一种抗高温胁迫的重组耻垢分枝杆菌的构建方法与流程

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种抗高温胁迫的重组耻垢分枝杆菌的构建方法。

背景技术

1884年由lustgarten首次报道了耻垢分枝杆菌，随后alvarez和tavel在生殖器分泌物(smegma，包皮垢)中也发现了该菌，因此被命名为耻垢分枝杆菌(mycobacteriumsmegmatis)。耻垢分枝杆菌属于放线菌属，也常见于土壤、海洋和淡水环境中。

耻垢分枝杆菌是一种非致病性微生物，与引起结核病的致病菌结核分枝杆菌共有超过2000个同源基因，并具有结核分枝杆菌和其他分枝杆菌相同的细胞壁结构。耻垢分枝杆菌容易在大多数合成或复杂的实验室培养基中培养，3至5天可以形成可见的菌落。而结核分枝杆菌需要数星期才能形成可见菌落，并且常规实验室的防护措施无法保障实验人员的安全，需要较高安全等级的实验室才能进行相关实验内容。上述特性使得耻垢分枝杆菌成为研究致病性分枝杆菌的模式菌株。

耻垢分枝杆菌作为宿主菌表达特定基因的常见用途有：(1)研究特定基因在分枝杆菌生理活动中的功能，例如zhou等人(discoveryandcharacterizationofkuacetylationinmycobacteriumsmegmatis，femsmicrobiologyletters，2015.362(6)，fnu051)利用分枝杆菌-大肠杆菌穿梭质粒携带ku基因在耻垢分枝杆菌mycobacteriumsmegmatismc²155中进行表达，研究ku蛋白的翻译后修饰功能；(2)构建抗结核新型疫苗，例如徐志凯等人(发明专利授权号cn101875913b，专利名称为“可表达结核分枝杆菌ag85b和esat-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌株及其应用”)构建了表达结核分枝杆菌ag85b和esat-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌菌株，应用于结核病预防和治疗；(3)作为微生物反应器，例如张建华等人(发明专利授权号cn102586161b，专利名称为“耻垢分枝杆菌il-17a及其制备方法”)设计了表达il-17a基因的耻垢分枝杆菌，用于预防和控制过敏性哮喘或呼吸道感染导致的哮喘气道损伤。

hsp60启动子是耻垢分枝杆菌表达体系最常用的启动子之一。charleskendallstover等人(newuseofbcgforrecombinantvaccines，nature，1991.351(6326):456-60)利用hsp60启动子表达lacz基因，lacz蛋白达到分枝杆菌总蛋白量的10％以上。dbyoung等人(heatshockproteinsandantigensofmycobacteriumtuberculosis，infectimmun，1991.59(9):3086–3093)测定了结核分枝杆菌在不同温度培养时，在自身启动子的作用下hsp60蛋白的表达量，发现hsp60蛋白在37℃时占总蛋白的比例小于10％，而在42℃时达到总蛋白的15％。但是周盈等人(乙酰化修饰降低ku蛋白的dna结合活性，微生物学报，网络出版时间：2017-09-21)发现耻垢分枝杆菌在平板上生长，42℃培养产生的菌落数量比37℃时的菌落数量低10⁴倍。提高培养温度不利于耻垢分枝杆菌的生长以及hsp60启动子需要提高培养温度来提高表达活性，对于利用耻垢分枝杆菌为宿主菌表达特定基因，是一对相互矛盾的重要参数，目前尚未得到解决。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种抗高温胁迫的重组耻垢分枝杆菌的构建方法，其构建获得的重组耻垢分枝杆菌作为宿主表达特定基因时，能够兼顾细菌生长和hsp60启动子活性。

本发明所采取的技术方案是：一种抗高温胁迫的重组耻垢分枝杆菌的构建方法，其包括导入htpg基因片段，使其重组耻垢分枝杆菌具有表达htpg蛋白的功能。

作为上述方案的进一步改进，所述htpg基因片段如下a)或b)序列：

a)序列表中的seqid№.1所示的核苷酸序列；

b)将序列表中的seqid№.1的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与seqid№.1所示具有相同功能及其衍生的基因片段。

作为上述方案的进一步改进，该重组耻垢分枝杆菌的构建方法包括如下操作步骤：

制备耻垢分枝杆菌感受态，加入htpg表达质粒进行电转入，获得能表达htpg蛋白的重组耻垢分枝杆菌。

作为上述方案的进一步改进，所述电转入的电转化仪器参数为2.5kv、25μf、1000ω。

作为上述方案的进一步改进，所述htpg表达质粒的获取方法如下：

1)以结核分枝杆菌的基因组dna为模板，通过如序列表中的seqid№.2所示的正向引物和如序列表中的seqid№.3所示的反向引物进行pcr扩增，获得htpg基因片段；

2)通过ecorⅰ、hindⅲ和t4连接酶将步骤1)所得htpg基因片段连到pmv261载体，获得htpg表达质粒pmv261-htpg。

本发明还提供一种抗高温胁迫的重组耻垢分枝杆菌，其由上所述的构建方法获得。

本发明的有益效果是：

本发明通过向耻垢分枝杆菌中导入htpg基因片段获得抗高温胁迫的重组耻垢分枝杆菌，解决了耻垢分枝杆菌表达体系中hsp60启动子需要高温来提高表达活性和高温不利于耻垢分枝杆菌生长的问题。本发明对以耻垢分枝杆菌作为宿主菌表达特定基因的分枝杆菌分子生物学研究、抗结核新疫苗、微生物反应器研发具有重要参考价值。

附图说明

图1是实施例1中pcr验证htpg基因成功导入耻垢分枝杆菌的结果图；

图2是实施例2中htpg增加耻垢分枝杆菌在高温胁迫条件下的生存能力结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行具体描述，以便于所属技术领域的人员对本发明的理解。有必要在此特别指出的是，实施例只是用于对本发明做进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术熟练人员，根据上述发明内容对本发明作出的非本质性的改进和调整，应仍属于本发明的保护范围。同时下述所提及的原料未详细说明的，均为市售产品；未详细提及的工艺步骤或制备方法为均为本领域技术人员所知晓的工艺步骤或制备方法。

实施例1：利用分枝杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pmv261表达htpg蛋白

(一)构建htpg表达质粒

以结核分枝杆菌mycobacteriumtuberculosish37rv的基因组dna为模板，通过正向引物(序列表中的seqid№.2所示)和反向引物(序列表中的seqid№.3所示)进行pcr扩增，获得htpg基因片段，通过neb公司的ecorⅰ、hindⅲ和t4连接酶将htpg基因片段连到pmv261载体(newuseofbcgforrecombinantvaccines，nature，1991.351(6326):456-60；公众可从佛山科学技术学院获得)，获得htpg表达质粒pmv261-htpg。

(二)htpg表达质粒导入耻垢分枝杆菌

1)mycobacteriumsmegmatismc²155是来源于耻垢分枝杆菌mycobacteriumsmegmatisatcc607的突变菌株，具有较高的转化效率，是分子遗传操作中最常见的耻垢分枝杆菌菌株。以耻垢分枝杆菌mycobacteriumsmegmatismc²155菌株为例，在含有0.5％甘油和0.05％吐温80的lb液体培养基中37℃振荡培养耻垢分枝杆菌3天，1％转接新鲜培养基，37℃振荡培养至对数期(od600约为0.5)，收集菌体，10％无菌甘油(去离子水配置)清洗菌体3次制备电转感受态；

2)取感受态400μl分别加入质粒pmv261-htpg和pmv261，转移至电转杯(孔径2mm)，设置电转化仪参数为2.5kv、25μf、1000ω，电击完成后加入800μl新鲜培养基，37℃振荡培养4小时使细菌复苏；

3)将复苏的细菌全部涂布含有抗生素kan30μg/ml的lb固体培养基，37℃静置培养3天，得到重组耻垢分枝杆菌pmv261-htpg/mc²155和pmv261/mc²155。

4)挑取重组耻垢分枝杆菌pmv261-htpg/mc²155和pmv261/mc²155单菌落，接种含有抗生素kan30μg/ml、0.5％甘油和0.05％吐温80的lb液体培养基，37℃振荡培养3天，吸取50μl菌液离心沉淀菌体；10μl去离子水重悬菌体，95℃加热10min，离心取上清进行pcr反应，验证htpg基因片段是否成功导入耻垢分枝杆菌，其验证结果图如图1所示，其中1.质粒pmv261-htpg为模板、2～4.3个pmv261-htpg/mc²155单菌落为模板、5～7.3个pmv261/mc²155单菌落为模板、m.marker(2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。pcr反应体系中的引物为构建htpg表达质粒使用的正向引物(序列表中的seqid№.2所示)和反向引物(序列表中的seqid№.3所示)，pcr反应的程序设置为预变性98℃2min，扩增35个循环(98℃10s，53℃10s，72℃1min)，再扩增72℃1min。

实施例2：检测htpg蛋白对耻垢分枝杆菌在高温胁迫条件下的生存能力影响

(1)重组耻垢分枝杆菌pmv261-htpg/mc²155和对照菌pmv261/mc²155分别划线含有抗生素kan30μg/ml的lb固体培养基，37℃静置培养3天，每种菌株挑取3个不同的单菌落接种含有抗生素kan30μg/ml、0.5％甘油和0.05％吐温80的lb液体培养基，37℃振荡培养。

(2)上述6个单菌落生长到对数生长期(od600约为0.5)，分别用含有0.5％甘油和0.05％吐温80的lb液体培养基进行梯度稀释(10-¹至10-⁵)，具体稀释度布局如下表1所示。

表1稀释度布局

(3)每个稀释度吸取5μl菌液滴至含有抗生素kan30μg/ml的lb固体培养基，吹干至培养基表面无液体。

(4)平板分别置于37℃和42℃培养箱，静置培养3～5天，观察并记录结果。

检测结果如图2所示：37℃培养的固体培养基上，重组耻垢分枝杆菌pmv261-htpg/mc²155和对照菌pmv261/mc²155各自的3个单菌落的菌数均达到10⁵以上，两种菌株之间无显著性差异；42℃培养的固体培养基上，重组耻垢分枝杆菌pmv261-htpg/mc²155的3个单菌落的菌数也达到了10⁵以上，而对照菌pmv261/mc²155的3个单菌落的菌数为10¹或者10²数量级，对照菌的菌数显著降低，说明htpg蛋白提高了耻垢分枝杆菌在高温胁迫条件下的生存能力。

上述实施例为本发明的优选实施例，凡与本发明类似的工艺及所作的等效变化，均应属于本发明的保护范畴。

sequencelisting

<110>佛山科学技术学院

<120>一种抗高温胁迫的重组耻垢分枝杆菌的构建方法

<130>2018.7.5

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1944

<212>dna

<213>m.tuberculosis

<400>1

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