子具体可为核苷酸序列如seqidno.3的第55-1584位所示的dna分子(即优化后的ac-cyp003-t1蛋白的编码基因)。所述(a2)所示的dna分子具体为核苷酸序列如seqidno.5的第55-1584位所示的dna分子(即未优化的ac-cyp003-t1蛋白的编码基因)。第三方面，本发明要求保护如下生物材料中的任一种：(c1)重组载体，为含有前文第二方面中所述核酸分子的重组载体；(c2)表达盒，为含有前文第二方面中所述核酸分子的表达盒；(c3)转基因细胞系，为含有前文第二方面中所述核酸分子的转基因细胞系；(c4)重组菌，为含有前文第二方面中所述核酸分子的重组菌；(c5)成套重组载体，由重组载体a和重组载体b组成；所述重组载体a为含有前文第二方面中所述核酸分子a的重组载体；所述重组载体b为含有前文第二方面中所述核酸分子b的重组载体；(c6)成套表达盒，由表达盒a和表达盒b组成；所述表达盒a为含有前文第二方面中所述核酸分子a的表达盒；所述表达盒b为含有前文第二方面中所述核酸分子b的表达盒；(c7)成套转基因细胞系，由转基因细胞系a和转基因细胞系b组成；所述转基因细胞系a为含有前文第二方面中所述核酸分子a的转基因细胞系；所述转基因细胞系b为含有前文第二方面中所述核酸分子b的转基因细胞系；(c8)成套重组菌，由重组菌a和重组菌b组成；所述重组菌a为含有前文第二方面中所述核酸分子a的重组菌；所述重组菌b为含有前文第二方面中所述核酸分子b的重组菌。第四方面，本发明要求保护一种制备用于生产氢化可的松的工程菌的方法。本发明所提供的制备用于生产氢化可的松的工程菌的方法，可包括如下步骤：对酵母菌进行改造，使其表达前文第一方面中所述的蛋白质或成套蛋白质，改造后的酵母菌即为用于生产氢化可的松的工程菌。进一步地，所述方法可包括如下步骤：将前文第二方面中所述核酸分子或所述成套核酸分子导入所述酵母菌，得到表达前文第一方面中所述的蛋白质或所述成套蛋白质的重组酵母菌，即为所述工程菌。更进一步地，所述核酸分子是通过前文第三方面中所述重组载体或所述重组表达盒的形式导入所述酵母菌中的；所述成套核酸分子是通过前文第三方面中所述成套重组载体或所述成套表达盒的形式导入所述酵母菌中的。更进一步地，所述核酸分子或所述成套核酸分子被整合到所述酵母菌的基因组的常用位点，如gal7位点或者rdna位点处。更进一步地，所述酵母菌可为酿酒酵母(如by4742菌株)、解脂耶氏酵母(如po1g菌株)，粟酒裂殖酵母(如cicc1762菌株)或毕赤酵母(如gs115菌株)等。在本发明的一个具体实施方式中，所述核酸分子是通过重组载体的形式导入所述酵母菌中的；所述重组载体为将所述核酸分子插入到prs426质粒的酶切位点(如sexa1和asc1)之间后得到的重组质粒。在本发明的另一个具体实施方式中，所述成套核酸分子是通过成套表达盒的形式导入所述酵母菌中的；所述成套表达盒由表达盒ppgk-cpr-adht和表达盒ptef-cyp003-cyc1t组成；所述表达盒ppgk-cpr-adht的序列为seqidno.7(或者为将seqidno.7的第813-2864位所替换为seqidno.4后所得的序列)；所述表达盒ptef-cyp003-cyc1t的序列为seqidno.8(或者为将seqidno.8的第501-2084位替换为seqidno.3或seqidno.3的第55-1584位或seqidno.5的第55-1584位后所得的序列)。当向所述酵母菌中导入所述表达盒ppgk-cpr-adht和表达盒ptef-cyp003-cyc1t的同时，还导入了同源臂marker片段gal7-ura3-up和同源臂marker片段gal7-ura3-down(实现了整合于酿酒酵母by4742的gal7位点)；所述同源臂marker片段gal7-ura3-up的序列如seqidno.9所示；所述同源臂marker片段gal7-ura3-down的序列如seqidno.10所示。在本发明的再一个具体实施方式中，所述成套核酸分子是通过成套表达盒的形式导入所述酵母菌中的；所述成套表达盒由所述表达盒ppgk-cpr-adht和所述表达盒ptef-cyp003-cyc1t组成。当向所述酵母菌中导入所述表达盒ppgk-cpr-adht和表达盒ptef-cyp003-cyc1t的同时，还导入了同源臂marker片段rdna-leu-up和同源臂marker片段rdna-leu-down(实现了整合于酿酒酵母by4742的rdna位点)；所述同源臂marker片段rdna-leu-up的序列如seqidno.11所示；所述同源臂marker片段rdna-leu-down的序列如seqidno.12所示。第五方面，本发明要求保护利用前文第四方面中所述方法制备得到的工程菌。在本发明的具体实施方式中，所述工程菌具体为如下任一种：(1)工程菌hc001：将重组载体prs426-cyp003导入酿酒酵母by4742菌株后得到的重组菌；所述重组载体prs426-cyp003为将seqidno.5所示的dna片段(即未优化的全长ac-cyp003基因)插入到prs426质粒的酶切位点sexa1和asc1之间后得到的重组质粒。(2)工程菌hc002：将所述表达盒ppgk-cpr-adh1t(其中的ac-cpr基因为非优化基因，如seqidno.6所示)、所述表达盒ptef-cyp003-cyc1t(其中的ac-cyp003基因为非优化基因，如seqidno.5所示)、所述同源臂marker片段gal7-ura3-up和所述同源臂marker片段gal7-ura3-down导入酿酒酵母by4742菌株后得到的重组菌(实现了整合于酿酒酵母by4742的gal7位点)。(3)工程菌hc023：将所述表达盒ppgk-cpr-adh1t(其中的ac-cpr基因为优化基因，如seqidno.4所示)、所述表达盒ptef-cyp003-cyc1t(其中的ac-cyp003基因为优化基因，如seqidno.3所示)、所述同源臂marker片段gal7-ura3-up和所述同源臂marker片段gal7-ura3-down导入酿酒酵母by4742菌株后得到的重组菌(实现了整合于酿酒酵母by4742的gal7位点)。(4)工程菌hc030：将所述表达盒ppgk-cpr-adh1t(其中的ac-cpr基因为优化基因，如seqidno.4所示)、所述表达盒ptef-cyp003-cyc1t(其中的ac-cyp003基因为优化的ac-cyp003-t1基因，如seqidno.3的第55-1584位所示)、所述同源臂marker片段gal7-ura3-up和所述同源臂marker片段gal7-ura3-down导入酿酒酵母by4742菌株后得到的重组菌(实现了整合于酿酒酵母by4742的gal7位点)。第六方面，本发明要求保护前文第一方面中所述的蛋白质或成套蛋白质或前文第二方面中所述的核酸分子或成套核酸分子或前文第三方面中所述的生物材料或前文第五方面中所述的工程菌在如下任一中的应用：(a)制备氢化可的松；(b)催化甾体激素类物质进行11位β羟基化。另外，本发明还要求保护前文第一方面中所述的蛋白质在作为甾体激素类物质11位羟基化酶中的应用。其中，所述甾体激素类物质可为能够被甾类11β-羟化酶催化生成氢化可的松的物质，具体如7α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(或称为去氧氢化可的松21-醋酸酯，cortexolone-21-acetate,rsa)或11-脱氧皮质醇(11-deoxycortisol，rs)。第七方面，本发明要求保护一种制备氢化可的松的方法。本发明所提供的制备氢化可的松的方法，可为全细胞催化法或酶法。其中，所述全细胞催化法可包括如下步骤：对前文第五方面中所述的工程菌进行发酵培养，收集菌体后加入底物，进行催化反应，反应产物中即含有氢化可的松；所述底物为能够被甾类11β-羟化酶催化生成氢化可的松的物质。其中，所述酶法可包括如下步骤：从前文第五方面中所述的工程菌中提取具有甾类11β-羟化酶活性的物质，然后以粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶的形式催化底物生成氢化可的松；所述底物为能够被甾类11β-羟化酶催化生成氢化可的松的物质。进一步地，所述底物具体可为17α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(或称为去氧氢化可的松21-醋酸酯，cortexolone-21-acetate,rsa)或11-脱氧皮质醇(11-deoxycortisol，rs)。在本发明具体实施方式中，具体是采用的全细胞催化法。其中，所述催化反应的条件具体为30℃200-250rpm(如250rpm)振荡培养1-4天(如2天)；反应体系中的底物为rsa，其浓度为10mg-200mg(如170mg/l)。实验证明，本发明在异源微生物中表达ac-cyp003蛋白进行hc的催化合成，避免其他副产物的生成，提高了rsa到hc的转化率。本发明为应用更安全的酵母菌催化生产氢化可的松提供可能性，相比于传统的丝状真菌生产方式有效的缩短了生产周期，简化了发酵设备，并且能够进行单一蛋白的表达提高了产物转化率，有效的降低了生产和提取成本，对于氢化可的松生产技术革新具有重要意义。附图说明图1为氢化可的松的结构式。图2为氢化可的松生产工艺。图3为酿酒酵母工程菌hc001催化产物检测及鉴定。图4为酿酒酵母工程菌hc002催化产物检测及鉴定。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。蓝色犁头霉：北纳生物产品。prs426质粒：上海北诺生物有限公司，货号为addgene0499。m2质粒：在peasy-blunt-simple载体(全式金生物有限公司)的多克隆位点按顺序插入了sexa1酶切位点，ppgk启动子，绿色荧光蛋白(gfp)基因，以及终止子adh1t和asc1酶切位点。m3质粒：在peasy-blunt-simple载体(全式金生物有限公司)的多克隆位点按顺序插入了sexa1酶切位点，ptef启动子，绿色荧光蛋白(gfp)基因，以及终止子cyc1t和asc1酶切位点。酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)by4742：thermofisher公司产品。解脂耶氏酵母(cicc32520)：中国工业微生物菌种保藏管理中心(cicc)产品。粟酒裂殖酵母(cicc1762)：中国工业微生物菌种保藏管理中心(cicc)产品。毕赤酵母(gs115)：优宝生物产品，产品编号：st1030。实施例1、蓝色犁头霉细胞色素还原酶和11位β-羟基化酶的克隆表达基因的克隆表达分为以下3步：1、蓝色犁头霉总rna的提取首先，将蓝色犁头霉在平板上培养数天，并收取一定数目的孢子接入到50ml马铃薯-葡萄糖(pda)培养基中，过夜培养至合成大量菌体；随后，离心收集蓝色犁头霉菌丝体，使用磷酸钾盐缓冲液(pbs)进行洗涤，最后用50ml缓冲液重悬并加入终浓度为170mg/l的底物去氧氢化可的松21-醋酸酯(rsa)诱导1h，取样进行rna提取。rna提取方法：(1)2.0ml螺帽管(rnasefree)中加入0.5mm的研磨珠(填满锥形管底)以及1mltrizol，之后加入液氮速冻过的菌丝块(约100mg)。(2)使用珠磨机(beadbeater)最大转速30s，重复两次。(3)室温温和的摇动5min，去除附着的核小体。(4)加入0.2ml的氯仿，最大转速珠磨15s。(5)室温温和的摇动2min。(6)4℃下12000g离心15min，取上清液(约0.5ml)至新的ep管(rnasefree)中。(7)加入等体积(0.5ml)的异丙醇，充分混匀。(8)室温温和的摇动10min，此时可见白色沉淀。(9)4℃下12000g离心10min，去上清。(10)1mldepc水配置的75％酒精洗涤沉淀，4℃下7500g离心5min，充分去除上清。(11)室温放置约15-20min除去乙醇，晾置过久rna会变得难溶。(12)加入50μldepc水，60℃水浴10min助溶。(13)nanodrop测定rna浓度和纯度。通常纯度较好的rna样品a260/a280比值在1.9～2.0之间，a260/a230通常大于2。2、反转录pcr与基因扩增第一链反转录-pcr：取无rna酶pcr管，按thermo反转录试剂盒扩增得到cdna。具体操作步骤如下：模板总rna3μl，oligo(dt)18引物1μl，10mmdntpmix1μl，rnase-free水10μl。瞬间离心，pcr65℃5min，冰上急冷；再加入以下体系中反应液：5×rtbuffer4μl，maximahminusenzymemix1μl，瞬间离心，pcr仪中进行反应50℃50min，85℃5min，4℃保温。pcr扩增：反转录所得cdna为模板，用下述引物扩增到目的基因，扩增体系为takaradna聚合酶5×buffer10μl，dntpmix4μl，引物(见表1)各1μl，cdna，模板0.5μl，primerstarhs聚合酶(2.5u/μl)0.5μl，补加蒸馏水至总体积50μl。扩增条件为98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、56℃退火15秒、72℃延伸2分钟(30个循环)；72℃延伸8分钟(1个循环)。所得扩增产物命名为ac-cyp003，ac-cpr。将得到的pcr扩增产物用上海生工生物工程有限公司的pcr产物纯化试剂盒纯化，纯化后用thermo公司的sexa1与asc1酶切dna片段，胶回收产物备用。表1ac-cyp003和ac-cpr基因扩增引物引物名称序列(5’-3’)ac-cyp003-sexa1-fgcgaccaggtatgcttacagagtacattcatac-cyp003-asc1-rggcgcgccttactttcttggcacaatcttgaac-cpr-sexa1-fgcgaccaggtatggatctccctacagcaactgaac-cpr-asc1-rggcgcgccctatgcccacacgtcttccacatac-cyp003基因(野生型)序列如seqidno.5所示，编码seqidno.1所示的蛋白质(命名为ac-cyp003蛋白)；ac-cpr基因(野生型)序列如seqidno.6所示，编码seqidno.2所示的蛋白质(命名为ac-cpr蛋白)。3、构建基因表达质粒用thermo公司sexa1和asc1酶切质粒prs426，酶切产物胶回收备用。与上述所得ac-cyp003基因片段各50ng加入连接体系：5μl2×quickligationbuffer(neb公司)、0.5μlquickligase(neb公司，400,000cohesiveendunits/ml)，补充蒸馏水至10μl，室温反应10min得到连接产物，转入trans1-t1感受态细胞中冰浴30分钟，42℃热激30秒，立即至于冰上2分钟。加入800μllb培养基，250rpm，37℃孵育1小时，菌液涂在含有氨苄青霉素的lb平板上，过夜培养后，pcr筛选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体prs426上插入目的片段，得到质粒prs426-cyp003。4、构建酵母多基因整合片段用thermo公司sexa1和asc1酶切质粒m2，m3，酶切产物胶回收备用。与上述所得ac-cpr，ac-cyp003基因片段进行连接转化(方法同步骤3)，并挑选克隆测序验证，得到质粒m2-cpr，m3-cyp003。以构建好的质粒m2-cpr为模板使用引物1-m-peasy-pgk1-f和1-m-adht-tef1-r(见表2)进行pcr扩增(方法同步骤2)，获得ppgk-ac-cpr-adh1t片段(seqidno.7)，该片段包含pgk启动子(seqidno.7的第63-812位)，蓝色犁头霉来源的ac-cpr基因(seqidno.7的第813-2864位)以及adh1终止子(seqidno.7的第2865-3022位)。以构建好的质粒m3-cyp003为模板使用引物2-m-adht-tef1-f和m-cyc1t-peasy-r(见表2)进行pcr扩增(方法同步骤2)，获得ptef-ac-cyp003-cyc1t片段(seqidno.8)，该片段包含tef启动子(seqidno.8的第51-500位)，蓝色犁头霉来源的ac-cyp003基因(seqidno.8的第501-2084位)以及cyc1终止子(seqidno.8的第2085-2391位)。对扩增获得的目的片段进行胶回收处理备用。表2ac-cyp003和ac-cpr基因整合片段扩增引物实施例2、酿酒酵母工程菌hc001的构建出发菌酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)by4742于筛选培养基中过夜培养。液体筛选培养基组成如下：sd-trp(北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司)，2％葡萄糖，0.005％his.，0.01％leu.，0.01％ura.(各百分号均表示g/100ml)。取1ml(od约0.6-1.0)分装到1.5mlep管中，4℃、10000g离心1min，弃上清，沉淀用无菌水(4℃)洗涤，同样条件下离心，弃上清。菌体加入1ml处理液(10mmliac；10mmdtt；0.6m山梨醇；10mmtris-hcl(ph7.5)，处理液使用时才加dtt)，25℃下放置20min。离心，弃上清，菌体中加入1ml1m山梨醇(0.22μm水系膜过膜除菌)重悬，离心，弃上清(用1m山梨醇重悬二次)，到最终体积约为90μl。加入实施例1获得的表达质粒prs426-cyp0031.5μl，混匀后转移至电转杯中，2.7kv电击5.7ms，加入1ml1m山梨醇，30℃复苏1h，涂布于固体筛选培养基(配方：酵母选择培养基sd-ura-trp，2％葡萄糖，0.005％his.，0.01％leu，1.5％琼脂；各百分号均表示g/100ml)。筛选培养的条件为：30℃，培养36h以上。pcr鉴定出正确的阳性克隆，命名为菌株hc001。实施例3、酿酒酵母工程菌hc001催化合成氢化可的松摇瓶发酵催化：在固体选择培养基(配方：固体酵母筛选培养基sd-ura-trp，2％葡萄糖，0.005％his，0.01％leu，1.5％琼脂；各百分号均表示g/100ml)中活化hc101酵母菌株，于相应液体选择培养基(配方：液体酵母筛选培养基sd-ura-trp，2％葡萄糖，0.005％his，0.01％leu；各百分号均表示g/100ml)中制备种子液(30℃，250rpm，16h)，以1ml的接种量分别接种于3瓶含100mlypd液体培养基的500ml三角瓶中，30℃，250rpm振荡培养2天，5000rpm收集酵母细胞，并用pbs缓冲液洗涤最终重悬于含有30mlpbs的250ml三角瓶中，加入终浓度为170mg/l的底物rsa，进行催化反应，30℃，250rpm振荡培养2天。取5ml的催化反应液于分液漏斗中，加入等体积的萃取剂(甲醇：氯仿＝1:9，体积比)，取下层有机相4ml，装入10ml离心管中干燥，用1ml甲醇溶液进行复溶，离心取上清过0.22μm有机滤膜至液相瓶中进行hplc检测。通过安捷伦1260高效液相色谱仪(hplc)分析产物，发现有两种新物质的生成(见图3)。通过与标准品的色谱图对比确认新获得的这两种新物质分别为表氢化可的松和氢化可的松(见图3)，因此得出结论，ac-cyp003蛋白为甾体激素类物质11位羟基化酶，并且该基因可以同时进行11位α和β的羟基化。实施例4、酿酒酵母工程菌hc002的构建出发菌酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)by4742于筛选培养基中过夜培养。筛选培养基组成如下：sd-trp(北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司)，2％葡萄糖，0.005％his.，0.01％leu.，0.01％ura.(各百分号均表示g/100ml)。取1ml(od约0.6-1.0)分装到1.5mlep管中，4℃、10000g离心1min，弃上清，沉淀用无菌水(4℃)洗涤，同样条件下离心，弃上清。菌体加入1ml处理液(10mmliac；10mmdtt；0.6m山梨醇；10mmtris-hcl(ph7.5)，处理液使用时才加dtt)，25℃下放置20min。离心，弃上清，菌体中加入1ml1m山梨醇(0.22μm水系膜过膜除菌)重悬，离心，弃上清(用1m山梨醇重悬二次)，到最终体积约为90μl。分别加入实施例1获得的片段ppgk-ac-cpr-adh1t，ptef-ac-cyp003-cyc1t以及同源臂marker片段gal7-ura3-up(seqidno.9；该同源臂片段包含gal7位点上游400bp同源区域，ura3marker基因，以及pgk启动子400bp同源区域)，gal7-ura3-down(seqidno.10；该同源臂片段包含cyc1终止子200bp同源区域，以及gal7位点下游300bp同源区域)(实现将ac-cpr，ac-cyp003基因片段整合于酿酒酵母by4742的gal7位点)各1μl，混匀后转移至电转杯中，2.7kv电击5.6ms，加入1ml1m山梨醇，30℃复苏1h，涂布于筛选培养基平板(配方：0.8％酵母选择培养基sd-ura-trp，2％葡萄糖，0.005％his.，0.01％leu.，1.5％琼脂；各百分号均表示g/100ml)。筛选培养的条件为：30℃，培养36h以上。pcr鉴定出正确的阳性克隆，命名为菌株hc002。实施例5、酿酒酵母工程菌hc002催化合成氢化可的松(全细胞催化法)摇瓶发酵催化：在固体选择培养基(同实施例3)中活化hc002酵母菌株，于相应液体选择培养基(同实施例3)中制备种子液(30℃，250rpm，16h)，以1ml的接种量分别接种于3瓶含100mlypd液体培养基的500ml三角瓶中，30℃，250rpm振荡培养2天，5000rpm收集酵母细胞，并用pbs缓冲液洗涤最终重悬于含有30mlpbs的250ml三角瓶中，使菌体od600nm达到60，加入终浓度为170mg/l的底物rsa，进行催化反应，30℃，250rpm振荡培养2天，得催化反应液。取5ml的催化反应液于分液漏斗中，加入等体积的萃取剂(甲醇：氯仿＝1:9，体积比)，取下层有机相4ml，装入10ml离心管中干燥，用1ml甲醇溶液进行复溶，离心取上清过0.22μm有机滤膜至液相瓶中进行hplc检测。通过安捷伦1260高效液相色谱仪(hplc)分析产物。通过hplc鉴定与标品对比，确认构建的酿酒酵母菌株hc002可以催化底物rsa合成两种物质，确认分别为氢化可的松和表氢化可的松，并且从峰面积推测其产量高于hc001菌株(图4)，所以推测从蓝色犁头霉中克隆的cpr基因对于酿酒酵母氢化可的松的生产有帮助。随后，对hc002菌株的生产结果进行了定量分析，通过定量分析菌株hc002可以通过全细胞催化的方式获得目标产物氢化可的松3.15mg/l，表氢化可的松1.01mg/l相较于使用酿酒酵母hc001菌株产量提高了3倍(表3)，结果表明蓝色犁头霉中克隆的cpr基因对于酿酒酵母氢化可的松的生产有帮助。表3菌株hc001与hc002催化产物定量分析注：氢化可的松/表氢化可的松的单位mg/l的含义是每升催化反应液中氢化可的松/表氢化可的松的mg数。实施例6、酿酒酵母工程菌hc023的构建与催化合成氢化可的松1、酿酒酵母工程菌hc023的构建对ac-cyp003和ac-cpr蛋白进行密码子优化，该优化与基因合成工作工作委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成，获得的优化后的基因命名为ac-cyp003-sy-sc，ac-cpr-sy-sc。ac-cyp003-sy-sc基因的序列如seqidno.3所示，编码seqidno.1所示的蛋白质；ac-cpr-sy-sc基因的序列如seqidno.4所示，编码seqidno.2所示的蛋白质。对获得的基因按照实施例1步骤4中的方法构建酿酒酵母多基因整合片段，随后按照实施例4中的方法将上述两个基因整合于酿酒酵母by4742的gal7位点，最终获得菌株hc023。2、酿酒酵母工程菌hc023催化合成氢化可的松(全细胞催化法)对构建的酿酒酵母菌株hc023进行催化合成氢化可的松，催化实验和样品检测方法同实施例5，通过催化发酵，hc023菌株可以合成18.4mg/l氢化可的松和5.6mg/l表氢化可的松，发酵结果见表4。表4菌株hc023催化产物定量分析注：氢化可的松/表氢化可的松的单位mg/l的含义是每升催化反应液中氢化可的松/表氢化可的松的mg数。实施例7、应用截短的cyp003蛋白的酿酒酵母工程菌株hc030的构建与催化合成氢化可的松1、酿酒酵母工程菌株hc030的构建根据本发明挖掘到的ac-cyp003基因，由于该基因前部分存在有多于一个的起始密码子，所以尝试对该基因进行截短，获得的截短后的基因命名为ac-cyp003-t1。ac-cyp003-t1-sy-sc基因(即优化后的ac-cyp003基因截短体)的序列如seqidno.3的第55-1584所示，编码seqidno.1的第19-527位所示的蛋白质(命名为ac-cyp003-t1蛋白)。对获得的基因按照实施例1步骤4中的方法构建酿酒酵母多基因整合片段，随后按照实施例4中的方法将上述ac-cyp003-t1-sy-sc基因与原有的ac-cpr-sy-sc基因(seqidno.4)整合于酿酒酵母by4742的gal7位点，最终获得菌株hc030。2、酿酒酵母工程菌hc030催化合成氢化可的松(全细胞催化法)对构建的酿酒酵母菌株hc030进行催化合成氢化可的松，催化实验和样品检测方法同实施例5，通过催化发酵，hc030菌株可以合成氢化可的松和表氢化可的松，结果表明截短的ac-cyp003蛋白，依然可以催化c11位β羟基化反应，催化底物rsa合成氢化可的松，并且产量略高于未截短的ac-cyp003蛋白，发酵结果见表5。表5菌株hc030催化产物定量分析注：氢化可的松/表氢化可的松的单位mg/l的含义是每升催化反应液中氢化可的松/表氢化可的松的mg数。3、利用酿酒酵母工程菌hc030以粗酶液或纯酶法催化合成氢化可的松第一步：蛋白的提取(下述反应都在4℃冰上进行)(1)发酵培养，200ml对应的选择培养基，发酵48h后收集菌体，od600nm4.0左右；(2)菌体收集(5000rpm离心5min，弃上清)，细胞破碎(应用液氮研磨菌体破碎细胞，磨三次，将研磨好的粗蛋白用1mlph7.25的磷酸盐缓冲液重悬，并置于冰上)作为粗酶液备后续使用；(3)如需纯化蛋白则要增加微粒体提取过程，过程如下：a、将重悬好的酵母粗酶液以7000g离心10min，收集上清，然后沉淀用5mltes-bbuffer(表6)洗一次，重复上述步骤一次；b、将收集的上清分装在超速离心管中，超速离心25000g/10min；c、取离心后的上清，在分装在超速离心管中100000g离心1h；d、吸净上清，获得的沉淀用tegbuffer(表6)1-2ml重悬，若重悬效果不好，可以去冰水浴中超声，作为纯酶液备后续使用。表6tes-b缓冲液和teg缓冲液配方:tes-b终浓度teg终浓度tris-hclph7.450mmoltris-hclph7.450mmoledta1mmoledta1mmolsorbitol600mmolglycerol20/30％bsa10g/l水β-巯基乙醇1.5mmol水第二步：催化反应合成hc粗酶液或纯酶催化合成hc：催化体系总体积2ml(表7)；反应在30℃进行，摇床上70rpm缓慢摇，以nadph的加入起始反应，相应萃取剂甲醇氯仿的加入终止反应，得到催化反应液。表7粗酶液或纯酶催化合成hc的催化体系催化体系终浓度rsa0.2μmol磷酸盐缓冲液ph7.25100mmolnadph1mmol粗酶液或纯酶第三步：催化产物萃取及检测取2ml的催化反应液于分液漏斗中，加入等体积的萃取剂(甲醇：氯仿＝1:9，体积比)，取下层有机相2ml，装入5ml离心管中干燥，用1ml甲醇溶液进行复溶，离心取上清过0.22μm有机滤膜至液相瓶中进行hplc检测。通过安捷伦1260高效液相色谱仪(hplc)分析产物。结果显示：通过上述在工程菌hc030中提取的蛋白粗酶液或纯酶并进行催化反应，同样在产物中成功检测到了氢化可的松和表氢化可的松两种产物，所以证明粗酶液或纯酶也可以进行催化生产hc。实施例8、在酿酒酵母中进行人源cyp11b1蛋白的功能验证1、应用人源cyp11b1以及adx、adr蛋白构建用于合成氢化可的松的酿酒酵母工程菌hc040在之前的酿酒酵母合成氢化可的松研究中学者们普遍使用的是人来源的11位β羟基化p450，它具有产物专一性强的优点。所以，在本发明中同样对来自人的cyp11b1蛋白进行功能验证，分别通过密码子优化合成了牛来源的电子传递链蛋白adx、adr以及人源p450蛋白cyp11b1的编码基因(hm-cyp11b1优化后基因序列如seqidno.13所示；bo-adx优化后基因序列如seqidno.14所示；bo-adr优化后基因序列如seqidno.15所示)。并按照实施例1步骤4中的方法构建酿酒酵母多基因整合片段ppgk-bo-adx-adh1t，ptdh3-bo-adr-tpi1t，ptef-hm-cyp11b1-cyc1t随后按照实施例4中的方法将上述基因进行酿酒酵母by4742染色体整合，整合至gal7位点，最终获得菌株hc040。2、酿酒酵母菌株hc040催化合成氢化可的松对构建的酿酒酵母菌株hc040进行催化合成氢化可的松，催化实验和样品检测方法同实施例5，通过催化发酵，hc040菌株可以合成氢化可的松这一唯一产物，但产量较低(见表8)。所以相比于目前已经鉴定出的人源cyp11b1蛋白催化底物合成氢化可的松，本发明鉴定出的蓝色犁头霉来源的ac-cyp003蛋白具有更高的催化效率，但产物并不专一，说明蛋白立体选择性存在问题。表8不同来源的p450蛋白催化合成氢化可的松产物分析注：氢化可的松/表氢化可的松的单位mg/l的含义是每升催化反应液中氢化可的松/表氢化可的松的mg数。实施例9、酿酒酵母工程菌hc023催化合成氢化可的松的5l发酵罐发酵本发明对构建的菌株hc023进行了5l发酵罐的发酵，通过高密度培养，进一步提升了菌株的催化能力，具体发酵流程如下：(1)由-80℃冰箱取出保存菌株的冻存管约1.5ml，置于冰上融化，全部接到含有30ml种子培养基的250ml三角瓶中，30℃，250rpm培养约20小时，至od600nm＝5～7，即为一级种子。(2)将一级种子接到装有100ml种子培养基的1l三角瓶中，接种量3％，共接5瓶。30℃，250rpm培养约20小时，至od600nm＝5～7，即为二级种子。(3)将二级种子通过火焰接种方式接到7l发酵罐中培养(接种量5％(v/v))。温度设定30℃，ph设定5.0，通过流加氨水(25wt.％)自动调节ph，溶氧设定30％，通过调节转速和通气量使溶氧维持在30％。当底料中的葡萄糖耗尽时，溶氧迅速升高，此时开始流加补料培养基1，采用do-stat的补料方式。培养至59小时od＝200左右改用补料培养基2继续培养(补料培养基2中含有4.5g/lrsa(rsa加入方式：将1grsa加入30ml80％乙醇，加热至完全溶解，然后迅速转入发酵罐中)。当培养至59、83、100小时加入1grsa，培养至143小时发酵结束。其中，高密度发酵中用到的培养基成分如表9所示(微量金属盐和维他命母液成分如表10所示)。表9高密度发酵中用到的培养基成分表10微量金属盐和维他命母液成分发酵结束后氢化可的松产量为1.23mm(0.44g/l)，共消耗底物rsa约3.68mm，转化率约为33.4％。见表11。表11高密度发酵氢化可的松产量注：氢化可的松/表氢化可的松的单位mmol/l的含义是每升发酵液(143小时发酵结束时的发酵液)中氢化可的松/表氢化可的松的mmol数。实施例10、应用蓝色犁头霉的11位β羟基化p450蛋白在其他酵母菌中合成氢化可的松本发明成功在解脂耶氏酵母(cicc32520)，粟酒裂殖酵母(cicc1762)，以及毕赤酵母(gs115)中成功以质粒表达的形式表达了来自蓝色犁头霉的ac-cpr和ac-cyp003基因，对获得的菌株(见表12)以脱氧皮质醇(rs)为底物进行催化反应(同实施例5)，也成功合成出了氢化可的松及其副产物表氢化可的松。表12其他酵母菌中发酵催化合成氢化可的松的产量实施例11、酿酒酵母工程菌hc061-hc065的构建与催化合成氢化可的松为了进一步提高氢化可的松的产量，本发明将蓝色犁头霉中挖掘到的ac-cpr和ac-cyp003整合于酿酒酵母by4742的多拷贝位点rdna位点。出发菌酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)by4742于筛选培养基中过夜培养。筛选培养基组成如下：sd-trp(北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司)，2％葡萄糖，0.005％his.，0.01％leu.，0.01％ura.(各百分号均表示g/100ml)。取1ml(od约0.6-1.0)分装到1.5mlep管中，4℃、10000g离心1min，弃上清，沉淀用无菌水(4℃)洗涤，同样条件下离心，弃上清。菌体加入1ml处理液(10mmliac；10mmdtt；0.6m山梨醇；10mmtris-hcl(ph7.5)，处理液使用时才加dtt)，25℃下放置20min。离心，弃上清，菌体中加入1ml1m山梨醇(0.22μm水系膜过膜除菌)重悬，离心，弃上清(用1m山梨醇重悬二次)，到最终体积约为90μl。分别加入实施例1获得的片段ppgk-cl3-cpr-adht，ptef-cl3-cyp021-cyc1t以及同源臂marker片段rdna-leu-up(seqidno.11；该同源臂片段包含rdna位点上游约500bp同源区域，leumarker基因，以及pgk启动子400bp同源区域)，rdna-leu-down(seqidno.12；该同源臂片段包含cyc1终止子200bp同源区域，以及rdna位点下游约500bp同源区域)(实现将ac-cpr，ac-cyp003基因片段整合于酿酒酵母by4742的rdna位点)各1μl，混匀后转移至电转杯中，2.7kv电击5.6ms，加入1ml1m山梨醇，30℃复苏1h，涂布于固体选择培养基平板(配方：固体酵母筛选培养基sd-leu-trp，2％葡萄糖，0.005％his，0.01％ura，1.5％琼脂；各百分号均表示g/100ml)。筛选培养的条件为：30℃，培养36h以上。pcr鉴定出正确的阳性克隆，随机挑选五个克隆，分别命名为菌株hc061、hc062、hc063、hc064、hc065。其中产量最高的菌株hc064的氢化可的松产量可以达到25.7mg/l。<110>中国科学院天津工业生物技术研究所<120>蓝色犁头霉中甾类11β-羟化酶及其编码基因与应用<130>gncln181612<160>15<170>patentinversion3.5<210>1<211>527<212>prt<213>absidiacoerulea<400>1metleuthrglutyrilehishispheileasnasnpheaspglnlys151015lysthrmetaspglnleuglnthrmetvalserserlysgluglymet202530ileglyleualathralaalavalleumetserglyalaalavaltyr354045lysserthrargilegluargglycysproglnvalproasnglnser505560tyrphemetglyserthrlysglutyrargasnasnproalaalaphe65707580ileglulystrpglulysgluleuglyprovaltyrglyalatyrleu859095pheglyglntyrthrthrvalvalserglyproglnvalarggluval100105110pheleuasnaspasppheasppheilealaglyileargargaspphe115120125aspthrasnleuleuserasnglyglyaspleuargaspleuproval130135140hislysphealaglyserilelyslysasnleuserprolysleupro145150155160phetyrthrserargvalilegluhisleulysileglyleulysglu165170175phecysglyvalvalproaspgluglylysglupheasphisvaltyr180185190proleuvalglnhismetvalalalysalaseralaservalpheval195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