新月弯胞霉中甾类11β-羟化酶及其编码基因与应用的制作方法

本发明涉及基因工程领域，具体涉及新月弯胞霉中甾类11β-羟化酶及其编码基因与应用。
背景技术：
氢化可的松(hydrocortisone，hc)化学名为11β,17α,21-三羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮，是肾上腺糖皮质激素药物，在激素类药物中占与重要地位，其结构式如图1中所示。hc能够影响糖代谢，具有抗病毒、消炎、抗过敏及抗休克等作用[dumas,b.,etal.,hydrocortisonemadeinyeast:metabolicengineeringturnsaunicellularmicroorganismintoadrug-synthesizingfactory.biotechnolj,2006.1(3):299-307.]。主要用于肾上腺皮质功能不全引起的疾病及先天性肾上腺皮质功能增生等症状的治疗，也可用于支气管哮喘、类风湿性关节炎、痛风、风湿性发热等炎症性及过敏性疾病的治疗，还可以用于严重性感染和抗休克治疗等。hc的合成方法主要分为三类：全化学合成法、半合成法及全生物合成的方法[colingsworth,d.r.,etal."apartialmicrobiologicalsynthesisofhydrocortisone."journalofbiologicalchemistry203.2(1953):807.]。1950年，wendler等用化学全合成的方法经30多步化学反应成功合成hc，但因其工艺复杂，总收率太低，而无工业生产价值。dumas等[szczebara,f.m.,etal.,totalbiosynthesisofhydrocortisonefromasimplecarbonsourceinyeast.natbiotechnol,2003.21(2):143-149.]在酿酒酵母中使用人来源的11位β羟基化p450(cyp11b1)实现以葡萄糖为唯一碳源生物法全合成氢化可的松，但由于合成途径复杂，产物得率较低也并没有实现工业化生产。目前国内外制备hc等甾体药物依然主要采用半合成的方法，即以薯蓣皂素或植物甾醇等前体通过化学合成获得药物中间体17α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(cortexolone-21-acetate,rsa)或11-脱氧皮质醇(11-deoxycortisol，rs)，然后通过犁头霉菌(absidiaorchidis)和新月弯孢霉(curvularialunata)等微生物的生物全细胞催化反应对其11位进行β羟基化反应获得hc[kim,y.h.,etal.,synthesisofα-ketoglutarateusingglutamatedehydrogenasecombinedwithelectrochemicalcofactorregenerationsystem.journalofbioscienceandbioengineering,2009.108:s45-s46.manosroi,j.,y.chisti,anda.manosroi,biotransformationofcortexolonetohydrocortisonebymoldsusingarapidcolor-developmentassay.appliedbiochemistryandmicrobiology,2006.42(5):479-483.]。氢化可的松合成工艺见图2。新月弯孢霉(curvularialunata)属于半知菌类，丛梗孢目，暗梗孢科，多孢亚科，弯孢霉属。该微生物具备11位β羟基化功能，并广泛被国内外学者使用。日本学者kenzisuzuki等[suzuki,k.,etal.,purificationandpropertiesofcytochromep-450(p-450lun)catalyzingsteroid11beta-hydroxylationincurvularialunata.biochimbiophysacta,1993.1203(2):215-223.]在新月弯孢霉中以rs为底物诱导p450蛋白表达纯化出了11位β羟基化的p450蛋白，并认为该蛋白是一个兼具11位β羟基化和14位α羟基化的双功能酶。lu等[lu,w.,etal.,optimisationofhydrocortisoneproductionbycurvularialunata.appliedbiochemistryandbiotechnology,2007.142(1):17-28.]通过诱变筛选酮康唑抗性突变株获得的新月弯孢霉ka91较出发菌株cl114相比hc的转化率提高了40％。新月弯孢霉对底物rs的转化速率要优于rsa。但是该菌除了可专一性引入c11β羟基，但也会伴有c14α羟基副产物生成。德国先灵公司(scheringag)借助c17α乙酰化合物，通过立体结构阻碍c14α羟基副产物生成，使氢化可的松收率达到70％左右。但是经过多年的研究学者们并没有成功挖掘到氢化可的松合成过程中最关键的底物11位β羟基化p450，所以该蛋白的成功挖掘对氢化可的松合成的研究有重要意义。技术实现要素：本发明的目的是提供一种新月弯胞霉中甾类11β-羟化酶及其编码基因与应用。第一方面，本发明要求保护如下蛋白质或成套蛋白质。本发明所提供的蛋白质为如下(a1)-(a4)中任一所示的蛋白质：(a1)氨基酸序列如seqidno.1所示的蛋白质(其中，seqidno.1所示的蛋白质为cl3-cyp021蛋白)；(a2)将(a1)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；(a3)与(a1)或(a2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；(a4)在(a1)-(a3)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白。本发明所提供的成套蛋白质由蛋白质a和蛋白质b组成。所述蛋白质a为如上(a1)-(a4)中任一所示的蛋白质。所述蛋白质b为如下(b1)-(b4)中任一所示的蛋白质：(b1)氨基酸序列如seqidno.2所示的蛋白质(其中，seqidno.2所示的蛋白质为cl3-cpr蛋白)；(b2)将(b1)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；(b3)与(b1)或(b2)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；(b4)在(b1)-(b3)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白。第二方面，本发明要求保护核酸分子或成套核酸分子。本发明所提供的核酸分子可为编码前文第一方面中所述蛋白质的核酸分子(包括优化和非优化的编码cl3-cyp021蛋白的核酸分子)。本发明所提供的成套核酸分子由核酸分子a和核酸分子b组成。所述核酸分子a为编码前文第一方面中所述蛋白质a的核酸分子(包括优化和非优化的编码cl3-cyp021蛋白的核酸分子)；所述核酸分子b为编码前文第一方面中所述蛋白质b的核酸分子(包括优化和非优化的编码cl3-cpr蛋白的核酸分子)。进一步地，所述核酸分子具体可为如下(a1)-(a3)中任一所示的dna分子：(a1)核苷酸序列如seqidno.3或seqidno.5所示的dna分子(其中，seqidno.3为优化的cl3-cyp021蛋白的编码基因，seqidno.5为非优化的cl3-cyp021的编码基因)；(a2)在严格条件下与(a1)限定的dna分子杂交且编码前文第一方面中所述(a1)-(a4)中任一所示的蛋白质的dna分子；(a3)与(a1)或(a2)所限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码前文第一方面中所述(a1)-(a4)中任一所示的蛋白质的dna分子。进一步地，所述核酸分子a具体可为如上(a1)-(a3)中任一所示的dna分子。进一步地，所述核酸分子b具体可为如下(b1)-(b3)中任一所示的dna分子：(b1)核苷酸序列如seqidno.4或seqidno.6所示的dna分子(其中，seqidno.4为优化的cl3-cpr蛋白的编码基因，seqidno.6为非优化的cl3-cpr的编码基因)；(b2)在严格条件下与(b1)限定的dna分子杂交且编码前文第一方面中所述蛋白质b的dna分子；(b3)与(b1)或(b2)所限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码前文第一方面中所述蛋白质b的dna分子。其中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(sds)、0.5mnapo4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，2×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mnapo4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，1×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mnapo4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mnapo4和1mmedta的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mnapo4和1mmedta的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×ssc，0.1％sds中漂洗；也可为：在6×ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。第三方面，本发明要求保护如下生物材料中的任一种：(c1)重组载体，为含有前文第二方面中所述核酸分子的重组载体；(c2)表达盒，为含有前文第二方面中所述核酸分子的表达盒；(c3)转基因细胞系，为含有前文第二方面中所述核酸分子的转基因细胞系；(c4)重组菌，为含有前文第二方面中所述核酸分子的重组菌；(c5)成套重组载体，由重组载体a和重组载体b组成；所述重组载体a为含有前文第二方面中所述核酸分子a的重组载体；所述重组载体b为含有前文第二方面中所述核酸分子b的重组载体；(c6)成套表达盒，由表达盒a和表达盒b组成；所述表达盒a为含有前文第二方面中所述核酸分子a的表达盒；所述表达盒b为含有前文第二方面中所述核酸分子b的表达盒；(c7)成套转基因细胞系，由转基因细胞系a和转基因细胞系b组成；所述转基因细胞系a为含有前文第二方面中所述核酸分子a的转基因细胞系；所述转基因细胞系b为含有前文第二方面中所述核酸分子b的转基因细胞系；(c8)成套重组菌，由重组菌a和重组菌b组成；所述重组菌a为含有前文第二方面中所述核酸分子a的重组菌；所述重组菌b为含有前文第二方面中所述核酸分子b的重组菌。第四方面，本发明要求保护一种构建用于生产氢化可的松和/或14α-羟化皮质醇的工程菌的方法。本发明所提供的构建用于生产氢化可的松和/或14α-羟化皮质醇的工程菌的方法，可包括如下步骤：对酵母菌进行改造，使其表达前文第一方面中所述的蛋白质或成套蛋白质，改造后的酵母菌即为用于生产氢化可的松和/或14α-羟化皮质醇的工程菌。进一步地，所述方法可包括如下步骤：将前文第二方面中所述核酸分子或所述成套核酸分子导入所述酵母菌，得到表达前文第一方面中所述的蛋白质或所述成套蛋白质的重组酵母菌，即为所述工程菌。更进一步地，所述核酸分子是通过前文第三方面中所述重组载体或所述重组表达盒的形式导入所述酵母菌中的；所述成套核酸分子是通过前文第三方面中所述成套重组载体或所述成套表达盒的形式导入所述酵母菌中的。更进一步地，所述核酸分子或所述成套核酸分子被整合到所述酵母菌的基因组的常用位点，如gal7位点或者rdna位点处。更进一步地，所述酵母菌可为酿酒酵母(如by4742菌株)、解脂耶氏酵母(如po1g菌株)，粟酒裂殖酵母(如cicc1762菌株)或毕赤酵母(如gs115菌株)等。在本发明的一个具体实施方式中，所述核酸分子是通过重组载体的形式导入所述酵母菌中的；所述重组载体为将所述核酸分子插入到prs426质粒的酶切位点(如sexa1和asc1)之间后得到的重组质粒。在本发明的另一个具体实施方式中，所述成套核酸分子是通过成套表达盒的形式导入所述酵母菌中的；所述成套表达盒由表达盒ppgk-cl3-cpr-adht和表达盒ptef-cl3-cyp021-cyc1t组成；所述表达盒ppgk-cl3-cpr-adht的序列为seqidno.7(或者为将seqidno.7的第813-2903位所替换为seqidno.4后所得的序列)；所述表达盒ptef-cl3-cyp021-cyc1t的序列为seqidno.8(或者为将seqidno.8的第501-2021位替换为seqidno.3后所得的序列)。当向所述酵母菌中导入所述表达盒ppgk-cl3-cpr-adht和表达盒ptef-cl3-cyp021-cyc1t的同时，还导入了同源臂marker片段gal7-ura3-up和同源臂marker片段gal7-ura3-down(实现了整合于酿酒酵母by4742的gal7位点)；所述同源臂marker片段gal7-ura3-up的序列如seqidno.9所示；所述同源臂marker片段gal7-ura3-down的序列如seqidno.10所示。在本发明的再一个具体实施方式中，所述成套核酸分子是通过成套表达盒的形式导入所述酵母菌中的；所述成套表达盒由所述表达盒ppgk-cl3-cpr-adht和所述表达盒ptef-cl3-cyp021-cyc1t组成。当向所述酵母菌中导入所述表达盒ppgk-cl3-cpr-adht和所述表达盒ptef-cl3-cyp021-cyc1t的同时，还导入了同源臂marker片段rdna-leu-up和同源臂marker片段rdna-leu-down(实现了整合于酿酒酵母by4742的rdna位点)；所述同源臂marker片段rdna-leu-up的序列如seqidno.11所示；所述同源臂marker片段rdna-leu-down的序列如seqidno.12所示。第五方面，本发明要求保护利用前文第四方面中所述方法制备得到的工程菌。在本发明的具体实施方式中，所述工程菌具体为如下任一种：(1)工程菌hc101：将重组载体prs426-cl3-cyp021导入酿酒酵母by4742菌株后得到的重组菌；所述重组载体prs426-cl3-cyp021为将seqidno.5所示的dna片段(即未优化的cl3-cyp021基因)插入到prs426质粒的酶切位点sexa1和asc1之间后得到的重组质粒。(2)工程菌hc102：将所述表达盒ppgk-cl3-cpr-adht(其中的cl3-cpr基因为非优化基因，如seqidno.6所示)、所述表达盒ptef-cl3-cyp021-cyc1t(其中的cl3-cyp021基因为非优化基因，如seqidno.5所示)、所述同源臂marker片段gal7-ura3-up和所述同源臂marker片段gal7-ura3-down导入酿酒酵母by4742菌株后得到的重组菌(实现了整合于酿酒酵母by4742的gal7位点)。(3)工程菌hc103：将所述表达盒ppgk-cl3-cpr-adht(其中的cl3-cpr基因为优化基因，如seqidno.4所示)、所述表达盒ptef-cl3-cyp021-cyc1t(其中的cl3-cyp021基因为优化基因，如seqidno.3所示)、所述同源臂marker片段gal7-ura3-up和所述同源臂marker片段gal7-ura3-down导入酿酒酵母by-4741菌株后得到的重组菌(实现了整合于酿酒酵母by4742的gal7位点)。第六方面，本发明要求保护前文第一方面中所述的蛋白质或成套蛋白质或前文第二方面中所述的核酸分子或成套核酸分子或前文第三方面中所述的生物材料或前文第五方面中所述的工程菌在如下任一中的应用：(a)制备氢化可的松和/或14α-羟化皮质醇；(b)催化甾体激素类物质进行11位β羟基化和/或14位α羟基化。另外，本发明还要求保护前文第一方面中所述的蛋白质在作为甾体激素类物质11位和/或14位羟基化酶中的应用。其中，所述甾体激素类物质可为能够被甾类11β-羟化酶催化生成氢化可的松和/或能够被甾类14α-羟化酶催化生成14α-羟化皮质醇的物质，具体如7α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(或称为氢化可的松21-醋酸酯，cortexolone-21-acetate,rsa)或11-脱氧皮质醇(11-deoxycortisol，rs)。第七方面，本发明要求保护一种制备氢化可的松和/或14α-羟化皮质醇的方法。本发明所提供的制备氢化可的松和/或14α-羟化皮质醇的方法，可为全细胞催化法或酶法。其中，所述全细胞催化法可包括如下步骤：对前文第五方面中所述的工程菌进行发酵培养，收集菌体后加入底物，进行催化反应，反应产物中即含有氢化可的松和/或14α-羟化皮质醇；所述底物为能够被甾类11β-羟化酶催化生成氢化可的松和/或能够被甾类14α-羟化酶催化生成14α-羟化皮质醇的物质。其中，所述酶法可包括如下步骤：从前文第五方面中所述的工程菌中提取具有甾类11β-羟化酶和/或14α-羟化酶活性的物质，然后以粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶的形式催化底物生成氢化可的松和/或14α-羟化皮质醇；所述底物为能够被甾类11β-羟化酶催化生成氢化可的松和/或能够被甾类14α-羟化酶催化生成14α-羟化皮质醇的物质。进一步地，所述底物具体可为17α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(或称为去氧氢化可的松21-醋酸酯，cortexolone-21-acetate,rsa)或11-脱氧皮质醇(11-deoxycortisol，rs)。在本发明具体实施方式中，具体是采用的全细胞催化法。其中，所述催化反应的条件具体为30℃200-250rpm(如250rpm)振荡培养1-4天(如2天)；反应体系中的底物为rsa，其浓度为10mg-200mg(如170mg/l)。实验证明，本发明在异源微生物中表达cl3-cyp021蛋白进行氢化可的松和/或14α-羟化皮质醇的催化合成。本发明为应用更具有食品安全性的酵母菌催化生产氢化可的松提供可能性，相比于传统的丝状真菌生产方式有效的缩短了生产周期，简化了发酵设备，并且能够进行单一蛋白的表达提高了产物转化率，有效的降低了生产和提取成本，对于氢化可的松生产技术革新具有重要意义具有重要意义，并且也为生物催化合成14α-羟化皮质醇提供可能性。附图说明图1为氢化可的松的结构式。图2为氢化可的松生产工艺。图3为酿酒酵母工程菌hc101催化产物检测及鉴定。图4为酿酒酵母工程菌hc102催化产物检测及鉴定(1)。图5为酿酒酵母工程菌hc102催化产物检测及鉴定(2)。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。新月弯胞霉as3.4381(atcc12017)：北纳生物产品。prs426质粒：上海北诺生物有限公司，货号为addgene0499。m2质粒：在peasy-blunt-simple载体(全式金生物有限公司)的多克隆位点按顺序插入了sexa1酶切位点，ppgk启动子，绿色荧光蛋白(gfp)基因，以及终止子adh1t和asc1酶切位点。m3质粒：在peasy-blunt-simple载体(全式金生物有限公司)的多克隆位点按顺序插入了sexa1酶切位点，ptef启动子，绿色荧光蛋白(gfp)基因，以及终止子cyc1t和asc1酶切位点。酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)by4742：thermofisher公司产品。解脂耶氏酵母(cicc32520)：中国工业微生物菌种保藏管理中心(cicc)产品。粟酒裂殖酵母(cicc1762)：中国工业微生物菌种保藏管理中心(cicc)产品。毕赤酵母(gs115)：优宝生物产品，产品编号：st1030。实施例1、新月弯胞霉11位β-羟基化酶的克隆表达基因的克隆表达分为以下3步：1、新月弯胞霉总rna的提取首先，将新月弯胞霉as3.4381(atcc12017)在平板上培养数天，并收取一定数目的孢子接入到50ml马铃薯-葡萄糖(pda)培养基中，过夜培养至合成大量菌体；随后，离心收集新月弯胞霉菌丝体，使用磷酸钾盐缓冲液(pbs)进行洗涤，最后用50ml缓冲液重悬并加入终浓度为170mg/l的底物氢化可的松21-醋酸酯(rsa)诱导2h，取样进行rna提取。rna提取方法：(1)2.0ml螺帽管(rnasefree)中加入0.5mm的研磨珠(填满锥形管底)以及1mltrizol，之后加入液氮速冻过的菌丝块(约100mg)。(2)使用珠磨机(beadbeater)最大转速30s，重复两次。(3)室温温和的摇动5min，去除附着的核小体。(4)加入0.2ml的氯仿，最大转速珠磨15s。(5)室温温和的摇动2min。(6)4℃下12000g离心15min，取上清液(约0.5ml)至新的ep管(rnasefree)中。(7)加入等体积(0.5ml)的异丙醇，充分混匀。(8)室温温和的摇动10min，此时可见白色沉淀。(9)4℃下12000g离心10min，去上清。(10)1mldepc水配置的75％酒精洗涤沉淀，4℃下7500g离心5min，充分去除上清。(11)室温放置约15-20min除去乙醇，晾置过久rna会变得难溶。(12)加入50μldepc水，60℃水浴10min助溶。(13)nanodrop测定rna浓度和纯度。通常纯度较好的rna样品a260/a280比值在1.9～2.0之间，a260/a230通常大于2。2、反转录pcr与基因扩增第一链反转录-pcr：取无rna酶pcr管，按thermo反转录试剂盒扩增得到cdna。具体操作步骤如下：模板总rna3μl，oligo(dt)18引物1μl，10mmdntpmix1μl，rnase-free水10μl。瞬间离心，pcr65℃5min，冰上急冷；再加入以下体系中反应液：5×rtbuffer4μl，maximahminusenzymemix1μl，瞬间离心，pcr仪中进行反应50℃50min，85℃5min，4℃保温。pcr扩增：反转录所得cdna为模板，用下述引物扩增到目的基因，扩增体系为takarahsdna聚合酶5×buffer10μl，dntpmix4μl，引物(见表1)各1μl，cdna，模板0.5μl，primerstarhs聚合酶(2.5u/μl)0.5μl，补加蒸馏水至总体积50μl。扩增条件为98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、56℃退火15秒、72℃延伸2分钟(30个循环)；72℃延伸8分钟(1个循环)。所得扩增产物命名为cl3-cyp021，cl3-cpr。将得到的pcr扩增产物用上海生工生物工程有限公司的pcr产物纯化试剂盒纯化，纯化后用thermo公司的sexa1与asc1酶切dna片段，胶回收产物备用。表1cl3-cyp021和cl3-cpr基因扩增引物引物名称序列(5’-3’)cl3-cyp021-sexa1-fgcgaccaggtatggatccccagactgtcgggctcl3-cyp021-asc1-rggcgcgccctacactaccactctcttgaaacl3-cpr-sexa1-fgcgaccaggtatggcacaactcgacacgctcgacl3-cpr-asc1-rggcgcgcctcatgaccagacgtcttcctggtcl3-cyp021基因(野生型)序列如seqidno.5所示，编码seqidno.1所示的蛋白质(命名为cl3-cyp021蛋白)；cl3-cpr基因(野生型)序列如seqidno.6所示，编码seqidno.2所示的蛋白质(命名为cl3-cpr蛋白)。3、构建基因表达质粒用thermo公司sexa1和asc1酶切质粒prs426，酶切产物胶回收备用。与上述所得cl3-cyp021基因片段各50ng加入连接体系：5μl2×quickligationbuffer(neb公司)、0.5μlquickligase(neb公司，400,000cohesiveendunits/ml)，补充蒸馏水至10μl，室温反应10min得到连接产物，转入trans1-t1感受态细胞中冰浴30分钟，42℃热激30秒，立即至于冰上2分钟。加入800μllb培养基，250rpm，37℃孵育1小时，菌液涂在含有氨苄青霉素的lb平板上，过夜培养后，pcr筛选5个阳性单菌落，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体prs426上插入目的片段，得到质粒prs426-cl3-cyp021。4、构建酵母多基因整合片段用thermo公司sexa1和asc1酶切质粒m2，m3，酶切产物胶回收备用。与上述所得cl3-cpr，cl3-cyp021基因片段进行连接转化(方法同步骤3)，并挑选克隆测序验证，得到质粒m2-cl3-cpr，m3-cl3-cyp021。以构建好的质粒m2-cl3-cpr为模板使用引物1-m-peasy-pgk1-f和1-m-adht-tef1-r(见表2)进行pcr扩增(方法同步骤2)，获得ppgk-cl3-cpr-adh1t片段(seqidno.7)，该片段包含pgk启动子(seqidno.7的第63-812位)，新月弯孢霉来源的cl3-cpr基因(seqidno.7的第813-2903位)以及adh1终止子(seqidno.7的第2904-3061位)。以构建好的质粒m3-cl3-cyp021为模板使用引物2-m-adht-tef1-f和m-cyc1t-peasy-r(见表2)进行pcr扩增(方法同步骤2)，获得ptef-cl3-cyp021-cyc1t片段(seqidno.8)，该片段包含tef启动子(seqidno.8的第1-450位)，新月弯孢霉来源的cl3-cyp021基因(seqidno.8的第451-1971位)以及cyc1终止子(seqidno.8的第1972-2278位)。对扩增获得的目的片段进行胶回收处理备用。表2cl3-cyp021和cl3-cpr基因整合片段扩增引物实施例2、酿酒酵母工程菌hc101的构建出发菌酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)by4742于筛选培养基中过夜培养。液体筛选培养基组成如下：sd-trp(北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司)，2％葡萄糖，0.005％his.，0.01％leu.，0.01％ura.(各百分号均表示g/100ml)。取1ml(od约0.6-1.0)分装到1.5mlep管中，4℃、10000g离心1min，弃上清，沉淀用无菌水(4℃)洗涤，同样条件下离心，弃上清。菌体加入1ml处理液(10mmliac；10mmdtt；0.6m山梨醇；10mmtris-hcl(ph7.5)，处理液使用时才加dtt)，25℃下放置20min。离心，弃上清，菌体中加入1ml1m山梨醇(0.22μm水系膜过膜除菌)重悬，离心，弃上清(用1m山梨醇重悬二次)，到最终体积约为90μl。加入实施例1获得的表达质粒prs426-cl3-cyp0211.5μl，混匀后转移至电转杯中，2.7kv电击5.7ms，加入1ml1m山梨醇，30℃复苏1h，涂布于固体筛选培养基(配方：固体酵母筛选培养基sd-ura-trp，2％葡萄糖，0.005％his，0.01％leu，1.5％琼脂；各百分号均表示g/100ml)。筛选培养的条件为：30℃，培养36h以上。pcr鉴定出正确的阳性克隆，命名为菌株hc101。实施例3、酿酒酵母工程菌hc101催化合成氢化可的松和14α-羟化皮质醇摇瓶发酵催化：在固体选择培养基(配方：固体酵母筛选培养基sd-ura-trp，2％葡萄糖，0.005％his，0.01％leu，1.5％琼脂；各百分号均表示g/100ml)中活化hc101酵母菌株，于相应液体选择培养基(配方：液体酵母筛选培养基sd-ura-trp，2％葡萄糖，0.005％his，0.01％leu；各百分号均表示g/100ml)中制备种子液(30℃，250rpm，16h)，以1ml的接种量分别接种于3瓶含100mlypd液体培养基的500ml三角瓶中，30℃，250rpm振荡培养2天，5000rpm收集酵母细胞，并用pbs缓冲液洗涤最终重悬于含有30mlpbs的250ml三角瓶中，加入终浓度为170mg/l的底物rsa，进行催化反应，30℃，250rpm振荡培养2天。取5ml的催化反应液于分液漏斗中，加入等体积的萃取剂1ml(甲醇：氯仿＝1:9，体积比)，取下层有机相4ml，装入10ml离心管中干燥，用1ml甲醇溶液进行复溶，离心取上清过0.22μm有机滤膜至液相瓶中进行hplc检测。通过安捷伦1260高效液相色谱仪(hplc)分析产物，发现有两种新物质的生成(见图3)，并且两种产物与新月弯孢霉催化发酵获得的产物完全一致，推测这两种产物分别为氢化可的松和14位α羟基化产物14α-羟化皮质醇，并预测cl3-cyp021为催化甾体激素类物质进行11位β羟基化和14位α羟基化的p450蛋白。实施例4、酿酒酵母工程菌hc102的构建出发菌酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)by4742于筛选培养基中过夜培养。筛选培养基组成如下：sd-trp(北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司)，2％葡萄糖，0.005％his.，0.01％leu.，0.01％ura.(各百分号均表示g/100ml)。取1ml(od约0.6-1.0)分装到1.5mlep管中，4℃、10000g离心1min，弃上清，沉淀用无菌水(4℃)洗涤，同样条件下离心，弃上清。菌体加入1ml处理液(10mmliac；10mmdtt；0.6m山梨醇；10mmtris-hcl(ph7.5)，处理液使用时才加dtt)，25℃下放置20min。离心，弃上清，菌体中加入1ml1m山梨醇(0.22μm水系膜过膜除菌)重悬，离心，弃上清(用1m山梨醇重悬二次)，到最终体积约为90μl。分别加入实施例1获得的片段ppgk-cl3-cpr-adht，ptef-cl3-cyp021-cyc1t以及同源臂marker片段gal7-ura3-up(seqidno.9；该同源臂片段包含gal7位点上游400bp同源区域，ura3marker基因，以及pgk启动子400bp同源区域)，gal7-ura3-down(seqidno.10；该同源臂片段包含cyc1终止子200bp同源区域，以及gal7位点下游300bp同源区域)(实现将cl3-cpr，cl3-cyp021基因片段整合于酿酒酵母by4742的gal7位点)各1μl，混匀后转移至电转杯中，2.7kv电击5.6ms，加入1ml1m山梨醇，30℃复苏1h，涂布于固体选择培养基平板(配方：固体酵母筛选培养基sd-ura-trp，2％葡萄糖，0.005％his，0.01％leu，1.5％琼脂；各百分号均表示g/100ml)。筛选培养的条件为：30℃，培养36h以上。pcr鉴定出正确的阳性克隆，命名为菌株hc102。实施例5、酿酒酵母工程菌hc102催化合成氢化可的松和14α-羟化皮质醇(全细胞催化法)摇瓶发酵催化：在固体选择培养基(同实施例3)中活化hc002酵母菌株，于相应液体选择培养基(同实施例3)中制备种子液(30℃，250rpm，16h)，以1ml的接种量分别接种于3瓶含100mlypd液体培养基的500ml三角瓶中，30℃，250rpm振荡培养2天，5000rpm收集酵母细胞，并用pbs缓冲液洗涤最终重悬于含有30mlpbs的250ml三角瓶中，使菌体od600nm达到60，加入终浓度为170mg/l的底物rsa，进行催化反应，30℃，250rpm振荡培养2天，得催化反应液。取5ml的催化反应液于分液漏斗中，加入等体积的萃取剂1ml(甲醇：氯仿＝1:9，体积比)，取下层有机相4ml，装入10ml离心管中干燥，用1ml甲醇溶液进行复溶，离心取上清过0.22μm有机滤膜至液相瓶中进行hplc检测。通过安捷伦1260高效液相色谱仪(hplc)分析产物。通过hplc鉴定与标品对比，确认构建的酿酒酵母菌株hc102可以催化底物rsa合成两种物质，一种可以确认为氢化可的松(经标准品比对确认)，另一种可以确认为14位α羟基化产物14α-羟化皮质醇(见图4和图5)，并且从峰面积计算其产量高于hc101菌株，所以推测从新月弯孢霉中鉴定并克隆出的cpr基因对于酿酒酵母氢化可的松的生产有帮助。随后，对hc102菌株的生产结果进行了定量分析，通过定量分析菌株hc102可以通过全细胞催化的方式获得目标产物氢化可的松1.97mg/l。相较于使用酿酒酵母hc101菌株产量提高2倍，结果表明新月弯孢霉中克隆的cpr基因对于酿酒酵母氢化可的松的生产有帮助。表3菌株hc101与hc102催化产物定量分析菌株名基因型氢化可的松(mg/l)hc101by4742,prs426-cl3-cyp0210.602±0.08hc102by4742,gal7::ura3-ppgk-cl3-cpr+ptef-cl3-cyp0211.97±0.21注：氢化可的松的单位mg/l的含义是每升催化反应液中氢化可的松的mg数。实施例6、酿酒酵母工程菌hc103的构建与催化合成氢化可的松和14α-羟化皮质醇1、酿酒酵母工程菌hc103的构建对cl3-cyp021和cl3-cpr蛋白进行密码子优化，该优化与基因合成工作工作委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成，获得的优化后的基因命名为cl3-cyp021-sy-sc，cl3-cpr-sy-sc。cl3-cyp021-sy-sc基因的序列如seqidno.3所示，编码seqidno.1所示的蛋白质；cl3-cpr-sy-sc基因的序列如seqidno.4所示，编码seqidno.2所示的蛋白质。对获得的基因按照实施例1步骤4中的方法构建酿酒酵母多基因整合片段，随后按照实施例4中的方法将上述两个基因整合于酿酒酵母by4742的gal7位点，最终获得菌株hc103。2、酿酒酵母工程菌hc103催化合成氢化可的松和14α-羟化皮质醇(全细胞催化法)对构建的酿酒酵母菌株hc103进行催化合成氢化可的松，催化实验和样品检测方法同实施例5，通过催化发酵，hc103菌株可以合成3.87mg/l的氢化可的松和2.43mg/l的14α-羟化皮质醇，发酵结果见表4，通过密码子优化，进一步提高了酿酒酵母利用新月弯孢霉的11位β羟基化p450蛋白进行催化发酵生产氢化可的松的产量。表4菌株hc103催化产物定量分析注：氢化可的松和14α-羟化皮质醇的单位mg/l的含义是每升催化反应液中氢化可的松或14α-羟化皮质醇的mg数。3、利用酿酒酵母工程菌hc103以粗酶液或纯酶法催化合成氢化可的松和14α-羟化皮质醇第一步：蛋白的提取(下述反应都在4℃冰上进行)(1)发酵培养，200ml对应的选择培养基，发酵48h后收集菌体，od600nm为4.0左右；(2)菌体收集(5000rpm离心5min，弃上清)，细胞破碎(应用液氮研磨菌体破碎细胞，磨三次，将研磨好的粗蛋白用1mlph7.25的磷酸盐缓冲液重悬，并置于冰上)作为粗酶液备后续使用；(3)如需纯化蛋白则要增加微粒体提取过程，过程如下：a、将重悬好的酵母粗酶液以7000g离心10min，收集上清，然后沉淀用5mltes-bbuffer(表6)洗一次，重复上述步骤一次；b、将收集的上清分装在超速离心管中，超速离心25000g/10min；c、取离心后的上清，在分装在超速离心管中100000g离心1h；d、吸净上清，获得的沉淀用tegbuffer(表5)1-2ml重悬，若重悬效果不好，可以去冰水浴中超声，作为纯酶液备后续使用。表5tes-b缓冲液和teg缓冲液配方:tes-b终浓度teg终浓度tris-hclph7.450mmoltris-hclph7.450mmoledta1mmoledta1mmolsorbitol600mmolglycerol20/30％bsa10g/l水β-巯基乙醇1.5mmol水第二步：催化反应合成hc粗酶液或纯酶催化合成hc：催化体系总体积2ml(表6)；反应在30℃进行，摇床上70rpm缓慢摇，以nadph的加入起始反应，相应萃取剂甲醇氯仿的加入终止反应，得到催化反应液。表6粗酶液或纯酶催化合成hc的催化体系催化体系终浓度rsa0.2μmol磷酸盐缓冲液ph7.25100mmolnadph1mmol粗酶液或纯酶第三步：催化产物萃取及检测取2ml的催化反应液于分液漏斗中，加入等体积的萃取剂(甲醇：氯仿＝1:9，体积比)，取下层有机相2ml，装入5ml离心管中干燥，用1ml甲醇溶液进行复溶，离心取上清过0.22μm有机滤膜至液相瓶中进行hplc检测。通过安捷伦1260高效液相色谱仪(hplc)分析产物。结果显示：通过上述在工程菌hc103中提取蛋白粗酶液或者纯酶并进行催化反应，同样在产物中成功检测到了氢化可的松和14α-羟化皮质醇两种产物，所以证明粗酶液或纯酶也可以进行催化生产hc和14α-羟化皮质醇。实施例7、应用新月弯孢霉的11位β羟基化p450蛋白在其他酵母菌中合成氢化可的松和14α-羟化皮质醇本发明成功在解脂耶氏酵母(po1g)，粟酒裂殖酵母(cicc1762)，以及毕赤酵母(gs115)中表达了来自新月弯孢霉的cl3-cpr，cl3-cyp021基因，对获得的菌株(见表7)以脱氧皮质醇(rs)为底物进行催化反应(同实施例5)，也成功合成出了氢化可的松及其副产物14α-羟化皮质醇。表7其他酵母菌中发酵催化合成氢化可的松的产量菌株名基因型氢化可的松(mg/l)14α-羟化皮质醇(mg/l)hc151cicc32520，pina1269-cl3-cpr+cl3-cyp0211.03±0.110.61±0.06hc152cicc1702，pcad1-cl3-cpr+cl3-cyp0211.06±0.180.64±0.08hc153gs115，ppic3.5k-cl3-cpr+cl3-cyp0211.26±0.140.75±0.06实施例8、酿酒酵母工程菌hc111-hc115的构建与催化合成氢化可的松和14-α羟化皮质醇为了进一步提高氢化可的松的产量，我们将新月弯孢霉中挖掘到的cl3-cpr和cl3-cyp021整合于酿酒酵母by4742的多拷贝位点rdna位点。出发菌酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)by4742于筛选培养基中过夜培养。筛选培养基组成如下：sd-trp(北京泛基诺(功能基因组)科技有限公司)，2％葡萄糖，0.005％his.，0.01％leu.，0.01％ura.(各百分号均表示g/100ml)。取1ml(od约0.6-1.0)分装到1.5mlep管中，4℃、10000g离心1min，弃上清，沉淀用无菌水(4℃)洗涤，同样条件下离心，弃上清。菌体加入1ml处理液(10mmliac；10mmdtt；0.6m山梨醇；10mmtris-hcl(ph7.5)，处理液使用时才加dtt)，25℃下放置20min。离心，弃上清，菌体中加入1ml1m山梨醇(0.22μm水系膜过膜除菌)重悬，离心，弃上清(用1m山梨醇重悬二次)，到最终体积约为90μl。分别加入实施例1获得的片段ppgk-cl3-cpr-adht，ptef-cl3-cyp021-cyc1t以及同源臂marker片段rdna-leu-up(seqidno.11；该同源臂片段包含rdna位点上游约500bp同源区域，leumarker基因，以及pgk启动子400bp同源区域)，rdna-leu-down(seqidno.12；该同源臂片段包含cyc1终止子200bp同源区域，以及rdna位点下游约500bp同源区域)(实现将cl3-cpr，cl3-cyp021基因片段整合于酿酒酵母by4742的rdna位点)各1μl，混匀后转移至电转杯中，2.7kv电击5.6ms，加入1ml1m山梨醇，30℃复苏1h，涂布于固体选择培养基平板(配方：固体酵母筛选培养基sd-leu-trp，2％葡萄糖，0.005％his，0.01％ura，1.5％琼脂；各百分号均表示g/100ml)。筛选培养的条件为：30℃，培养36h以上。pcr鉴定出正确的阳性克隆，随机挑选五个克隆，分别命名为菌株hc111、hc112、hc113、hc114、hc115。其中产量最高的菌株hc113的氢化可的松产量可以达到6.42mg/l、14-α羟化皮质醇产量可以达到4.06mg/l。<110>中国科学院天津工业生物技术研究所<120>新月弯胞霉中甾类11β-羟化酶及其编码基因与应用<130>gncln181613<160>12<170>patentinversion3.5<210>1<211>506<212>prt<213>curvularialunata<400>1metaspproglnthrvalglyleuvalvalargalaleuglnthrthr151015alailealaalavalleuleualavaltrpthrtyrvalprolysleu202530glnleuasnalaglnleuarglysleuproserleuthrproglugly354045thrthrlysalaargasplysphemetalaseralaarglysleutyr505560glnaspglytyrhislyspheargaspseralatyrthrleuileasn65707580gluasnglyasnalaasnvalilevalproproglnpheleuproglu859095leuargglnleuproaspaspvalleuserpheproglualaleuthr100105110gluaspleugluilelystyrthrhisleuserilegluasnprothr115120125alaalaglyleuilelyslyslysleuthrproalaleuproargleu130135140asnproserilecysglnaspvalaspargalavallysthrtyrmet145150155160proprocysaspasptrpthrgluvalasnileasnglulysleuleu165170175argilevalalalysvalserglythrilephevalglyprogluleu180185190alaseraspserasptyrleuaspalaalacysphetyrthrvalasp195200205leumetasnalavalthralametlyslysileargprotrpleulys210215220propheleualaserargthrprogluileilealaleuargalaarg225230235240glulyshisthrgluargvalleuileproilevalgluglnargile245250255alaalalysalaasnaspproasntrpglngluproaspasppheleu260265270glntrpmetleuaspmetarggluglythrgluserileglngluleu275280285alalysthrglnleuserleuilephealaalailehisthrthrthr290295300metthrvalthrasnthrmettyrthrleualaalametproglutyr305310315320leugluproleuargglugluileargasnvalmetleuaspglugly325330335glyvalilethrserargalaleuglnargmetglulysleuaspser340345350tyrmetlysgluvalleuargphethrglyprothrmetthrserphe355360365thrargargalaarglysglyilethrleuserasnglyglntyrile370375380proalaglyvalileilegluvalproseralaalailetyrglnasp385390395400asnalaphetyrproserseraspserpheaspglypheargalatyr405410415lysalaargserthrglylysalaalaaspilealaargasnglnphe420425430valthrserasnglugluasnleuthrpheglytyrglyarghisala435440445cysproglyargphephealaalaasngluilelysmetmetilethr450455460argleuileleuasptyraspilelysmetproasnglyglulysglu465470475480argtyrproglnilegluileglylysmetserileproaspprothr485490495lysthrleualaphelysargvalvalval500505<210>2<211>696<212>prt<213>curvularialunata<400>2metalaglnleuaspthrleuaspileilevalleualavalleuleu151015valglythrvalalatyrphethrlysglythrtyrtrpalavalser202530alaaspprotyrglyserserleualathralaasnglyalaalalys354045alaglylysserargasnileileglulysmetaspgluthrasplys505560asncysvalvalphetyrglyserglnthrglythralagluasptyr65707580alaserargileserlysgluglyhisserargpheglyleulysthr859095metvalalaaspleugluglutyrasptyraspasnleuaspalaphe100105110progluasplysleualavalphevalleualathrtyrglyglugly115120125gluprothraspasnalavalgluphetyrglupheileglyserglu130135140aspileserpheserglnglyglyglyileaspasplysproleuser145150155160asnleuasntyrvalthrpheglyleuglyasnasnthrtyrgluhis165170175tyrasnsermetvalargasnvalasplystyrleuthrargleugly180185190alalysargleuglyalaalaglygluglyaspaspglyalaglythr195200205metglugluasppheleualatrplysglupromettrpalaalaval210215220alaglulysmetglyleuglugluargglualamettyrgluproval225230235240phegluvalthrglulysprogluleuserprogluaspaspthrval245250255tyrleuglygluproasnlysasnhisleugluglyasnglnlysgly260265270propheasnalaasnasnpropheilealaproilevalgluserala275280285gluleuphelysas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